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Enzimolog
Enzimolog

a Cl
a Cl

nica
nica
(Tema 17)
1. Los enzimas como catalizadores. 1. Los enzimas como catalizadores.
Estructura y naturaleza de los enzimas
Comportamiento cintico de los enzimas
2. 2.- - Medida de la actividad enzim Medida de la actividad enzim tica. tica.
Fundamento.
Factores que modifican la actividad enzimtica.
Medida de la actividad enzimtica de muestras clnicas
Instrumentacin. Optimizacin de las condiciones de medida.
Sistemas acoplados.
3. 3.- - Los enzimas como marcadores de lesi Los enzimas como marcadores de lesi n tisular. n tisular.
Enzimas como marcadores de dao celular
Distribucin tisular de los enzimas
Patrn isoenzimtico.
4. 4.- - Enzimas s Enzimas s ricos de importancia diagn ricos de importancia diagn stica cl stica cl nica. nica.
Transaminasas (ALT, AST)
Amilasa
Creatnfosfoquinasa(CPK)
Fosfatasacida (ACP)
Fosfatasaalcalina (ALP)
Gama glutamil transpeptidasa(GGT)
Lctico deshidrogenasa(LDH)
5-nucleotidasa(NTP)
Enzimolog Enzimolog a Cl a Cl nica.T nica.T- -17 17
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1. 1. Los enzimas como catalizadores. Los enzimas como catalizadores.
Naturaleza proteica de los enzimas
El que una reaccin discurra ms o
menos aprisa est en funcin no solo del
estado energtico de los compuestos
antes y despus sino tambin del propio
mecanismo de la reaccin.
Durante el curso de la reaccin es
necesaria la formacin de intermedios
reactivos cuyo nivel energtico es
superior a la energa media de las
molculas de los reactivos, lo que en la
prctica hace que la formacin de esos
intermediarios suponga una barrera
energtica que impide que la reaccin
avance.
Cuanto mayor es el nivel energtico
de los intermedios reactivos tanto
menor es la velocidad.
1. 1. Los enzimas como catalizadores. Los enzimas como catalizadores.
3
S P
[S]
[P]
T
T
La velocidad de una reaccin (S P) se define como:
v=-d[S]/dt =d[P]/dt
1.2 Velocidad de una reacci 1.2 Velocidad de una reacci n n
1.3 El Comportamiento cin 1.3 El Comportamiento cin tico de las tico de las
reacciones catalizadas por enzimas reacciones catalizadas por enzimas
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La velocidad de una reaccin catalizada por un enzima con cintica enzimtica michaeliana
es proporcional a la concentracin de substrato, pero es saturable y alcanza un mximo.
1.4 Velocidad de una reacci 1.4 Velocidad de una reacci n catalizada por un enzima. n catalizada por un enzima.
Reaccin no
enzimtica
Actividad de un enzima: moles transformados por unidad de tiempo. Se
expresa en Unidades Internacionales (molestransformados/seg).
Actividad especfica de un enzima: actividad enzimtica por masa de
enzima (moles/seg/mg protena)
Concentracin: cantidad de enzima por unidad de volumen, o en su defecto
cantidad de actividad enzimtica por unidad de volumen
Actividad Actividad y y cantidad cantidad de un enzima en una muestra. de un enzima en una muestra.
En bioqumica clnica se recurre a expresar la cantidad de enzima de una muestra en
forma de Unidades de actividad enzim Unidades de actividad enzim tica tica por ml por ml. .
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Fundamento.
Optimizacin de las condiciones de medida.
Medida de la actividad enzimtica de muestras clnicas
Instrumentacin.
Sistemas acoplados
2. 2.- - La medida de la La medida de la cantidad cantidad de un enzima en una muestra. de un enzima en una muestra.
2.1 Medida de la 2.1 Medida de la cantidad cantidad de enzima presente en una muestra: de enzima presente en una muestra:
Medida de la cantidad de enzima (protena) presente
en la muestra. Se utilizan mtodos inmunolgicos
Medida de la actividad cataltica correspondiente al
enzima presente en la muestra. Se utilizan mtodos
espectrofotomtricos
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2.1 Medida de la actividad enzim 2.1 Medida de la actividad enzim tica. tica.
La velocidad de una reaccin se puede
expresar bien como moles de substrato
consumidos, o bien como moles de producto
formado por unidad de tiempo:
v= [S]/ T = [P]/ T
La formacin de producto o desaparicin del
compuesto de partida puede monitorizarse
espectrofotomtricamente midiendo cambios
en la absorcin ptica de la solucin que
contiene los substratos y el enzima
S P
[S]
[P]
T
T
Color
Tiempo
1 Unidad de actividad 1 Unidad de actividad
enzim enzim tica tica se define
como aquella cantidad de
enzima capaz de
transformar 1 1 mol de mol de
substrato por minuto substrato por minuto.
Las condiciones experimentales para la
medida de la actividad enzimtica deben ser
tales que el grado de conversin de substratos
sea pequeo en trminos relativos, de manera
que su concentracin global apenas cambie.
Si la concentracin de substrato est por
encima de la Km (> 5x), el enzima estar
actuando a su velocidad mxima; aun
habindose consumido una fraccin del
substrato, la velocidad de reaccin del enzime
ver muy poco afectada.
Si las condiciones de velocidad mxima de la
reaccin se mantienen durante la duracin del
ensayo, existir una relacin lineal entre la
velocidad de reaccin y la actividad
enzimtica.
2.2 Medida de la actividad enzim 2.2 Medida de la actividad enzim tica... tica...
Si [S] >> K
M
V V
max
V 0
Si [S]= constante
V cte.
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2.3 Medida de la actividad enzim 2.3 Medida de la actividad enzim tica de muestras biol tica de muestras biol gicas. gicas.
Por ejemplo, la actividad LDH se mide mediante la reaccin:
Piruvato + NADH Lactato + NAD
+
Cada mol de piruvato que es convertido en lactato consume un mol de
NADPH, que se transforma en NAD
+
, por lo que la velocidad de la
reaccin es equivalente a la velocidad de formacin de lactato, de NAD
+
o a la desaparicin de piruvato o de NADPH
S P
[S]
[P]
T
T
El NADH absorbe luz de 340 nm, cosa que el NAD
+
no hace.
La absorbancia a 340 nm es proporcional a la concentracin
de NADH (Ley de Beer), y cambios en la absorbancia a 340
nm se corresponde a cambios en la concentracin de NADH.
NAD(P)H NAD(P)H
NAD(P) NAD(P)
+ +
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
Absorbancia = x concentracin x
recorrido ptico de la luz
A A concentraci concentraci n n (molar)
8
A medida que avanza la reaccin y el piruvato se convierte en lactato, hay
un consumo de NADPH, y como consecuencia de ello una disminucin en la
absorbancia a 340. La velocidad de la reaccin se mide por la variacin de la
absorbancia con el tiempo con un espectrofotmetro.
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

a

3
4
0

n
m
Tiempo
Absorbancia
340 nm

Moles consumidos de NAD(PH)/seg

actividad enzimtica
En primer lugar se preparan los reactivos y se mezclan en una cubeta de
espectrofotmetro, de manera que las concentraciones de los
substratos (Piruvato y NADH) estn por encima de sus respectivos K
M
.
El enzima se aade al aadir la muestra de suero.
Se mide entonces la velocidad de reaccin como moles consumidos de
NADPH por minuto.
Se expresa este valor en Unidades de Actividad Enzimtica (IU)
Se refiere dichas unidades al volumen que se haba aadido de suero
Se expresa el resultado final como Unidades de actividad enzim Unidades de actividad enzim tica tica
por ml de suero. por ml de suero.
2.3 Medida de la actividad 2.3 Medida de la actividad enzim enzim tica tica de muestras biol de muestras biol gicas. gicas.
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3. 3.- - Los enzimas como marcadores de lesi Los enzimas como marcadores de lesi n tisular (I) n tisular (I)
3.1 Caracter 3.1 Caracter sticas de los enzimas utilizados como marcadores: sticas de los enzimas utilizados como marcadores:
Los enzimas que se utilizan en el diagnstico son enzimas intracelulares,
cuya concentracin en plasma es muy baja.
Su relacin concentracin plasma/concentracin tejidos es <1:1000
La presencia de niveles elevados de enzimas en el suero implica que ha
habido lesin (muerte?) celular lo que permite la salida a la circulacin
de enzimas normalmente confinados en el interior de las clulas.
La cantidad de actividad enzimticamedibledepende de su liberacin al
medio, de la estabilidad del enzima, de su velocidad de eliminacin.
Se trata de enzimas (o isoenzimas) que se expresan mayoritariamente en
un determinado tejido, pudiendo servir de marcador tisular especfico.
3 Los enzimas como marcadores de lesi 3 Los enzimas como marcadores de lesi n tisular (II) n tisular (II)
por qu por qu aumenta su nivel en plasma...?: aumenta su nivel en plasma...?:
Necrosis de los tejidos
Aumento del catabolismo celular (reparacin tisular, cncer)
Aumento concentracin intracelular (induccin)
Obstruccin en la salida exocrina (-amilasa)
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3 Los enzimas como marcadores de lesi 3 Los enzimas como marcadores de lesi n tisular (III) n tisular (III)
3.2 Distribuci 3.2 Distribuci n tisular de la actividad n tisular de la actividad enzim enzim tica tica de enzimas de enzimas
con significaci con significaci n cl n cl nica nica
Transaminasas Transaminasas en distintos tejidos en distintos tejidos
0
10
20
30
40
50
60
Hgado Corazn Msculo Cerebro Rin Pncreas Pulmn Hemates
U
n
i
d
a
d
e
s
/
g
AST/GOT
ALT/GPT
AST: mitocondria y citosol
ALT: citoslica
11
Actividad tisular Actividad tisular fosfatasa fosfatasa cida cida
0
200
400
600
800
1000
1200
Prstata Rin Pncreas
U
n
i
d
a
d
e
s
/
g
Fosfatasa Fosfatasa alcalina en tejidos alcalina en tejidos
Hueso
Hgado
Prstata
Duodeno
Rin
0
10
20
30
40
50
60
U
n
i
d
a
d
e
s
/
g
12
Creat Creat n n fosfoquinasa fosfoquinasa en tejidos en tejidos
Cerebro
Miocardio
M. liso Rin Hgado
M.esquel.
0
500
1000
1500
2000
2500
U
n
i
d
a
d
e
s
/
g
L L ctico ctico deshidrogenasa deshidrogenasa en tejidos en tejidos
Hgado
Miocardio
Ganglios
Pncreas
Eritrocitos
Pulmn
M. esquel
Rin
0
20
40
60
80
100
120
140
160
U
n
i
d
a
d
e
s
/
g
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3. 3.- - Los enzimas como marcadores de lesi Los enzimas como marcadores de lesi n tisular (IV) n tisular (IV)
3.3 Patr 3.3 Patr n n isoenzim isoenzim tico tico de algunos enzimas con significaci de algunos enzimas con significaci n cl n cl nica nica
Estructura de la CPK y sus Estructura de la CPK y sus isoenzimas isoenzimas: :
CPK CPK
1 1
=b b
2 2
Cerebro
CPK CPK
2 2
=m mb b
corazn
CPK CPK
3 3
=m m
2 2
m. esqueltico
+ +
- -
1 1 2 2 3 3
Muestra suero
La CPK est constituida por dos subunidades. Existen dos tipos de subunidades.
diferentes, lo que explica la existencia de tres isoformas son distintas. En los
los tejidos est presente una isoforma distinta.
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Estructura de LDH y sus Estructura de LDH y sus isoenzimas isoenzimas: :
+ +
- -
1 1 2 2 3 3 4 4 5 5
La LDH est constituida por cuatros subunidades.
Existen dos tipos de subunidades. diferentes, lo
que explica la existencia de 5 isoformas son
distintas que poseen una movilidad electrofortica
diferente que permite distinguirlas. En los los
tejidos est presente una isoforma distinta.
LDH LDH
5 5
=
4 4
LDH LDH
1 1
=
4 4
LDH LDH
2 2
=
3 3

1 1
LDH LDH
3 3
=
2 2

2 2
LDH LDH
4 4
=
1 1

3 3
Distribuci Distribuci n de los n de los isoenzimas isoenzimas de de
l l ctico ctico deshidrogenasa deshidrogenasa en tejidos en tejidos
(
1
)

4
(
2
)

(
3
)

2
(
4
)

3
(
5
)

4
H

g
a
d
o
M
i
o
c
a
r
d
i
o
E
r
i
t
r
o
c
i
t
o
s
M
.

e
s
q
u
e
l
R
i

o
n
P

n
c
r
e
a
s
P
u
l
m

n
0
50
100
150
200
U
n
i
d
a
d
e
s
/
g
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Patrn isoenzimtico de la LDH de suero en infarto de
miocardio y en hepatitis aguda
3. 3.- - Los enzimas como marcadores de lesi Los enzimas como marcadores de lesi n tisular (II) n tisular (II)
Magnitud del da Magnitud del da o celular o celular
Citoplasmtico: LDH, ALT, CPK, AP
Organelas (mitocondrial, microsomal): AST, GT, 5 nucleotidasa
Alteraciones inespec Alteraciones inespec ficas de enzimas s ficas de enzimas s ricos. ricos.
Factores dependientes de la edad y sexo
Factores atribuibles a la conservacin de las muestras
Localizaci Localizaci n del da n del da o celular o celular
Muy pocos enzimas son especficos de un solo tejidos. Alternativas:
medida de ms de un enzima (p. ej. perfil heptico)
isoenzimas
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4. 4.- - Enzimas s Enzimas s ricos de importancia diagn ricos de importancia diagn stica cl stica cl nica (I). nica (I).
Aspartatoaminotransferasa(AST/GOT)
Valores normales: <40U/ml
Aumento importante: Infarto e miocardio, hepatitis, traumatismos
Aumento moderado: cirrosis, mononucleosis, ictericia, hemlisis
Alaninaaminotransferasa(ALT/GPT)
Valores normales: <50 U/ml
Aumento importante: Shock, hepatitis
Aumento moderado: cirrosis, mononucleosis, ictericia,
-amilasa
Valores normales: <50U/ml
Aumento importante: pancreatitis aguda y crnica, cncer de pncreas.
Aumento moderado: parotiditis, algunos carcinomas, procesos parapancreticos
(gastritis, lcera duodenal, peritonitis, obstruccin intestinal.
4. 4.- - Enzimas s Enzimas s ricos de importancia diagn ricos de importancia diagn stica cl stica cl nica (II). nica (II).
Creatnfosfoquinasa(CPK)
Valores normales: <160U/ml en varones y <130U/ml en mujeres
Aumento importante: Infarto de miocardio (isoenzimaCPK-1)
Aumento moderado: miopatas, distrofia muscular, accidente cerebro-vascular
Fosfatasacida (ACP)
Valores normales: <2 U/ml
Aumento importante: hipertrofia o cncer de prstata (isoenzimaprosttico),
hiperparatiroidismo, Hodkin, enf. Paget
Aumento moderado: enf. Gaucher, insuficiencia renal aguda, hepatitis, ictericia
obstructiva
Fosfatasaalcalina (ALP)
Valores normales: 85-190U/ml en el adulto. Hasta 500U/ml en nios en desarrollo
Aumento importante: ictericia obstructiva, colelitiasis, neoplasia de vas biliares, cirrosis, hepatomas
Aumento moderado: neoplasias seas osteognicas, osteomalacia, enf. Paget, hiperparatiroidismo
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4. 4.- - Enzimas s Enzimas s ricos de importancia diagn ricos de importancia diagn stica cl stica cl nica (III). nica (III).
Gamaglutamil transpeptidasa(GGT)
Valores normales: <35U/ml en varones y <25U/ml en mujeres
Aumento importante: Hepatitis vrica, obstruccin biliar, metstasis hepticas, enf. alcohlica
Aumento moderado: infecciones que afectan al hgado (citomegalovirus, mononucleosisinfecciosa)
Lctico deshidrogenasa(LDH)
Valores normales: <120-230 U/ml
Aumento importante: infarto de miocardio (LDH
1
), hepatitis vricas (LDH
4
, LDH
5
)
Aumento moderado: hemlisis, accidente cerebro-vascular, distrofia muscular
5nucleotidasa(NTP)
Valores normales: <9U/ml en el adulto.
Aumento importante: colestasisintrao extraheptica, enfermedades hepatobiliares, cncer heptico
Aumento moderado:
Enzimas s Enzimas s ricos en la enfermedad ricos en la enfermedad cardiaca cardiaca
Creatn fosfoquinasa (CPK) < 160 U/L (Isoenzima mb)
Lctico deshidrogenasa (LDH) < 120-230 U/L; isoenzima 1
(15-25%).
Aspartato aminotransferasa (AST; GOT) < 40 U/L
Tras el infarto, hay una liberacin de protenas intracelulares de las clulas
daadas. La primera en ser detectada es la troponina (5-10 h post infarto),
seguida de la CK-MB (pico a 1 da), y finalmente la LDH, cuyo mximo se alcnza
den los 2-3 das post infarto
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Enzimas s Enzimas s ricos en la enfermedad hep ricos en la enfermedad hep tica tica
Alanina aminotransferasa (ALT; GPT) < 50 U/L
Aspartato aminotransferasa (AST; GOT) < 40 U/L
Lactato deshidrogenasa < 90 U/L (isoenzima 5)
glutamil transpeptidasa (GGT) < 50 U/L
Fosfatasa alcalina < 70 U/L
Fosfatasa cida < 0.6 U/L
5 nucleotidasa < 5 U/L