Bioquímica Médica - Prácticas

Enzimas
 Enzimas
La mayoría son

Proteínas
Biocatalizadores Que
intervienen

Incrementan la Reacciones
velocidad químicas
De los

Existen enzimas compuestas

Organismos
de ARN llamadas Ribozimas. vivos
 Enzimas La energía de activación es la mínima cantidad de
energía que se requiere para que ocurra la reacción.

Aceleran la velocidad
de las reacciones
Mediante la

Disminución de la
energía de activación
de la reacción
 Actividad enzimática
es
Directamente
proporcional Determinación Cantidad sustrato consumido
Por medio de (producto formado)/unidad
A su concentración de tiempo
Velocidad de la
reacción que Se debe expresar en
cataliza Unidades Internacionales
(UI) de actividad enzimática

Se recomienda al Katal como # moles de sustrato

medida de la actividad enzimática transformado/minuto
1 Katal = 60 UI
 Distribución
En la células
Si sólo se
encuentran en el Organelas
citosol
citosol se (ejm)
conocen como mitocondrias
Uniloculadas
Si presentan un porcentaje en citosol
TGP ( transaminasa y otro en organelas son Bilobuladas
glutámico pirúvica )
LDH ( láctato
deshidrogenasa ) TGO transaminasa glutámico oxalacetica 60% en citoplasma 40 % en
mitocondria
Malato deshidrogenasa (MDH 50 % en citoplasma y 50 % en mitocondria
En las células somáticas normales, las
actividades catalíticas de las numerosas enzimas
se mantienen muy constantes, ya que existe un
equilibrio entre la síntesis y la degradación
enzimática, pero constantemente llegan al
espacio extracelular pequeñísimas cantidades
de muchas enzimas intracelulares. En muchas
enfermedades está aumentada la salida de
enzimas desde el interior celular, esto puede
deberse por un aumento de la permeabilidad de
las membranas celulares, o bien por disolución
de la estructura celular. De esta manera se
originan modificaciones del nivel enzimático en
el plasma sanguíneo, de indudable valor que
ayudan a realizar un diagnóstico
 Enzimas plasmáticas

Enzimas plasmo específicas Enzimas secretadas o Enzimas celulares o

exocitoenzimas endocitoenzimas
Sintetizadas en
determinados tejidos, pero Secretadas por glándulas o Su lugar de acción es en la
su acción es en el plasma tejidos especializados , su misma célula que la
lugar de acción está alejado sintetiza
Complejo protrombínico,
lipoproteínlipasa, Amilasa, lipasa, tripsina Ubicuas Organoespecíficas
plasmalógeno

Enzimas de Enzimas del ciclo

glicólisis de la úrea
 Enzimas Séricas Hepáticas
Transaminasas Gammaglutamiltranspeptidasa Fosfatasa Alcalina

 Se encuentra en
 Fuentes mas
riñón, hígado, bazo
y pulmón importantes hígado,
 Catalizan reacciones
 Valores normales huesos e intestino
de transaminación
 En crecimiento los
 TGO y TGP difieren en ambos
sexos valores son altos por
 Aumentan en
 Aumenta en actividad
enfermedades
hepatobiliopatias , osteoblástica ,
hepáticas , hepatitis
procesos como en el
víricas y tóxicas
obstructivos o embarazo (III
neoplásicos trimestre)
Enzimas Séricas Pancreáticas
Amilasa Lipasa sérica

 El aumento de estas enzimas en plasma y orina apoya

una fuerte existencia de lesión pancreática
( pancreatitis aguda )
 Las principales causas de pancreatitis son
enfermedades de las vías biliares y el alcoholismo
crónico.
 La amilasa salival proviene también de otro órganos
como trompas de Falopio, ovarios, glándulas
salivales , intestino , pulmón , próstata e hígado , por
lo tanto su aumento puede indicar un proceso
inflamatorio en éstos.
 La lipasa también es producida en intestino, faringe
riñon y bazo, por lo que su aumento también está
relacionado a procesos inflamatorios en estos.
 Enzimas séricas en infarto de Miocardio
Creatinina
Lactato Deshidrogenasa
Fosfoquinasa

 En individuos sanos la
actividad total de la CK en  En el infarto la
suero se compone de CK-MM alteración que se
 En el infarto es la importancia manifiesta es el
la actividad de la CK-MB. aumento de LDH1,
 Ayudan a reconocer antes de los de LDH
precozmente reinfartos total.
 El aumento de la CK también
se da en esfuerzo físico,
heridas musculares, daño
hipoxico
 Enzimas
Factores que modifican
la actividad enzimática

Tiempo de
pH del medio reacción

Concentración Efecto de
de la enzima inhibidores y
activadores

Temperatura Fuerza iónica

Concentración
del medio
del sustrato
 Enzima
proteolítica
Enzimas Código enzimático:
3.4.23.1
es

Acción
hidrolítica Pepsina
La pepsina, es una
endopeptidasa, hidroliza
enlaces peptídicos situados Sobre
al lado amino de Phe, Tyr,
Trp, Asp, Glu y Leu. No actúa Proteínas
si el residuo anterior es Pro.
Ya que rompen

Enlaces
peptídicos

La pepsina, se forma a partir de un precursor inactivo, el

pepsinógeno (es un zimógeno o proenzima), que se almacena
en las células del estómago y activa en medio ácido, ya que
remueve un péptido bloquedor de su amino terminal extremo.
 Ovoalbúmina
584
Constituida
Proteína aminoácidos
globular
presente Peso
64500 g/mol
Molecular
Altas Huevo
concentraciones fresco PI 4.6
en
La desnaturalización de la ovoalbúmina se logra
Clara de Solución viscosa, hirviendo el huevo, se extrae la clara, se licua
huevo ligeramente con agua destilada, y se obtiene la solución de
ovoalbúmina por filtración.
opalescente
Parte Experimental

Relación de experimentos :
 Determinación de la Actividad de la lactato deshidrogenasa
 Factores que afectan la actividad enzimática
 Determinación de la
actividad de la lactato
deshidrogenasa
Experimento Determinación de Lactato Deshidrogenasa

Fundamento

La lactato deshidrogenasa (LD o LDH) cataliza la reducción del Medir la

piruvato por NADH, obteniéndose lactato y NAD+. La absorbancia en
concentración catalítica se determina a partir de la velocidad función al tiempo
de desaparición del NADH, medido a 340 nm
Experimento Determinación de Lactato Deshidrogenasa

Procedimiento

 Preparar el reactivo de trabajo ( 4 mL de Medir cada

Rx A + 1mL Rx B) minuto la Abs

 Tomar 20 uL de suero sanguíneo.

 Precalentar el Reactivo de Trabajo el
instrumento a la temperatura de
reacción.
 Pipetear en una cubeta: Leer las
absorbancias a
340 nm
Reactivo de Trabajo 1,0 mL
Muestra 20 µL
Experimento Determinación de Lactato Deshidrogenasa

Procedimiento
 Mezclar e insertar la cubeta en el fotómetro.
 Poner el cronómetro en marcha.
 Pasados 30 segundos, anotar la absorbancia inicial y efectuar nuevas lecturas cada
minuto durante 3 minutos.
 Calcular el incremento de absorbancia por minuto promedio (∆A/min).
30 1 min 1 min 1 min
seg
Abs
Abs 1 Abs 2 Abs 3
Inicial

Promedio
Leer las
absorbancias
a 340 nm

Cálculos
Experimento Determinación de Lactato Deshidrogenasa

Resultados
Valores de Absorbancia
Muestra 1
Absorbancia 0.358
inicial
Abs 1 0.345 0.013
Abs 2 0.320 0.025
Abs 3 0.302 0.018

Promedio *135 = uKat/L

Evaluación de los
factores que afectan la
actividad enzimática

https://www.youtube.com/watch?v=aXgqmb_o_pI
 Efecto del pH sobre la
actividad enzimática

Enzimas
Carboxilo poseen

Amino Por ejemplo

Grupos químicos Se altera su
Tiol ionizables carga eléctrica
En sus
Imidazol
Cadenas laterales De acuerdo al
de sus aminoácidos pH del medio
pH óptimo
Nota: La conformación de las enzimas depende de sus cargas
eléctricas, por lo que habrá un pH en el cual la conformación será la
mas adecuada para la actividad catalítica (pH óptimo).
 Efecto del pH sobre la
actividad enzimática

Pepsina Tripsina Lisozima pH Optimo

Donde se produce
Velocidad inicial
(Nmol/min)

Mayor velocidad de
reacción enzimática
Por lo tanto

Mayor actividad
enzimática
 Efecto del pH sobre la velocidad
Experimento 1
Procedimiento
de una reacción enzimática
a) Preparar 5 tubos de prueba de acuerdo al siguiente cuadro.
1 2 3 4 5
Solución de ovoalbúmina 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL
HCl 1.0 N 2.0 mL 0.5 mL 0.0 mL 0.0 mL 0.0 mL
Na2CO3 10% 0.0 mL 0.0 mL 0.0 mL 0.5 mL 2.0 mL
Agua destilada 0.0 mL 1.5 mL 2.0 mL 1.5 mL 0.0 mL

1 2 3 4 5
 Efecto del pH sobre la velocidad
Experimento 1
Procedimiento
de una reacción enzimática
b) En 5 tubos pequeños, medir 0.3 mL
de una solución de pepsina al 1%. d) Agregar rápidamente a cada uno
de los 5 primeros tubos, los 0.3 mL
de la solución de pepsina que se
1 2 3 4 5 encuentra en los segundos tubos.

c) Preincubar los 10 tubos en baño e) Mezclar y continuar la

maría a 37 oC por 5 minutos. incubación a 37 oC por 10 minutos.
Observar cuidadosamente los
5 minutos tubos antes y después de agregar
la enzima.

10 minutos
EXPERIMENTO 1
1 2 3 4 5
Solución de ovoalbúmina 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL
HCl 1.0 N 2.0 mL 0.5 mL 0.0 mL 0.0 mL 0.0 mL
Na2CO3 10% 0.0 mL 0.0 mL 0.0 mL 0.5 mL 2.0 mL
Agua destilada 0.0 mL 1.5 mL 2.0 mL 1.5 mL 0.0 mL

En 5 tubos pequeños, medir 0.3 mL de una solución de pepsina al 1%

EXPERIMENTO 2
1 2 3 4
Solución de ovoalbúmina 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL
HCl 1.0 N 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL
Agua destilada 1.5 mL 1.5 mL 1.5 mL 1.5 mL

 En 4 tubos pequeños, medir 0.3 mL de pepsina al 1%

 Efecto del pH sobre la velocidad
Experimento 1 de una reacción enzimática
Cálculos
a) Haga el calculo teórico de pH de cada tubo, y
compruebe con papel indicador el pH de todos los tubos.

Tubo 1

𝑉 1 𝑥 𝐶 1=𝑉 2 𝑥 𝐶 2 𝐴𝑐𝑖𝑑𝑜 𝐹𝑢𝑒𝑟𝑡𝑒

2 𝑚𝐿 𝑥 1 𝑁=7.0 𝑚𝐿 𝑥 𝐶 2 𝑝𝐻 =− log ⁡¿
𝐶 2=0.286 𝑁 𝑝𝐻 =− log ⁡[0.286]
𝐶 2=0.286 𝑀 𝑝𝐻 =0.54

Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5

 Efecto del pH sobre la velocidad
Experimento 1 de una reacción enzimática
Resultados
a) Expresar el aclaramiento (la actividad enzimática) b) Determinación del pH con papel indicador universal.
de cada uno de los tubos, con 0 – 5 cruces al final
de 1, 5 y 10 minutos.

1 2 3 4 5

1 minuto

1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
pH calculado 0.54 7
5 minutos
pH práctico 1.5
1 minuto 0 0 0 0 0
1 2 3 4 5 Aclaramiento 5 minutos 0 2 0 0 0
10 minutos 0 5 0 0 0
10 minutos
El pH óptimo de la pepsina es: ……………………………………..
 Efecto del pH sobre la velocidad
Experimento 1 de una reacción enzimática
Resultados
Construya en Microsoft Excel una grafica 6
con los resultados obtenidos colocando
en el eje X el pH y en el eje Y la actividad 5

Actividad Enzimática
enzimática (aclaramiento).
4

0
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00

pH
 Efecto de la temperatura
sobre la actividad enzimática
Reacciones Reacciones
químicas enzimáticas

Por cada 10oC Siguen esta regla

de incremento hasta cierto punto
Ya que a

Velocidad de Cierta temperatura,

la reacción se se desnaturaliza por
duplica el calor https://www.youtube.com/watch?v=IoDEjeRZ0xE

La temperatura altera la conformación de las enzimas, por lo que

habrá una temperatura en la cual, la conformación será la mas
adecuada para la actividad catalítica (temperatura óptima).
 Efecto de la temperatura sobre la
Experimento 3
velocidad de una reacción enzimática
Procedimiento
a) Preparar 4 tubos de prueba de acuerdo al siguiente cuadro.
1 2 3 4
Solución de ovoalbúmina 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL
HCl 1.0 N 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL
Agua destilada 1.5 mL 1.5 mL 1.5 mL 1.5 mL

1 2 3 4
 Efecto de la temperatura sobre la
Experimento 3
Procedimiento
velocidad de una reacción enzimática
d) Agregar rápidamente a cada uno de los 4 primeros
b) En 4 tubos pequeños, medir 0.3 mL de tubos, las soluciones de pepsina de los 4 segundos tubos.
pepsina al 1%

2
1

4
2
1 2 3 4 3 4

37 oC
100 o C

c) Preincubar los 8 tubos por 5 minutos e) Mezclar y continuar la incubación a la temperatura

a las siguientes temperaturas: correspondiente por 10 minutos. Observar cuidadosamente
5 minutos los tubos antes y después de agregar la enzima.
1 1
1 2
2 2
3 4 10 minutos
3 4 3 4
37 oC
100 oC
37 oC
100 o C

0 oC 20 oC 37 oC 92 oC 0 oC 20 oC 37 oC 92 oC
 Efecto de la temperatura sobre la
Experimento 2
Resultados
velocidad de una reacción enzimática
a) Expresar el aclaramiento (la actividad enzimática) de cada uno
de los tubos, con 0 – 5 cruces al final de 1, 5 y 10 minutos.

1 2 3 4

1 minuto
1 2 3 4

1 2 3 4 1 minuto 0 0 1 1

Aclaramiento 5 minutos 0 0 3 1
5 minutos

10 minutos 0 1 5 1
1 2 3 4

10 minutos
 Efecto de la temperatura sobre la
Experimento 2
velocidad de una reacción enzimática
Resultados
Construya en Microsoft Excel una grafica 6
con los resultados obtenidos colocando
en el eje X la temperatura y en el eje Y la 5

Actividad Enzimática
actividad enzimática (aclaramiento).
4

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Temperatura (oC)
 Influencia de la concentración de la
enzima sobre la velocidad de reacción

Aumento [E]
Velocidad inicial

Aumenta
(nmol/min)

proporcionalmente
Velocidad
enzimática

Concentración de enzima
(µg/mL)
 Efecto del concentración de la enzima sobre
Experimento 3
Procedimiento
la velocidad de una reacción enzimática
a) Preparar 4 tubos de prueba de acuerdo al siguiente cuadro.
1 2 3 4
Solución de ovoalbúmina 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL
HCl 1.0 N 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL
Agua destilada 1.5 mL 3.5 mL 4.2 mL 4.2 mL

1 2 3 4
1 2 3 4
Pepsina 1 %
preincubada 3.0 mL 1.0 mL 0.3 mL 0.0 mL

Pepsina 1%
hervida 0.0 mL 0.0 mL 0.0 mL 0.3 mL
 Efecto del concentración de la enzima sobre
Experimento 3
Procedimiento
la velocidad de una reacción enzimática
b) Preincubar lo siguiente en 4 tubos pequeños

1 2 3 4 d) Agregar rápidamente a cada

1 2 3 4 Pepsina 1 % uno de los 4 primeros tubos,
preincubada 3.0 mL 1.0 mL 0.3 mL 0.0 mL
las soluciones de pepsina de
Pepsina 1% los 4 segundos tubos.
hervida 0.0 mL 0.0 mL 0.0 mL 0.3 mL

c) Preincubar los 8 tubos en baño maría

a 37 oC por 5 minutos. e) Mezclar y continuar la
incubación a 37 oC por 10 minutos.
5 minutos Observar cuidadosamente los
tubos antes y después de agregar
la enzima.

10 minutos
 Efecto del concentración de la enzima sobre
Experimento 3
la velocidad de una reacción enzimática
Cálculos
Calcule la concentración de la pepsina en cada uno de los tubos en miligramos por tubo.

Solución pepsina 1%

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

1g Pepsina ----- 100 mL
X ----- 3 mL

X = 0.03 g = 30 mg
 Efecto del concentración de la enzima sobre
Experimento 3
Resultados
la velocidad de una reacción enzimática
a) Expresar el aclaramiento (la actividad enzimática) de cada uno
de los tubos, con 0 – 5 cruces al final de 1, 5 y 10 minutos.

1 2 3 4

1 minuto
1 2 3 4

1 2 3 4 1 minuto 3 2 0 0

Aclaramiento 5 minutos 5 4 1 0
5 minutos

10 minutos 5 5 3 0
1 2 3 4

10 minutos
 Efecto del concentración de la enzima sobre
Experimento 3
la velocidad de una reacción enzimática
Resultados
Construya en Microsoft Excel una grafica
con los resultados obtenidos colocando 6
en el eje X el [E] y en el eje Y la actividad

Actividad Enzimática
enzimática (aclaramiento). 5

0
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00

[E]
Bibliografía
• Bisswanger, H. (2017). Enzyme kinetics: principles and methods. John Wiley & Sons.
• Huntington, J. A., & Stein, P. E. (2001). Structure and properties of ovalbumin. Journal of
Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 756(1-2), 189-198.
• Suwareh, O., Nau, F., & Causeur, D. (2019). Identification of the physicochemical
characteristics of peptides that influence their hydrolysis by pepsin. In Workshop Infogest
statistical treatment of peptidomic data.
• Zotter, A., Bäuerle, F., Dey, D., Kiss, V., & Schreiber, G. (2017). Quantifying enzyme
activity in living cells. Journal of Biological Chemistry, 292(38), 15838-15848.