Electroforesis

Purificacin de Protenas

Electroforesis
Es una de las tcnicas ms poderosas para la purificacin de molculas biolgicas. Definicin Electroforesis: transporte de partculas cargadas a travs de un campo elctrico. Basada en la migracin diferencial de las partculas cargadas

Se puede utilizar tanto en escala: Analtica ( ms conocida) Preparativa Aspectos que afectas la separacin: Carga de la protena Tamao de la protena Forma de la protena

Fundamentos Inicialmente se desarrollaba electroforesis en medio lquido, pero se produca dispersin, se requiri de medios que proporcionarn mayor resistencia mecnica, tales como: Celulosa Almidn Agar Poliacrilamida Dichos medios resultan ser: Ms porosos Altamente hidratados Disminuyen los efectos de calor generado
Todo el sistema sumido en un electrolito que sirve como buffer.

La partcula al estar cargada genera capas de iones que la rodean.

ECUACIONES Cada componente se mueve a diferente velocidad, entonces se logra separar la mezcla. Dicha velocidad de movilidad, velocidad de la partcula (v) por unidad de campo elctrico (E), se puede expresar como: Movilidad = v/E = k (pH-pI)/ mw Qu pasa a pH = pI ? Qu protenas se demoran ms en migrar, las grandes o las pequeas? Qu pasa se aplico un campo elctrico muy grande?

USOS A NIVEL ANALTICO Electroforesis se puede utilizar para determinar: Peso molecular de protenas por medio de: Geles nativos (PAGE) Geles denaturantes (SDS-PAGE) Punto isolctrico por geles de isoelectroenfoque Curvas de titulacin por geles de isoelectroenfoque en dos dimensiones Peso molecular y pI por geles en 2D. Actividad de enzimas por zimogramas

SDS-PAGE

Separacin por masa molecular, mw.

KDa KDa

Isoelectroenfoque
Separacin por pI

Protein fractionation in multi-well device using Off-gel isoelectric focusing

P. Michel, F. Reymond, DiagnoSwiss SA, Monthey/CH;I. Arnaud, J. Josserand, H. Girault, Ecole Polytechnique Fdrale de Lausanne/CH; J.S. Rossier, DiagnoSwiss SA, Monthey/CH

Fraccionamiento inicial por pI

Geles 2D
Separacin por pI y mw

Geles 2D automticos
Laboratory system based on a plastic chip for 2D
A. Griebel, S. Rund, W. Drner, R. Konrad, Institut fr Mikrotechnik Mainz GmbH/D

Tamao de una tarjeta de crdito

Sistema Horizontal

Sistema Vertical

Equipos tradicionales de electroforesis analtica

Usos a nivel preparativo

La metodologa de geles en un soporte slido pueden llegar a ser tediosos, dado que se debe cortar el gel y luego eluir la protena, motivo por el cual se han desarrollado otras metodologas como son: Trabajar en medio lquido de pelculas muy delgadas o mediante membranas. Las tecnologas ms utilizadas son: Equipos de flujo libre Equipos de flujo libre ms recirculacin

Equipos de flujo libre

No hay recirculacin del medio Distancias pequeas de migracin o estabilizacin rotacional Equipos Pelculas Delgadas Corriente continua y puntual de muestra sobre el buffer que se mueve en forma vertical entre 2 capas. En la parte lateral estn los electrodos, hay un enfriamiento por refrigerantes

Uso para la separacin de: Clulas Virus Partculas sub-celulares Componentes de membrana

Esquema de un equipo de electroforesis de flujo continuo en una celda de electroforesis

Electroforesis anular

Cilindro externo gira hasta 150 rpm (lento) para neutralizar los efectos convectivos radiales.

Equipos de flujo libre con recirculacin Celdas tipo tambor Presenta compartimientos separados por discos de membranas de polister con poros de 10 mm, opera con gradiente de pH, la descarga es por vaco. Pelcula delgada con recirculacin Se realizan ciclos de la muestra que ingresa en diferentes canales como un isoelectroenfoque.

Procesos Integrados

- Cromatografa de Lecho expandido -Cromatografa Anular Plana

Cromatografa de Lechos Expandidos El proceso consiste esencialmente de 6 etapas a) Se tiene el lecho almacenado b) Se estabiliza el lecho expandido a un determinado nivel c) Se equilibrio el lecho con buffer d) Se carga el caldo directo de la fermentacin e) Se lava el lecho f) Eluye y regenera el lecho

Cromatografa de Lechos Expandidos

Etapas de estabilizacin y equilibrio

Etapas de carga del caldo

Condiciones
Se debe purificar un producto extracelular.
El caldo se inyecta directamente a la columna, se ahorran las etapas de: Separacin de clulas Concentracin Purificacin

Cromatografas Continuas: Cromatografa Anular Idea:

Inyectar continuamente la muestra

Condiciones
Inyectar continuamente la muestra, reemplaza a los carruseles de columnas.

Cromatografa de Afinidad en membrana Etapa 1 se carga la membrana

Membrana de afinidad

Efluente Libre de clulas y productos de inters

Cromatografa de Afinidad en membrana Etapa 2 se eluye la protena adsorbida

Buffer de elucin
Membrana de afinidad

Eluye slo la protena de interes que estaba adsorbida en la membrana

Detalles de un sistema integrado

Detalles de la membrana

Retentate Filtrate Feed

h

Membrane

Membrane

Feed Filtrate

Retentate

Resultados de la Integracin
Evaluacin de los niveles de recuperacin
Muestra desde el Bioreactor

0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 -0.01
Abs (280 nm)

0.09 0.04 -0.01

0 10 20 30 Elution time (min)

Abs (280 nm)

10 20 30 Elution time (min)

Elucin ciclo 2

Elucin ciclo 3

Castilho LR, Anspach FB, Deckwer WD (2002), An integrated process for mammalian cell perfusion cultivation and product purification using a dynamic filter. Biotechnol. Prog., 18, 776-781.

Condiciones
Se debe purificar un producto extracelular.
El caldo se inyecta directamente a la columna, se ahorran las etapas de: Separacin de clulas Concentracin Purificacin

Se puede trabajar a flujos altos pues la membrana es resistente

Electrofiltracin
Filtracin a la que se le aplica un campo elctrico, La torta se minimiza y el proceso es ms rpido

Tradicional

Electrofiltracin

Tecnologa de purificacin magntica para protenas inmovilizadas

La idea consiste en inmovilizar la protena a partculas que tengan propiedades magntica.

Posteriormente, las partculas magnticas son atrapadas en un campo elctrico, quedando solo ellas retenidas y el resto de las especies de la mezcla son eliminadas.

Por ultimo, se desorben las protenas desde las partculas magnticas.

Diagrama general

Nuevos Materiales Cromatogrficos

Monolith Separation Technology http://www.monoliths.com/

Soporte Monolith: Materiales son una sola pieza, altamente interconectada con grandes y pequeos canales.

Ventajas
Tiempos cortos de separacin Sitios activos fcilmente accesibles

Altas capacidades para molculas grande

Varios tipo de cromatografa: Intercambio Inico, Filtracin por geles

Columnas, Discos

USOS Filtracin por Geles

Normalmente se trabajan a flujos < 1.0 ml/min
Nuevos materiales Flujos = 5 ml/min