UNIVERSIDAD DE CORDOBA

LABORATORIO DE BIOQUIMICA

TRANSPORTE DE CARGAS EN SISTEMAS BIOLOGICOS

OBJETIVOS:
1- Obtener un extracto de succinato deshidrogenada a partir de tejido heptico.
2- Identificar cualitativamente la actividad del succinato deshidrogenada mediante
el uso de un aceptor electrnico.
3- Observar el efecto inhibitorio del malonato sobre la actividad de la enzima
succinato deshidrogenada.

TEORIA RELACIONADA.
Las clulas de la gran mayoras de los organismos vivos llevan a cabo un conjunto de
reacciones de oxido reduccin mediante la cual la gran cantidad de energa liberada a
travs de la degradacin de molculas orgnicas es almacenada en molculas de alto
nivel energtico (ATP). La succinato deshidrogenada una enzima clasificada dentro del
grupo de las oxidorreductasas cataliza una reaccin muy importante en el metabolismo
oxidativo de la clula: la conversin del succinato en fumarato.
La succinato deshidrogenada remueve 2H+ y 2 electrones del succinato para formar
fumarato y la coenzima reducida (FADH2). La enzima esta sujeta a una poderosa
inhibicin competitiva por parte de reactivos como el malonato lo cual constituye una
manera de inhibir la actividad de la enzima a nivel de laboratorio. Para estudiar el
transporte de cargas en la reaccin se empleara un aceptor artificial de electrones (azul
de metileno), cuya decoloracin permite diferenciar la actividad enzimatica en los
ensayos a realizar en la presente prctica.

MATERIALES Y REACTIVOS.
Vasos de precipitado de 25y 400 ml
Mortero con maso
Termmetro
Pipetas de 5 ml (2)
Pipeta de 1 ml (1)
Gradilla para tubos de ensayo
Tubos de ensayo (3)

Tubos de centrifuga
Buffer fosfato 0.1M pH 7.4
Succinato de sodio 0.1M
Malonato de sodio 0.1M
Azul de metileno 0.1%
Aceite vegetal (traer)
Hgado y Hielo (traer de la casa)

PROCEDIMIENTO.
1- OBTENCIOPN DEL EXTRACTO ENZIMTICO
Tomar una muestra de aproximadamente 5g de hgado heptico libre de sangre y
colocarlos en un mortero con arena lavada, macere cuidadosamente hasta formar una
mezcla suave adicionando poco a poco tres porciones (cada una de 5ml) de buffer
fosfato0.1M Y pH 7.4. Transfiera la mezcla a un vaso de 25ml y mantngalo en un bao
con hielo durante 15min, mezclando ocasionalme. Pase la mezcla a tubos de centrifuga
y centrifugue a 1600rpm durante 10min. Transfiera el sobranadante a un vaso de 25ml y
marquelo como extracto enzimtico, mantngalo en bao de hielo hasta su posterior
uso.
2- SEGUIMIENTO DE LA REACCIN.
Preparar una serie de 3 tubos de ensayo debidamente rotulados, adicionar a cada tubo
(1,2 y 3) 0.5ml de azul de metileno al 0.1%, luego a los tubos 2 y 3 agregar 1 ml de
succinato de sodio 0.1M y solo al tubo 3 agrguele 1ml de malonato de sodio 0.1M.
Dejar los tubos en incubacin a 37C durante 10 min. (Manteniendo la temperatura
constante). Sin retirarlos del bao, agregar 1.5ml de extracto enzimtico a cada uno de
los tubos (1,2y 3), agite bien adicione 2ml de aceite vegetal a cada uno de los tubos.
Al cabo de 40 min observe el color de cada tubo, tenga en cuenta que el tubo 1 es el
control.
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS.
1234-

Escriba la reaccin mediante la cual el succinato se transforma en fumarato.

Que papel desempea el aceite vegetal en el experimento.
Que efecto tendra un exceso de succinato sobre la reaccin.
Que sustancias pueden inhibir la conversin de succinato en fumarato, en
adicin al malonato.
5- En que rutas esta metablicas esta involucrado el succinato.