Determinacin de enzimas

1. CONCEPTOS BSICOS SOBRE LAS ENZIMAS

Las enzimas, son protenas altamente especializadas en la catlisis de las reacciones

biolgicas, es decir aceleran la velocidad de las reacciones en las que intervienen.

Estas molculas, catalizan prcticamente todas las reacciones que tienen lugar en
nuestro organismo y por lo tanto, estn presentes en todas las reacciones de las
diferentes rutas metablicas.

Se caracterizan por:

- Su elevada especificidad por el sustrato o sustancia sobre la que actan, para

dar lugar a un producto. ( Solo catalizan un tipo de reaccin)
- Su gran poder cataltico: sin enzimas las reacciones se produciran de manera
espontnea pero a una velocidad extremadamente lenta. En cambio, con la
presencia de biocatalizadores o enzimas la velocidad de la reaccin puede
aumentar miles de veces.

Las enzimas son necesarias para que las reacciones biolgicas se produzcan a
velocidades adecuadas para la clula, es decir a velocidades tiles y que canalicen
esta energa hacia rutas que sean tiles de manera que no se malgaste energa.
Adems, deben regularse para que la produccin de las distintas sustancias responda
a las necesidades de la clula.

Se sintetizan en el interior celular, aunque tambin se encuentran en el lquido

intersticial y muchos fluidos biolgicos debido a que son secretadas por clulas
productoras o a que se escapan de ellas. Encontramos enzimas en todos los tejidos
pero no todas las enzimas se encuentran en todos los tejidos.

1.1. Estructura y especificidad del sustrato.

Las enzimas tienen una estructura proteica tridimensional. Encontramos dos zonas
principalmente:

- El centro activo que es la zona a la cual se une el sustrato. Contiene los

aminocidos responsables de la catlisis.
- Centro alostrico que contiene los aminocidos responsables de la unin de
molculas que regulan la actividad enzimtica.

La especificidad de las enzimas puede ser absoluta, solo para una determinada
molcula o relativa, cuando puede unirse a un grupo de molculas semejantes que
tienen diferente afinidad para la enzima.

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Determinacin de enzimas

1.1.1. Modelos de unin enzima-sustrato

Encontramos dos modelos para explicar la unin entre la enzima y el sustrato

- Modelo llave-cerradura: supone que la enzima tiene una estructura estable y

especfica para un sustrato, es decir es complementaria.
- Modelo del ajuste inducido o guante-mano: El sustrato al unirse a la enzima
provoca en ella un cambio conformacional por lo que la enzima se adapta al
sustrato.

Enzima

Estrictamente
Holoenzimas
proteico

Apoenzima
(fraccin no Cofactor
proteica)

Inorgnico (in
orgnico
metlico)

Grupo postico
Coenzima (unicn
(grupo hemo,union dvil, vitaminas)
fuerte)

1.2. Catlisis y cintica enzimtica

Una reaccin qumica implica una reorganizacin de tomos, es decir que se rompan
y se formen nuevos enlaces que den lugar a los productos. Para que las reacciones
se produzcan es necesario aplicar una cierta cantidad de energa, denominada
energa de activacin. Los catalizadores, entre los que encontramos las enzimas, son
sustancias que disminuyen la energa de activacin (para llegar al estado de transicin
se requiere menos energa) y por lo tanto incrementan la velocidad de la reaccin sin
alterar la energa del estado final.

El estado de transicin es aquel en que las molculas presentan la mxima energa y

es el estado en que se producen las interacciones atmicas que conducen al cambio
en los enlaces qumicos. (Hay una inestabilidad atmica que permite la formacin de
nuevos enlaces que den lugar a los productos.)

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Determinacin de enzimas

1.2.1. Mecanismo de accin enzimtica:

1) Reconocimiento de la enzima por el sustrato.
2) Formacin del complejo enzima-sustrato (ES)
3) Transformacin del complejo ES en un complejo de transicin que favorece la
accin enzimtica.
4) Formacin del complejo enzima-producto (EP)
5) Disociacin del complejo EP: se recupera la enzima (la enzima no se consume)

1.2.2. Cintica de MICHAELIS-MENTEN.

Se trata del modelo ms simple de estudio de la cintica enzimtica y tiene en cuenta

un solo sustrato y en unas condiciones determinadas de pH, temperatura... de la
enzima. Este modelo, relaciona la variacin de la velocidad con la concentracin del
sustrato de manera que:

A una concentracin baja de sustrato, la velocidad de formacin del producto es

proporcional a la concentracin de sustrato (cintica de orden 1).

En presencia de altas concentraciones del sustrato, la velocidad de la reaccin se

mantiene prcticamente constante. La velocidad de la reaccin es independiente de la
concentracin de sustrato presente. Todos los centros activos de las enzimas estn
ocupados de manera que la enzima est trabajando a su velocidad mxima (cintica
de orden 0).

La constante de Michaelis-Menten se define como el valor de la concentracin de

sustrato a la cual se consigue la mitad de la velocidad mxima. Se trata de una
caracterstica propia de cada enzima que indica la afinidad por el sustrato, tendr
diferente afinidad en funcin del sustrato.

Cuanto mayor sea la constante, menor es la afinidad de la enzima para ese sustrato y
eso implica una concentracin de sustrato mayor para obtener la mitad de la velocidad
mxima. En cambio, a menor valor de k m mayor ser la afinidad consiguiendo que con
una menor concentracin, obtener la mitad de la velocidad mxima de la reaccin.

1.2.3. Factores que influyen en la actividad enzimtica:

Los factores ms importantes que pueden influir en la actividad enzimtica y por lo

tanto en la velocidad de la reaccin son el pH, la temperatura, la fuerza inica, la
concentracin de la enzima y la presencia o no de inhibidores.

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Determinacin de enzimas

Cuando nos encontramos a pH extremos, las enzimas se desnaturalizan y pierden su

actividad. Se define como pH ptimo como el valor de pH al cual la actividad de la
enzima es la mxima posible. Normalmente es un pH neutro (pH=7) aunque
encontramos algunas que vara un poco. Para la determinacin de la actividad
enzimtica se aaden tampones que proporcionen y mantengan el pH adecuado.

De forma general, el aumento de la temperatura hace aumentar la actividad enzimtica

ya que se aumentan tambin el nmero de colisiones entre las molculas de la
enzima y sustrato. Al superarse una cierta temperatura, se produce una prdida de la
actividad debido a que se produce una desnaturalizacin de la parte proteica que
conforma la enzima. Este proceso de desnaturalizacin es irreversible. LA temperatura
ptima es la temperatura a la cual la enzima trabaja a su velocidad mxima. Las
temperaturas ptimas de casi todas las enzimas suelen ser a la temperatura corporal
ya que estas catalizan reacciones dentro del organismo (25C, 37C, 30C).

La fuerza inica del medio tambin influir en la actividad enzimtica, de manera que a
mayor fuerza inica, menor actividad enzimtica.

A mayor concentracin de la enzima, mayor ser la actividad enzimtica de esta y en

condiciones de saturacin del sustrato la velocidad solo depender de la
concentracin de la enzima, ya que encontramos un nmero mayor de centros activos
de las enzimas.

Los inhibidores son sustancias qumicas que disminuyen, retardan o bien inhiben por
completo la actividad de la enzima.

2. ACTIVIDAD ENZIMTICA Y DIAGNSTICO CLNICO.

El estudio de la actividad enzimtica en el suero proporciona informacin muy til

sobre las posibles patologas que pueden existir en distintos rganos o tejidos cuando
los niveles enzimticos se encuentran alterados.

La enzimologa clnica es la aplicacin del conocimiento de las enzimas al diagnstico,

tratamiento y pronstico de la enfermedad.

Las enzimas se encuentran ampliamente distribuidas por el organismo y

generalmente no pueden ser asociadas a una patologa concreta, pero la combinacin
de los resultados obtenidos para distintas enzimas permita hacer una aproximacin
diagnostica con mayor exactitud.

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Determinacin de enzimas

La determinacin de las enzimas se realiza a travs del clculo de la actividad

enzimtica, es decir, midiendo la velocidad de la reaccin mediante espectrofotometra
de absorcin molecular. En suero, la concentracin de la enzima es tan pequea que
no podemos detectarla, en cambio s podemos medir su actividad enzimtica.

Se puede determinar la actividad enzimtica midiendo la aparicin de algn producto,

desaparicin de sustrato o bien midiendo la variacin del cofactor o algn componente
de la reaccin.

La actividad enzimtica se mide en unidades internacionales partido por la unidad de

volumen (U/L). Una unidad internacional es la cantidad de enzima que transforma un
micromol de sustrato en un minuto en condiciones ptimas previamente establecidas
(pH, temperatura).

En el uso diagnstico de la actividad enzimtica se deben tener en cuenta las

siguientes caractersticas de las enzimas:

- La vida media de la enzima. Para que sea til en el diagnstico debe de tener
una vida media adecuada ya que las enzimas con poca vida media o con
mucha vida media permanecern en el plasma durante demasiado tiempo.
- El rango de normalidad, vara con diferentes factores como son la edad, sexo,
estrs, etc.
- La existencia de isoenzimas tambin influye en el diagnstico ya que
proporcionan ms informacin de lo habitual (CK)
- La estabilidad de la actividad, la mayora de las enzimas son estables de 2-7
das a 4C.

La muestra para las determinaciones bioqumicas debe ser suero para evitar las
posibles interferencias. La medida de la actividad enzimtica se realiza siguiendo unas
condiciones estandarizadas de pH, temperatura, cofactores para poder dar los
resultados como vlidos.

2.1. Enzimas presentes en el plasma

El plasma, recibe las enzimas procedentes de los tejidos y de las clulas de la sangre.
Por esta razn, conocer la procedencia o localizacin de las enzimas tiene gran inters
desde el punto de vista diagnstico. Podemos hacer una clasificacin en funcin de si
las enzimas son especficas o no del plasma.

Enzimas especficas del plasma

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Son aquellas enzimas cuya funcin fisiolgica o actividad enzimtica se realiza en el

propio plasma. Se encuentran en concentraciones superiores a las que encontramos
en los tejidos y su nivel se mantiene constante por la secrecin activa de los rganos
o tejidos que la sintetizan.

Las alteraciones ms frecuentes son la disminucin de la actividad enzimtica que

nos indica una alteracin de su sntesis (alteracin de funcionalidad heptica)

Enzimas no especficas del plasma

Son las enzimas que desarrollan su actividad en el interior de las clulas u rganos
destino. En condiciones normales mantienen una activad en el plasma muy pequea.

Se detecta un aumento de la concentracin debido a la entrada de la enzima a la

circulacin.

Segn su origen podemos diferenciar entre enzimas de secrecin y enzimas

asociadas al metabolismo celular

- Las enzimas de secrecin realizan su actividad fuera de las clulas,

transportan. Se produce un aumento de la secrecin o por la entrada a la
circulacin.
- Las enzimas asociadas al metabolismo celular son aquellas que realizan su
actividad en el interior celular. La cantidad de estas en el plasma es mnima
pero cuando hay una alteracin en la estructura de la clula son liberadas y
llegar al plasma.

2.2. Enzimas presentes en otros lquidos biolgicos

Orina: principalmente se determina la amilasa

Heces: se determina la tripsina y quiotripsina

LCR: se detecta la LDH aumentada puede indicar tumores cerebrales, meningitis

bacteriana y traumas cerebrales.

Lquido sinovial: las enzimas proceden de las propias clulas y leucocitos sinoviales.
Los valores de LDH estn aumentados en la artritis aguda.

Lquido pleural: se determina la enzima ADA (adenosina desaminasa). Sus niveles

elevan en enfermedades de respuesta inmune de tipo celular como puede ser la
tuberculosis y otras enfermedades infecciosas.

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Lquido asctico: se determina la amilasa para descartar pancreatitis.

Semen: determinacin de fosfatasa cida como medida de la funcin prosttica.

3. ENZIMAS ASOCIADAS A PATOLOGIAS HEPTICAS:

Las enzimas ms afectadas por las patologa hepticas son las transaminasas, la
fosfatasa alcalina, la gamma GT y la lactato deshidrogenasa (LDH)

Podemos hacer dos grandes grupos de enfermedades hepticas

Por un lado encontramos las enfermedades relacionadas con el tao celular del tejido
heptico, en las que se encuentran alteradas principalmente las transaminasas (AST y
ALT)

- Hepatitis vrica
- Hepatitis crnicas y en la cirrosis crnica

Por otro lados tenemos, las enfermedades hepticas causadas por un obstruccin
biliar, que puede ser una va o bien porque las clulas no producen bilis y no hay un
flujo biliar. Se ven alteradas las enzimas GGT, FA y LDH:

- En los carcinomas hepticos

- En obstrucciones hepticas de las vas biliares.

Encontramos otras enzimas que estn relacionadas con el dao heptico que pueden
determinarse para reforzar los resultados obtenidos con las otras enzima asociadas a
estas patologas.

3.1. Fosfatasa alcalina

La fosfatasa alcalina, FA o ALP son un grupo de enzimas situadas en las membranas

celulares. Son hidrolasas, eliminan el grupo fosfato de varias molculas.

Se encuentra en muchos tejidos y en el suero encontramos diferentes isoenzimas

hepticas (que catalizan la misma reaccin), sea y en otros tipos de tejidos.

Una elevacin de FA puede deberse a diversas patologas aunque tambin se produce

un aumento en procesos fisiolgicos como son el embarazo y el crecimiento seo
durante la infancia.

Se producen importantes aumentos de la fosfatasa alcalina en caso de:

- Enfermedad hepatobiliar:

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o Obstruccin de la va biliar como por ejemplo la coledocolitiasis

(presencia de clculos en el conducto del coldoco, desemboca en el
duodeno), un tumor pancretico, etc.
o Alteracin de los procesos celulares de secrecin biliar como es el caso
de la colestasis por drogas, la cirrosis biliar, etc.

- Patologas infiltrativas del hgado como tumores primarios, metstasis, linfomas

- Procesos asociados con patologas del hueso con actividad osteoblstica
elevada (se produce ms cantidad de hueso).

La fosfatasa alcanina se puede determinar mediante mtodos cinticos pero se tienen

que tener en cuenta el cuadro clnico del paciente adems de realizar ms pruebas
para descartar determinadas isoenzimas mediante una EF aunque es poco habitual
realizarla.

Los valores de referencia son diferentes en funcin del sexo, edad, etc. Durante el
periodo de crecimiento se puede elevar hasta 3-4 veces por encima de los valores
considerados normales debido a un aumento en la actividad osteoblstica. En
personas de la tercera edad elevaciones de las enzimas pueden considerarse
normales ya que se produce una involucin sea.

3.2. Gamma-glumamil transferasa.

La Gamma-glutamil transferasa o -GT es una enzima de la membrana canalicular del

hepatocito (canales entre hepatocitos por donde saldr la bilis)cuya funcin est
vinculada a la degradacin de glutatin y a la desintoxicacin de drogas y xenobiticos
(Alcohol, drogas, tabaco). Es decir su principal funcin es participar en la
degradacin de productos txicos.

Esta enzima cataliza la reaccin de transferencia de un grupo glutamilo a un

aminocido.

Se encuentra en el hgado, el rin, el pncreas y predomina en las vas biliares.

Podemos encontrar una elevacin de los niveles de GGT en enfermedades hepticas,
insuficiencia renal, infarto de miocardio

Niveles alterados de GGT generalmente se observan en:

- Colestasis. La mayor utilidad de la GGT es excluir el origen seo que produce

una elevacin de la FA.

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Determinacin de enzimas

- En personas que reciben medicacin anti convulsionante y personas

consumidoras habituales de alcohol (el etanol es un inductor enzimtico)

La GGT se determina mediante mtodos cinticos y los valores de referencia tambin

varan segn el sexo.

3.3. Transaminasas

Son molculas que transfieren el grupo amino (-NH2) de un aminocido a un

cetocido.

La ALT y AST son enzimas que estn presentes en la mayora de las clulas. Su
concentracin en el interior de los hepatocitos es muy elevada y cuando se lisan estas
clulas, se liberan las enzimas al plasma.

Niveles moderadamente altos indican procesos inflamatorios crnicos producidos por

virus o al consumo crnico de alcohol. La obstruccin de las vas biliares pueden
asociarse a una elevacin de las transaminasas, caractersticamente estos niveles
bajan rpidamente permitiendo hacer un diagnstico diferencial de otros cuadros
clnicos.

- Si la relacin ALT/AST es superior a 1, nos indica enfermedad heptica aguda.

- Si la relacin ALT/AST es inferior a 1, nos indica enfermedades crnicas como
cirrosis, tumores o hepatopatas alcohlicas se favorece la libracin de AST
desde los mitocondrias.

ASPARTATO AMINOTRANSFERASA

En lesions lleus la major part de lAST alliberada prov del citoplasma.

En les greus, augmenta la quantitat dAST mitocondrial alliberada.

o Nivells alts:

- Lesions heptiques: necrosis dels hepatcits.

- Necrosis miocardi (IAM).

- Distrofiamuscular.

- Necrosis tissulars: emblia pulmonar...

- Moltes causes inespecfiques daugment (hemlisi, frmacs..).

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Determinacin de enzimas

o Nivells disminuts: molt difcil trobar-los. Indiquen desaparici del parnquima

heptic.

Determinaci: per mtodes cintics.

Valors de referncia: homes 40 U/l i dones 32 U/l

ALANINO AMINOTRANSFERASA:

La alanino aminotransferases, alanino transaminasa o transaminasa glutamat-piruvat

(GPT) T la funci de transferncia grup amino des de lalanina a l-cetoglutarat
formant piruvat i glutamat. ( transferncia de la alanina per transformar-la en glutamat).

La AST es tracta dun enzim del citoplasma (intracellular). Es troba principalment al

fetge, al hepatcits i aix li confereix ms especificitat que la AST o GOT.

Seleva en lesions heptiques. Seleva marcadament en necrosis agudes dels

hepatcits i en menor grau en les crniques (com AST).

La alanino aminotransferasa es determina mitjanant mtodes cintics.

Els valors de referencia de la ALT poden variar entre homes i dones.

3.4. Lactat deshidrogenasa

Lenzim lactat deshidrogenasa, es un enzim oxidoreductasa que catalitza la reacci de

reducci del piruvat (oxidaci reversible de lactat a piruvat).

Es troba a totes les cllules de lorganisme (enzim intracellular) per els seus nivells
son superiors al plasma.

La LDH t una estructura tetramrica (formada per 4 subunitats) constitudes per dos
tipus de cadenes H i M. La combinaci daquestes dona lloc a 5 isoenzims amb
diferent presencia als diferents teixits:

- LDH1: cor, msculs i eritrcits

- LDH2: Sistema reticuloendotelial i leuccits
- LDH3: pulmons.
- LDH4: ronyons, placenta i pncreas.
- LDH5: fetge i msculs.

Alteracions es poden donar principalment en moltes situacions i per causes

inespecfiques (hemlisi).

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Determinacin de enzimas

Les seves aplicacions clniques son la necrosis heptica deguda a agents txics,
metstasi, infecci aguda i daltra banda per al diagnstic i pronstic de malalties
neoplsiques. Tamb til en el seguiment de la quimioterpia del cncer.

Determinaci: per mtodes cintics. Isoenzims per EF.

Valors de referncia: 230-460 U/l.

3.5. Altres enzims para la valoraci heptica

5-nucleotidasa (5-ND) i leucina aminopeptidasa (LAP)

- La seva determinaci t poca especificitat diagnstica, per augmenta

lespecificitat diagnstica de FA.
- Augment de FA + augment de 5-ND i LAP: alteraci heptica.

Colinesterasa

- Sintetitzada al fetge.
- Nivells disminuts en malnutrici, cirrosi i hepatitis agudes.
- Disminuci en intoxicaci amb pesticides organofosforats.
- Determinaci en estudis preoperatoris, ja que metabolitza un relaxant muscular
que sutilitza en les intervencions quirrgiques. Algunes variants de lenzim
(codificades per gens mutats) no el poden metabolitzar i dona lloc a
complicacions greus.
- Pancreatitis aguda: inflamaci del pncrees i teixit peripancretic de forma
aguda (intensa, sobtada..).

- Causes ms freqents:

o Obstrucci del coldoc per clculs biliars.

o Consum abusiu dalcohol.
- Sactiva el tripsinogen activaci daltres enzimsautodigesti pancretica.

- Diagnstic i monitoritzaci de pancreatitis aguda: lipasa i amilasa

o Lipasa s ms especfica, especialment en pancreatitis dorigen
alcohlic.
- Tamb poden ser tils en diagnstic i monitoritzaci de pancreatitis crniques i
altres trastorns, per la seva rellevncia clnica s menor.

Alfa amilasa

- Funci: hidrlisi de glucogen i mido a glcids simples.

- Isoenzims: salival i pancretica.
- Augment en plasma:

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Determinacin de enzimas

o Pancreatitis aguda. Elevaci des del comenament fins al 3-5 dies

devoluci. Valors normals no exclouen pancreatitis. Augment no es
proporcional al dany.
o Altres patologies: obstruccions conducte pancretic, cncer pncrees,
IR, obstrucci intestinal...
o Macro amilasa. Si amilasa en orina es normal o esta disminuda.

- Mtodes de determinaci: per mtodes cintics. Per diferenciar la pancretica

de la salivar mtodes dinhibici selectiva i precipitaci o inactivaci amb Ac de
la salival.
Lipasa
- Funci: hidrlisis de esters de glicerol de cadena llarga.
- Alteracions:
o Augment en pancreatitis aguda. Elevaci des de les 4-8hores fins als 7-
14 dies devoluci. Major sensibilitat i especificitat que lamilasa.
o Disminuci en malalties pancretiques crniques, com fibrosi qustica.
- Mtodes de determinaci: condicions optimes no estan ben definides. Es
mesura la hidrlisi de TG per mtodes turbidimetries o espectrofotomtrics.

4. ENZIMAS ASOCIADAS A PATOLOGAS CARDACAS Y MUSCULARES.

CK
- Nom sencer i altres: Creatina quinasa, creatin-fosfoquinasa (CPK),
creatincinasa, CK total, creatin-quinasa (o kinasa)
- Isoenzims: enzim dimeric amb 2 subunitats diferents (B i M)
o CK1 o CK-BB: teixit cerebral i lintest
o CK2 o CK-MB: cor principalment.
o CK3 o CK-MM: mscul esqueltic principalment
- Augment CK total:
o Lesions en el cor, mscul o cervell. Depn de lisoenzim elevat.
o Causes: IAM, miopaties congnites o adquirides, dany muscular
procediments quirrgics, IR, etc.
- Determinaci: per mtodes cintics.
- Valors de referencia:
o Depenen de la massa muscular.
o Variaci amb sexe, edat, raca, activitat fisica.
o Homes < 190 U/l i dones < 160 U/l.
CKMB
- Localitzaci: principalment al cor. Al cor: 15-20% CK-MB i 80-85%MM
- Augment CK-MB en lesi de miocardi:
o Augment a les 3-6 h de laparici de la lesi.
o Augment mxim a les 12-24h.
o Normalitat a les 24-72h
- Mtodes de determinaci:

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Determinacin de enzimas

o CK-MB massa: tcniques enzim immunolgiques amb Ac monoclonals

especfics. Resultat sexpressa en ng/ml.
o Activitat CK-MB: mtodes dimmune inhibici (Ac monoclonal contra
CK-M). Resultat en relaci CK-MB/CK.
- Fins lany 2000, sutilitzaven com a marcadors bioqumics lactivitat de CK, CK-
MB, AST i LDH.
- La seva amplia distribuci redueix lespecificitat.
- Actualment sutilitzen les troponines cardaques T i I (cTnT i cTnI).
- Noms CK-MB quantificada com a massa mant utilitat diagnstica si no est
disponible la mesura de cTnT. Tamb en el seguiment de linfart de miocardi
subagut.

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