Unidad 1 – Laboratorios de biología molecular y citogenética

1.1. Biología molecular y citogenética

La biología molecular es la parte de la biología que estudia la composición, estructura y función de las
moléculas biológicamente importantes, así como de los procesos en los que están implicadas.
Englobaría principalmente el estudio de ácidos nucleicos y proteínas. Sin embargo, el vertiginoso
desarrollo de nuevas técnicas y metodologías para el estudio de ambas macromoléculas ha provocado la
especialización de los laboratorios y la separación conceptual de ambos tipos de estudios:

• El término biología molecular se reserva para el estudio de los ácidos nucleicos.

• El estudio de proteínas se realiza en laboratorios de proteómica.

Por otro lado, la citogenética se ha considerado, clásicamente, como la parte de la genética que estudia
la estructura, función y comportamiento de los cromosomas en metafase.
En la actualidad, tanto el laboratorio de biología molecular como el laboratorio de citogenética se
consideran laboratorios de genética en los que se van a realizar técnicas de alta complejidad, que
requieren un equipamiento especializado y costoso y con un problema común: la contaminación. Por ello,
ambos laboratorios se estructuran en dos áreas de trabajo perfectamente separadas: áreas «sucias» y
áreas «limpias», entre las que no ha de ser posible el cruce de materiales para intentar minimizar el riesgo
de contaminación.
1.2. El laboratorio de biología molecular
La técnica básica que se lleva a cabo en un laboratorio de biología molecular es la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR).
Al ser considerada como la herramienta molecular por excelencia, la estructuración del laboratorio, los
flujos y las formas de trabajo se van a organizar alrededor de esta técnica.
Se trata de una técnica de laboratorio que nos permite, a partir de una cantidad mínima de una molécula
ADN, obtener millones de copias iguales de esta. Veremos que este proceso se llama amplificación de
ADN.
1.2.1. El equipamiento
Tanto en el laboratorio de biología molecular como en el de citogenética y cultivos celulares se puede
hablar de dos tipos de equipamientos:
• Un equipamiento específico.
• Un equipamiento genérico.
Equipamiento específico
El equipamiento específico del laboratorio de biología molecular es el que permite realizar las técnicas
exclusivas de este tipo de laboratorio.
Este equipamiento cuenta con una infraestructura principal, necesaria para la realización de la PCR y
para el análisis de los productos de amplificación que se obtienen. Consta de:
• El termociclador.
• El equipo de electroforesis.
• El documentador de geles.
También forman parte los aparatos automáticos necesarios para la realización de procesos específicos,
como son:
• La extracción de ácidos nucleicos.
• La secuenciación de los fragmentos que son objeto de estudio. Esta función la cumplen los
aparatos denominados secuenciadores.
Termociclador
El termociclador es el aparato en el que se lleva a cabo la PCR. Es un aparato básico en cualquier
laboratorio de biología molecular.
Permite realizar secuencialmente un número elevado de ciclos repetitivos programables con temperaturas
diferentes y distintos tiempos de incubación, controlados por un microprocesador. Las partes más
destacables del termociclador son:
• El bloque incubador → Es la parte más importante. Se trata de un soporte metálico, con múltiples
pocillos para colocar los tubos de reacción de PCR. Es capaz de mantener de manera homogénea,
en todo su volumen, durante los tiempos que se requiera, las distintas temperaturas que se
programan para cada fase y en cada uno de los ciclos de PCR. El rango de temperaturas que
pueden alcanzar estos bloques normalmente va de 4 a 96 °C. Los distintos modelos de
termocicladores que existen se diferencian principalmente en la tecnología que utilizan para
calentar y enfriar este bloque:
o Sistemas de aire caliente y frío o resistencias eléctricas (es el sistema utilizado en los
aparatos más antiguos).
o Materiales semiconductores en conjunción con el efecto Peltier (son los termocicladores
más actuales).
• La tapa del bloque incubador → Es una tapa termostatizada a 102-105 °C que, una vez cerrada,
entra en contacto directo con la tapa de los tubos de reacción. Esto evita que el agua de la mezcla
de reacción PCR se evapore por efecto de las temperaturas alcanzadas en el bloque incubador y
se condense en la tapa, más fría, con la consiguiente concentración de los reactivos en la mezcla
que alteraría el desarrollo de la reacción.
Un tipo especial de termociclador es el termociclador a tiempo real. Este modelo, además de los
componentes descritos para el termociclador convencional, incorpora un sistema de láser y detección de
fluorescencia, capaz de excitar y medir la fluorescencia emitida por cada tubo de reacción
individualmente. Esta tecnología permite detectar la síntesis de productos de amplificación en tiempo real.
El equipo de electroforesis
El equipo de electroforesis sirve para separar moléculas de ácidos nucleicos de distintos tamaños. Se
lleva a cabo en el laboratorio de biología molecular y precisa de un equipo específico.
Permite, por ejemplo, analizar los productos amplificados en una PCR o purificar y obtener fragmentos de
tamaños concretos de ADN.
La electroforesis se lleva a cabo aplicando un campo eléctrico en una disolución tampón (pH 7,5-7,8) en
la que se sumerge una matriz que contiene las muestras de ácidos nucleicos. Estos migran con mayor o
menor velocidad a través de la matriz en función de la carga neta que poseen (negativa a ese ph), su
tamaño y su conformación tridimensional.
La matriz que se utiliza es un gel de agarosa o de poliacrilamida. El uso de uno u otro y la concentración
de los componentes dependerá del tamaño de las moléculas que queremos separar y de la resolución
que queramos obtener.
La localización final de los ácidos nucleicos en el gel se realiza con un agente intercalante fluorescente
como el bromuro de etidio.
El equipamiento que permite efectuar la electroforesis consta de:
• Soporte plástico o «cama» donde solidificar el gel.
• Cubeta de electroforesis. Se compone de:
o Un soporte central para la «cama» con el gel.
o Dos zonas de depósito de tampón de electrofore-sis en cada uno de los extremos.
o Electrodos positivo y negativo en cada extremo.
 • Fuente de alimentación que suministre corriente eléctrica continua a la cubeta de electroforesis.
Debe permitir seleccionar voltaje o amperaje y graduar su intensidad.
Matrices utilizadas en la electroforesis de ácidos nucleicos
• Los geles de agarosa (entre 0,5 y 2%) se utilizan para separar fragmentos de mayor tamaño,
permitiendo electroforesis rápidas pero con resolución limitada.
• Los geles de poliacrilamida se utilizan para separar moléculas de menor tamaño y mayor poder
de resolución.
Documentador de geles
Después de terminar la electroforesis se podrán visualizar los resultados mediante la utilización del
documentador de geles.
El documentador de geles es un equipo que permite visualizar las bandas de ácidos nucleicos en el gel
después de la electroforesis y obtener una fotografía de él.
Este equipo consta, básicamente, de:
• Un transiluminador → Consiste en una fuente de luz ultravioleta (UV) (con una longitud de onda
de entre 245-365 nm) situada por debajo de una superficie que deja pasar las radiaciones UV
donde se coloca el gel. Cuando la luz UV ilumina el gel, el agente intercalante emite fluorescencia,
visualizándose las bandas correspondientes a las moléculas de ácidos nucleicos.
• Una cámara fotográfica → La visualización del gel se realiza con una cámara fotográfica
(integrada en la parte superior de la cámara oscura), adecuada para trabajar con luz UV y
controlada por un software especifico. Con esta cámara es posible visualizar el gel en la pantalla
de un monitor, mejorar las condiciones de la imagen, obtener fotografías y realizar mediciones.
Equipamiento genérico
El equipamiento genérico es común con otro tipo de laboratorios, aunque algunos aparatos puedan tener
características o adaptaciones especiales para aplicaciones concretas de biología molecular. En este
sentido, cabe destacar los siguientes equipamientos:
• La cabina de bioseguridad → En los laboratorios de biología molecular se deben utilizar cabinas
de flujo laminar vertical de clase II, que protegen de contaminación a la muestra, a la persona
manipuladora y al medio ambiente. Su utilización es particularmente importante cuando se trabaja
con ARN (extracción y purificación de ARN, preparación de reactivos, manipulación de las
muestras con ARN, etc.), puesto que las ARNasas son omnipresentes y pueden degradar el ARN
de una muestra rápidamente. Son también imprescindibles si se trabaja con cultivos celulares.
• El sistema de purificación de agua → El laboratorio de biología molecular requiere un suministro
estable de agua purificada tipo II y agua ultrapura tipo I. En el mercado hay muchos equipos de
purificación de agua basados en distintas tecnologías. como electrodesionización resinas de
intercambio iónico, ósmosis inversa, filtración etc. La elección de uno u otro dependerá del
consumo diario de ambos tipos de agua. Cuando el consumo de ambos tipos de agua es muy
bajo, se pueden adquirir como si se tratara de un reactivo más.
• El espectrofotómetro → La medida de la concentración de ácido nucleico de una muestra y de
su pureza requiere lecturas de absorbancia en un rango de longitudes de onda comprendidas
entre 230 y 320 nm, por lo que se requiere un espectrofotómetro que cubra ese rango. Dado que
en ocasiones la cantidad de muestra es muy pequeña, se han diseñado espectrofotómetros
específicos para cuantificar ácidos nucleicos que utilizan cantidades mínimas de muestra (1 ul)
basados en cubetas capilares.
• Microscopio de luz transmitida y fluorescencia → En biología molecular, un microscopio de
fluorescencia es imprescindible para interpretar las técnicas de hibridación in situ fluorescente
(FISH). Debe estar dotado con los filtros de fluorescencia adecuados para los fluorocromos
utilizados y es aconsejable que tenga un sistema de captación de imágenes.
 • Autoclave → Es imprescindible si se trabaja con microorganismos y aconsejable en cualquier
caso. Aunque la casi totalidad del material fungible que se utiliza en el laboratorio se puede adquirir
estéril, la utilización del autoclave puede disminuir en gran medida los costes de las tareas del
laboratorio.
• Incubador o estufa → Las características de los incubadores que se usan en el laboratorio de
biología molecular dependen de las muestras que se estudien y de las técnicas que se apliquen.
Si se trabaja con bacterias se necesitarán estufas de cultivo de microbiología. Si se trabaja con
cultivos celulares se requerirán incubadores con CO, y humedad controlada.
• Baño termostático, termobloque y placa calefactora → Esta clase de equipamiento con
temperatura regulable es básico para realizar todo tipo de incubaciones, digestiones y tratamientos
enzimáticos. La placa calefactora, en concreto, es importante que pueda alcanzar de manera
homogénea y estable temperaturas de 95-100 °C para desnaturalizar el ADN de células y tejidos
en las técnicas de hibridación in situ.
• Centrífuga y microcentrífuga → Las centrífugas y microcentrífugas tienen que tener rotores que
permitan centrifugar desde tubos de 50 ml a Eppendorf de 0,2 ml. Lo ideal es que alguna sea
refrigerada.
• Neveras y congeladores de -20 y -80 °C → Una infraestructura de frío con neveras y
congeladores es fundamental para conservar los reactivos y las muestras:
o La mayor parte de los reactivos (sobre todo las enzimas) se conserva а - 20 °C.
o La conservación de todas las muestras de ARN y el almacenamiento a largo plazo de
muestras de ADN debe realizarse a -80 °C.
• Otros equipamientos → En este apartado se puede incluir equipamiento básico de cualquier
laboratorio, como balanza para pesar reactivos, agitadores magnéticos para preparación de
reactivos, vórtex para homogeneizar muestras y reactivos, pHmetro, etc.
1.2.2. La estructura del laboratorio
Como ya se ha comentado, la estructura del laboratorio de biología molecular está condicionada por la
técnica principal que se realiza. La realización de una PCR implica:

• Preparación de reactivos.

• Extracción y purificación de ADN de una muestra biológica.

• Reacción de amplificación propiamente dicha.

• Análisis de los productos de la reacción mediante electroforesis y documentación del gel.

Cada una de estas actividades debe realizarse en un área de trabajo independiente, físicamente
separadas en salas distintas y cada una con su propio equipamiento y material de trabajo, de manera que
estos no puedan ser intercambiables entre ellas. En consecuencia, un laboratorio de biología molecular
debe constar, como mínimo, de cuatro salas independientes:

• Sala de preparación de reactivos → Se considera que esta es el área «limpia»del laboratorio

(sin ADN). En ella se preparan todos los reactivos que se van a utilizar en el laboratorio, incluyendo
la mezcla de reacción de PCR. Es fundamental que los reactivos no se contaminen con ADN por
ello esta sala debería tener una ligera presión positiva, para evitar la entrada de cualquier fuente
de contaminación y es imprescindible que disponga de una cabina de bioseguridad.

• Sala de preparación de muestras y extracción de ADN → Esta es una sala «sucia» (con ADN),
por lo que sería conveniente que tuviese una ligera presión negativa, para evitar que pueda
escaparse material contaminante. Debe contar con una cabina de bioseguridad y un
espectrofotómetro.
 • Sala de PCR → Dispone de los termocicladores
necesarios para llevar a cabo la PCR y un
espacio de trabajo para añadir las muestras de
ADN a la mezcla de reacción.

• Sala de post-PCR → Dispone de los equipos de

electroforesis y de documentación de geles. Esta
es también una sala «sucia», fuente importante
de contaminación por productos amplificados, por
lo que también debería tener una ligera presión
negativa. En situaciones ideales la
documentación de geles puede situarse en una
sala oscura junto con el microscopio de fluorescencia.
1.2.3. El flujo de trabajo
La estructura parcelada del laboratorio de biología molecular en salas no es condición suficiente para
garantizar el objetivo de que los resultados de las PCR sean fiables. Es necesario que el personal técnico
sea consciente de la extremada facilidad con la que se puede producir la contaminación de las muestras
problema y por ello hay que tener muy presente el flujo de trabajo.
El flujo de trabajo marca el sentido único de los procesos en el
circuito de trabajo. En el laboratorio de biología molecular, el
flujo de trabajo y de las muestras debe ser siempre
unidireccional, desde las áreas limpias hacia las sucias, en el
sentido único hacia delante: pre-PCR → PCR → post-PCR.
Este flujo implica y pone de manifiesto la necesidad de que
cada área de trabajo sea autónoma, en el sentido de que debe
disponer de su propia infraestructura básica (cabinas,
centrífugas, baños, neveras, etc.) y del material de trabajo,
pues no es posible el intercambio entre las distintas salas.
El material de trabajo son las micropipetas automáticas, los equipos de protección individual (guantes,
batas desechables, gafas de protección, etc.) o el material fungible (tubos, Eppendorf, gradillas, pipetas
desechables, puntas de pipeta, rotuladores, etc.) y, por supuesto, se debe evitar el retorno de cualquiera
de ellos de las áreas «sucias» a las áreas «limpias».
1.2.4. Las condiciones de trabajo
Es evidente que en el laboratorio de biología molecular se aplican las normas y restricciones de buenas
prácticas genéricas que imperan en cualquier laboratorio, como la prohibición de comer, beber, fumar,
maquillarse, etc.
Pero también hay que establecer unas condiciones de trabajo específicas, que se establecen con miras
a impedir, o cuando menos minimizar, la contaminación de las muestras y que consisten en unas normas
para la manipulación de materiales y reactivos en condiciones de esterilidad, como la técnica aséptica.
La contaminación de las muestras
En este contexto, el término contaminación hay que entenderlo en su significado más amplio, como la
introducción accidental en la muestra de material exógeno que altera su pureza. Esta contaminación
causa resultados erróneos o no interpretables. En este sentido, los dos tipos de contaminantes más
peligrosos son:

• Los ácidos nucleicos extraños a la muestra.

• Las enzimas no deseadas que degradan ácidos nucleicos (nucleasas).

Las fuentes de contaminación puden ser muy variadas:
• Contaminación cruzada por:
 o Material no amplificado del medio ambiente o microorganismos ambientales. Es el caso de
los aerosoles generados durante la manipulación de las muestras, como pipeteos, apertura
de tubos Eppendorf, centrifugación, etc.
o Contaminantes procedentes del propio personal técnico de laboratorio. Como pueden ser
células de descamación de la piel, pelo, guantes contaminados, etc.
o Contaminantes de las superficies de trabajo. Son los que se acumu-lan sobre las
superficies de trabajo.
• Contaminación por productos amplificados generados mediante PCR en el propio laboratorio
(carryover en la terminología inglesa)
• Contaminación de los reactivos comerciales y del material fungible.
Esto es debido a que la mayoría de los fabricantes garantizan la esterilidad de sus productos, pero
esto no es sinónimo de ausencia de ADN o nucleasas. El término estéril significa ausencia de
microorganismos viables, pero algunos métodos de esterilización no garantizan la eliminación del
ADN de los microorganismos ni la inactivación de las enzimas, sobre todo las ARNasas.
Normas para la manipulación de materiales y reactivos
Una vez identificadas las fuentes de contaminación, hay que intentar anularlas o prevenirlas. Algunas de
las medidas más importantes, como la separación física de las áreas de trabajo y el flujo unidireccional
entre ellas, ya han sido señaladas.
La contaminación de reactivos y material fungible por nucleasas se puede evitar utilizando sólo aquellos
que estén certificados como libres de nucleasas. La posible contaminación por ADN no se puede controlar,
por lo que es importante llevar un control exhaustivo de los reactivos (lotes, fechas de apertura, fechas
de caducidad, alicuotación) y realizar controles negativos en todas las técnicas.
Pero una de las condiciones de trabajo más importantes para prevenir la contaminación consiste en el
uso de buenos hábitos de trabajo en condiciones de esterilidad basados en la técnica aséptica.
Técnica aséptica
El concepto de técnica aséptica en los
laboratorios de biología molecular se entiende
como el conjunto de actividades encaminadas a
prevenir la contaminación por microorganismos,
ácidos nucleicos y nucleasas Muchas de estas
actividades cumplen un doble objetivo: prevenir
la contaminación de la muestra y evitar la
contaminación del trabajador por productos
biológicos y químicos peligrosos. Las más
importantes son:
• Lavado de manos → El lavado frecuente de manos es la norma de higiene básica cuando se
manipulan muestras biológicas y reactivos químicos, independientemente de que se usen
guantes.
• Uso de equipos de protección individual (EPI) → Los principales equipos de protección
individual son guantes sin talco y batas. El uso de guantes debe compaginarse con prácticas de
trabajo que impidan su contaminación con las muestras manipuladas.
• Descontaminación de superficies → La limpieza y descontaminación de las superficies de
trabajo se pueden realizar por métodos físicos, como la irradiación con luz UV o por métodos
químicos, como el lavado con soluciones de hipoclorito sódico al 10% o descontaminantes
comerciales (DNA Zap, DNA Remover, DNA Away, etc.).
• Prevención de carryover → La contaminación por productos amplificados es un serio problema
en laboratorios de diagnóstico que amplifican continuamente las mismas secuencias diana en un
 número muy elevado de muestras, puesto que la contaminación con cantidades muy pequeñas
de estos productos es suficiente para producir falsos positivos.
• Prevención de contaminación ambiental → Para prevenir la contaminación cruzada ambiental
es imprescindible el uso de:
o Cabinas de bioseguridad de clase II
o Puntas de micropipeta especiales → Evitan la contaminación de las pipetas automáticas
por aerosoles producidos al aspirar los fluidos.
Estas puntas de pipeta pueden ser de dos tipos
→ De desplazamiento positivo → Tienen en su interior un émbolo o pistón que las
convierte en auténticas microjeringas. Las pipetas que las utilizan tienen un vástago
que encaja en el émbolo, el cual sube y baja en el interior de la punta succionando
y expulsando el fluido, sin que este toque en ningún momento el cuerpo de la pipeta
ni se produzcan aerosoles.
→ Puntas con filtro → Son las más utilizadas. Tienen un filtro en su interior que
impide que los posibles aerosoles alcancen el cuerpo de la pipeta.
1.2.5. El uso eficiente de los recursos
El de biología molecular es un laboratorio muy especializado con unos elevados costes, por lo que para
una eficiente gestión de los recursos es imprescindible implantar y desarrollar estándares e indicadores
de calidad que permitan comprobar que todo funciona correctamente. Lo ideal es que el laboratorio esté
certificado por una empresa acreditadora para el cumplimiento de la norma de calidad ISO vigente en
cada momento. En cualquier caso, el uso eficiente de los recursos debería contemplar los siguientes
puntos mínimos:
• Equipamiento e infraestructuras → Se debe contar con un plan de mantenimiento (diario,
semanal, mensual, etc.) y de revisiones técnicas periódicas. El mantenimiento debe incluir las
calibraciones, si se requieren y la limpieza de los equipos.
• Reactivos. Hay que asegurar la trazabilidad de los reactivos, desde su recepción hasta su
consumo o eliminación por caducidad. Esto implica registros de entrada, control de lotes y
caducidades y almacenamiento correcto.
• Recursos humanos → Todo el personal de nueva incorporación debe recibir el adiestramiento
adecuado a las funciones que vaya a desempeñar, así como en materia de seguridad y gestión
de residuos. Se debe diseñar también un plan de formación continuada para adecuar los
conocimientos del personal de laboratorio a la rápida evolución que están experimentando las
tecnologías y procedimientos utilizados en biología molecular.
• Técnicas → Todos los procedimientos técnicos deben estandarizarse mediante procedimientos
normalizados de trabajo que incluyan todos los aspectos de la técnica, desde la recepción de
muestras hasta la emisión de informes, si procede, con especificación de los controles necesarios.
En los laboratorios de diagnóstico, además, es imprescindible una buena comunicación con los
clínicos solicitantes de las pruebas, para evitar repeticiones y solicitudes inadecuadas.
• Gestión medioambiental → El laboratorio debería contar con un código de buenas prácticas
medioambientales para reducir los consumos de agua, electricidad y papel y garantizar el correcto
reciclado de los residuos de tipo urbano.
1.3. El laboratorio de citogenética y cultivos celulares
Para clarificar los conceptos a que nos referiremos, tenemos que establecer, desde el principio, la
diferenciación entre dos tipos de laboratorios:
• El laboratorio de cultivos celulares tiene como objetivo la propagación o crecimiento de células
eucariotas de organismos pluricelulares en medios de cultivo artificiales en condiciones
controladas.
 • El laboratorio de citogenética tiene como objetivo el estudio de los cromosomas de especies
eucariotas. Centrándonos en el campo de la medicina, el laboratorio de citogenética humana se
dedica al estudio de los cromosomas humanos, tanto desde una perspectiva morfológica
(cariotipo), como molecular (citogenética molecular).
Aunque, en virtud de sus respectivos objetivos, se puede suponer que ambos tipos de laboratorios son
muy diferentes, la realidad es que tienen muchos puntos en común, tanto en estructura como en
equipamiento y condiciones de trabajo.De hecho, el laboratorio de citogenética se puede considerar como
una ampliación especializada del laboratorio genérico de cultivos celulares que engloba:
• Un área de cultivo celular enfocada a la obtención de células en mitosis.
• Un área de genética que está enfocada al estudio de los cromosomas metafásicos.
Por supuesto, en ambos tipos de laboratorios se debe implantar una política de calidad para el uso
eficiente de los recursos similar a la descrita para los laboratorios de biología molecular.
Dado que el laboratorio de citogenética engloba más tecnologías y presenta mayor complejidad que el de
cultivos celulares, vamos a referirnos a él principalmente para describir el equipamiento, la estructura y
las condiciones de trabajo.
1.3.1. El equipamiento
El laboratorio de citogenética requiere, por un lado, equipamiento específico para realizar cultivos
celulares, por otro lado, equipamiento específico para técnicas de citogenética y, finalmente, equipamiento
común a otros laboratorios
Equipamiento específico para cultivos celulares
El equipo específico para cultivos celulares consta de una cabina de flujo laminar un incubador de CO, (o
un incubador roller), un microscopio invertido y un equipo de criogenia.
Cabina de flujo laminar
La cabina de flujo laminar es la infraestructura en el interior de la cual se realizan todos los procesos y
manipulaciones de cultivos celulares: preparación de medios, siembra de los cultivos, cambios de medio,
sub-cultivos, etc.
La cabina adecuada para cultivos celulares es la cabina de seguridad biológica de clase Il, que previene
la contaminación del cultivo y protege al trabajador y al medio ambiente.
Consta de los siguientes elementos:
• Un panel frontal transparente, que contribuye a mantener la estabilidad del flujo laminar en el
interior.
• Una rejilla frontal, que genera una corriente entrante de aire que impide el escape de posibles
contaminantes por la ventana de trabajo.
• Un sistema mecánico que impulsa el aire entrante y el aire recirculariza-do hacia la parte superior
de la cabina.
• Un filtro HEPA de gran superficie, que forma el techo de la cabina. Parte del aire impulsado por
el sistema mecánico (70% en las cabinas IlA y 30% en las cabinas IIB) se fuerza a pasar a través
de este filtro, generando un flujo laminar estable libre de partículas y microorganismos. (Doc. 1.4)
• Un segundo filtro HEPA, más pequeño que el anterior y situado por encima de este, por el que
se elimina al exterior el resto del aire impulsado por el sistema mecánico.
Incubador de CO
El incubador de CO, es el aparato que proporciona las condiciones ambientales óptimas para el
crecimiento de las células en el medio de cultivo. Consta de los siguientes dispositivos:
• Control de temperatura, responsable de fijar y mantener estable la temperatura óptima para cada
tipo de cultivo.
 • Recircularización del aire interior, para homogeneizar la temperatura.
• Control de CO,. El CO, puro se suministra comprimido en botellas presurizadas y este dispositivo
lo mezcla con aire en la proporción adecuada (4-7%) y lo inyecta en el interior del incubador.
• Control de humedad. En el interior del incubador se requiere una humedad ambiente elevada
para evitar la evaporación del medio de cultivo. En los incubadores más sencillos se consigue
simplemente colocando una bandeja con agua en el suelo del incubador. Sin embargo, esta
solución no es la ideal por la facilidad con la que se contamina esa agua. Por ello, los incubadores
actuales incorporan un dispositivo de control de humedad que inyecta agua estéril.
Microscopio invertido
El control del crecimiento de un cultivo se realiza por observación microscópica directa. Ahora bien, el
tamaño de los frascos de cultivo impide la utilización de un microscopio óptico convencional y por ello se
recurre a un microscopio invertido.
El microscopio invertido se caracteriza por tener invertidas la posición de la fuente de luz (por encima de
la platina) y el revólver de objetivos (por debajo de la platina) respecto de un microscopio convencional.
Lo ideal, además, es que el microscopio esté equipado con un sistema de contraste de fases para facilitar
la visualización de las células en crecimiento, ya que se trata de estructuras vivas, transparentes y sin
coloración.
Equipo de criogenia
El equipo de criogenia permite conservar a largo plazo y en forma viable muestras de células y líneas
celulares.
El equipo de criogenia mínimo está constituido por un tanque o depósito de nitrógeno líquido. Se puede
ampliar con una nodriza para rellenar el tanque o con una instalación que conecte con un suministro
centralizado de nitrógeno. Es un equipamiento imprescindible en los laboratorios de cultivos celulares y
optativo en los de citogenética.
Equipamiento específico para citogenética
En el equipo específico para citogenética son fundamentales:
• Equipo de análisis de imagen. Es básico para documentar y analizar metafases, con el fin de
obtener un cariotipo. Consta de los siguientes elementos:
• Microscopio óptico convencional de luz transmitida, para visualizar las metafases teñidas con
técnicas de bandeo.
• Cámara digital, para obtener imágenes de las metafases para su posterior análisis.
• Software específico para análisis de metafases. Existen varios programas informáticos
comerciales que analizan las metafases, cromosoma a cromosoma, permitiendo su
reconocimiento con base en el patrón de bandas y su emparejamiento para obtener el cariotipo.
• Microscopio óptico convencional y de fluorescencia. Debería ser un microscopio distinto al
del análisis de imagen. Se utiliza para recuentos de células, estudios de viabilidad y morfología
celular, visualización de preparaciones de hibridación in situ fluorescente, etc.
Equipamiento común
Entre el equipamiento común de los laboratorios de citogenética y cultivos celulares es habitual encontrar:
• Un equipo de esterilización. La esterilidad de todo el material y de los reactivos que estén en
contacto con los cultivos es imprescindible. Por esta razón, estos laboratorios deberían contar con
un equipo de esterilización compuesto por un autoclave para esterilizar todo tipo de material y un
sistema de filtración con filtros de 0,22 um para esterilizar soluciones.
• Un sistema de purificación de agua. El agua utilizada para preparar reactivos y medios de cultivo
tiene que ser ultrapura, estéril y libre de apirógenos.
 • Nevera y congeladores de -20 y -80°C. Un sistema de frío es necesario para conservar a las
temperaturas adecuadas los distintos reactivos empleados en el laboratorio.
• Otros equipamientos (Centrífugas, placa calefactora si se hace hibridación in situ, pHmetro,
balanza, agitador magnético, pipeteadores automáticos, etc).
1.3.2. La estructura del laboratorio
Al igual que en el laboratorio de biología molecular, la prevención de la contaminación condiciona la
estructura de los laboratorios de citogenética. Por eso, en estos laboratorios también se aplica el criterio
de la separación física de áreas «limpias» y «sucias». Así, un laboratorio de citogenética completo debe
estructurarse como mínimo en tres salas:
• Sala de cultivos → Es la sala «limpia» del laboratorio, en la que se van a realizar todos los
procedimientos directamente relacionados con el cultivo celular. Debe estar situada en una zona
tranquila, alejada de vías de paso habituales para evitar turbulencias. Lo ideal es que esté dotada
de un sistema que le suministre aire filtrado y una ligera presión positiva, para que el aire ambiente
esté, en lo posible, libre de microorganismos. En esta sala se dispondrán las cabinas de flujo
laminar, los incubadores y el microscopio invertido.
• Sala de laboratorio convencional → Es la sala sucia, con el resto de equipamiento, excepto el
equipo de criogenia. En esta sala se van a realizar todos los procedimientos que no están
directamente relacionados con el cultivo celular, como la preparación de extensiones, tinciones,
cariotipos, citogenética molecular, etc. Esta área puede tener una zona oscura para el microscopio
de fluorescencia.
• Sala de frío, con los congeladores y el equipo de criogenia → Esta sala debe estar separada
de la sala de cultivos, porque los congeladores generan bastantes turbulencias. Suele ser una
cámara frigorífica, para minimizar el consumo de nitrógeno líquido y alargar la vida de los
congeladores.
1.3.3. Las condiciones de trabajo técnica aséptica
Los hábitos de trabajo en los laboratorios de citogenética y cultivos celulares están totalmente
condicionados por la prevención de la contaminación.
En este sentido, las condiciones de trabajo en la sala de cultivos se ajustan a una estricta técnica aséptica
que impida la contaminación de los cultivos por microorganismos, por eso, todas las manipulaciones se
realizan dentro de la cabina de flujo laminar.
Entre las normas más importantes, que afectan también al protocolo de trabajo en la cabina de flujo
laminar, se pueden citar las siguientes:
• Lavado frecuente de manos.
• Uso de guantes y batas desechables estériles.
• La puerta de la sala siempre debe estar cerrada.
• Uso exclusivo de material y reactivos estériles. El material desechable estéril no es intercambiable
con el de otras salas.
• No introducir mecheros Bunsen en las cabinas porque generan turbulencias que alteran el flujo
laminar.
• Colocar en el interior de la cabina exclusivamente el material que se vaya a utilizar en la sesión
de trabajo.
• No sacar el material estéril de su embalaje hasta el momento de uso, evitando tocar con él
cualquier superficie.
 • El material usado reutilizable de vidrio se puede colocar en un recipiente con hipoclorito al 10%
hasta finalizar la sesión de trabajo. Después se lleva al laboratorio general para su limpieza y
esterilización.
• El material fungible utilizado en la cabina se deposita en contenedores adecuados para material
contaminado, que se retiran al finalizar la sesión de trabajo.
• Restringir el acceso a la sala de cultivos exclusivamente al personal que esté realizando algún
procedimiento. No se deben recibir visitas en esta Sala.
• Limpieza de las cabinas de flujo laminar con etanol al 70% o desinfectante comercial apropiado
para cabinas al finalizar cada sesión de trabajo.
• En las cabinas dotadas de lámpara germicida UV, esta se puede conectar, como mínimo, 30
minutos después de la limpieza
• Realizar un mantenimiento programado de las cabinas, como mínimo anualmente, que incluya
comprobación del filtro HEPA
• Limpieza y desinfección de superficies con etanol al 70% o desinfectantes apropiados.
Por supuesto, son también de aplicación todas las normas básicas de trabajo aplicables a cualquier
laboratorio.
1.4 La seguridad en el laboratorio
El diseño de los laboratorios responde al criterio de prevenir la contaminación de las muestras, pero
también a criterios de seguridad.
La seguridad en los laboratorios de biología molecular, citogenética y cultivos celulares hace referencia
a la prevención de la exposición de personal a agentes nocivos y también a impedir la liberación de estos
al exterior.
En función de la naturaleza de estos agentes, la seguridad puede ser:
• Biológica o bioseguridad. Trata de la prevención ante agentes patógenos y toxinas.
• Química. Para la prevención a la exposición de agentes químicos.
1.4.1. Bioseguridad
La bioseguridad de un laboratorio engloba todas las normas, técnicas, prácticas y hábitos de trabajo que
intentan evitar la exposición accidental (no intencionada) del personal a agentes biológicos
potencialmente peligrosos (patógenos y toxinas) o su liberación al medio ambiente.
En este sentido, cualquier muestra biológica debe considerarse como potencialmente peligrosa y deben
adoptarse las medidas mínimas de protección en lo que hace referencia al uso de EPI.
En los laboratorios de biología molecular, el principal problema de bioseguridad lo plantea el trabajo con
microorganismos en general y con organismos modificados genéticamente (GMO), en particular. El Real
Decreto 178/2004, de 30 de enero, por el que se aprueba el Reglamento General para el Desarrollo y
Ejecución de la Ley 9/2003, de 25 de abril, por la que se establece el régimen jurídico de la utilización
confinada liberación voluntaria y comercialización de organismos modificados genéticamente, en su
artículo 12, clasifica las actividades de utilización confinada de los GMO en cuatro tipos en virtud del
riesgo para la salud humana y el medio ambiente:
• Tipo 1: riesgo nulo o insignificante.
• Tipo 2: riesgo bajo.
• Tipo 3: riesgo moderado.
• Tipo 4: riesgo alto.
Esta valoración del riesgo hay que hacerla siguiendo los criterios que establece el propio RD (Anexo l)
donde se describen los elementos que se deben tener en cuenta y el procedimiento que se aplica para
realizar la evaluación del riesgo.
También establece (Anexo ll) las medidas de protección y confinamiento mínimas según el tipo de
actividades desarrolladas en el laboratorio.
En los laboratorios de citogenética y cultivos celulares se deberían aplicar como mínimo las medidas de
protección y contención de tipo 2, excepto que se trabaje con microorganismos con un riesgo superior.
1.4.2. Seguridad química
El RD 363/1995, de 10 de marzo, por el que se aprueba el reglamento sobre notificación de sustancias
nuevas y clasificación, envasado y etiquetado de sustancias peligrosas, establece hasta 15 tipos de
sustancias peligrosas con base en sus características fisicoquímicas, características toxicológicas y
peligrosidad para la salud humana.
Muchos de los reactivos utilizados en los laboratorios de biología molecular y citogenética y cultivos
celulares se encuadran dentro de alguna de estas categorías. En consecuencia, las buenas prácticas de
laboratorio referidas a seguridad química deben incluir medidas para:
• Prevenir la exposición del personal a estas sustancias, entendiendo por exposición el contacto
con ellas por penetración cutánea, inhalación o ingestión.
• Su almacenamiento seguro.
• Gestión eficiente de los residuos que generen.
Estas medidas se establecerán con base en el catálogo de productos utilizados en el laboratorio y de
acuerdo con la ficha de datos de seguridad (FDS) específica de cada producto, que aporta información
de hasta 16 apartados relativos a la composición, manipulación, peligros, vías de exposición, efectos
tóxicos, almacenamiento, eliminación y primeros auxilios.
La FDS debe ser suministrada obligatoriamente por el distribuidor del producto y debe guardarse en el
laboratorio para su posible consulta por todo el personal ante cualquier eventualidad.
Como medidas genéricas se pueden mencionar las siguientes:
• Utilización de los EPI adecuados a las posibles vías de exposición de cada producto.
• Prohibición de pipetear con la boca.
• Manipulación de productos volátiles en el interior de campanas de aspiración de gases.
• Manipulación de productos inflamables aliados de fuentes de calor y llamas.
• Correcto etiquetado de todos los envases que contengan agentes químicos, incluyendo las
soluciones stock y de trabajo preparadas en el laboratorio a partir de productos puros. El
etiquetado debe incluir, como mínimo, el nombre del producto, la fecha de preparación y el
pictograma de peligro, en su caso.
• Almacenamiento de los productos químicos en armarios adaptados a sus características de
peligrosidad (inflamables, tóxicos, corrosIvos, etc.) y respetando siempre las incompatibilidades.
• Como ejemplos de sustancias peligrosas habituales en los laboratorios de biología molecular y
citogenética se pueden mencionar los siguientes:
• Inflamables: alcoholes (etanol, isopropanol, metanol).
• Tóxicas y muy tóxicas: acrilamida, azida sódica, bromuro de etidio, diaminobencidina (DAB),
formamida, tetrametilurea.
• Carcinógenas: acrilamida (grado 2), DAB (grado 2), formaldehído (grado 1).
 • Mutágenas: acrilamida (grado 2), bromuro de etidio (grado 3).
• Teratógenas y/o perjudiciales para la fertilidad: acrilamida (grado 3), Formamida (grado 2),
tetrametilurea (grado 1).
1.4.3. Equipamiento y normas de seguridad.
La distribución del laboratorio, las instalaciones, la señalización y el equipamiento deben ser los
adecuados para minimizar y prevenir los riesgos comunes a cualquier laboratorio. En concreto:
• Deben disponer de instalaciones de emergencia convenientemente señalizadas, como duchas de
emergencia, lavaojos, extintores, etc.
• Estar dotados con los equipos de protección individual (EPI) adecuados, según las muestras que
se manipulen y los procedimientos que se desarrollen, como guantes, batas desechables, gafas
de seguridad, mascarillas, pantallas, etc.
• Deben tener instalaciones adecuadas para el almacenamiento de sustancias tóxicas y peligrosas,
como armarios para inflamables y armarios específicos para sustancias químicas tóxicas y
corrosivas.
• Deben tener contenedores adecuados para la recogida selectiva y la clasificación de residuos
• Deben disponer de kits para recogida de derrames de productos químicos y citotóxicos
• Debe contar con un manual de seguridad y un plan para la gestión de residuos
El personal debe cumplir también una serie de normas básicas de comportamiento en los laboratorios:
• Lavado frecuente de manos.
• Utilización de los EPI adecuados.
• Uso de ropa de trabajo adecuada y abrochada, evitando, en lo posible, las mangas anchas, los
colgantes, los zapatos abiertos y, en general, la ropa que deje al descubierto una parte importante
del cuerpo.
• Prohibición de comer, beber, fumar y maquillarse.
• Uso de gafas de seguridad cuando se llevan lentes de contacto.
• Prohibición de pipetear con la boca
• Recibir la formación adecuada para el manejo de los aparatos.
• Conocer el plan de gestión de residuos y el manual de seguridad del laboratorio y cumplir las
normas de actuación que recogen ambos documentos.
1.4.4. El manual de seguridad
El manual de seguridad es un documento de obligado conocimiento de todo el personal del
laboratorio. Debe contener la siguiente información:
• Evaluación de los riesgos inherentes a cada puesto de trabajo en el laboratorio.
• Descripción y normas de utilización del equipamiento de seguridad del laboratorio (cabinas de
bioseguridad, cabinas de aspiración de gases, EPI, etc.)
• Hábitos de trabajo apropiados para minimizar los riesgos de exposición.
• Normas de almacenamiento de productos químicos.
• Normas para la eliminación de desechos y gestión de residuos, incluyendo los derrames
• Normas de actuación en casos de emergencias, accidentes biológicos y accidentes químicos.
1.4.5. Gestión de residuos
Los laboratorios de biología molecular y citogenética deben disponer de un plan de gestión de residuos
tóxicos y peligrosos, en virtud de su actividad.
El plan de gestión de residuos sólidos debe incluir medidas para la recogida selectiva, la clasificación y el
almacenamiento temporal de residuos hasta su recogida por una empresa gestora.
Medidas a gestionar
En el plan de gestión de residuos se tienen que especificar medidas para gestionar:
• Residuos biosanitarios especiales → Entre este grupo o clase de residuos se incluyen los
objetos punzantes y cortantes que han estado en contacto con productos biológicos, cultivos
microbiológicos y material contaminado con los mismos, cultivos celulares, grandes cantidades de
sangre y otros líquidos biológicos, etc
• Residuos químicos → Se incluyen los envases que han contenido productos químicos, reactivos
caducados o innecesarios, los EPI contaminados, los filtros de cabinas de aspiración de gases,
los derrames, etc.
• Residuos citotóxicos → Incluye los restos de productos carcinógenos, mutágenos y teratógenos,
así como los envases que los hayan contenido.
• Residuos radiactivos → Como norma general, los residuos se recogen en:
o Contenedores para los residuos sólidos.
o Garrafas en el caso de residuos líquidos.
Y deben cumplir con:
• Estar homologados y ser específicos para cada tipo de residuo.
• Diferenciarse, normalmente por código de color.
• Estar perfectamente etiquetados.
En cuanto a su manejo, no se deben llenar más de 2/3 de su capacidad y deben cerrar herméticamente.
Finalmente, el plan de gestión de residuos debe especificar las normas de actuación en caso de derrames.
Derrames
Los derrames se cuentan entre los accidentes de laboratorio más comunes y entrañan cierta peligrosidad.
Su gestión implica tres acciones que deben ejecutarse de forma inmediata:
1. Neutralización. Va a depender de las características químicas del producto derramado
2. Absorción. El material absorbente que se use dependerá de la naturaleza del derrame. Algunos
ejemplos son:
o Serrín para líquidos no inflamables ni tóxicos ni corrosivos.
o Carbón activo, para líquidos inflamables, tóxicos o corrosivos.
o Absorbentes-neutralizadores comerciales, para cualquier derrame líquido según
indicaciones del fabricante.
o Celulosa para absorber directamente derrames de pequeñas cantidades.
3. Eliminación. El residuo se introduce en un envase adecuado y se elimina en el contenedor
específico.
o Los derrames de productos en polvo se recogen directamente, evitando la formación de
aerosoles y de polvo en suspensión.
o Los derrames de productos volátiles tóxicos por inhalación recogidos con celulosa deben
ser eliminados rápidamente en envases adecuados con cierre hermético; o bien poner la
celulosa en una cabina de aspiración de gases con filtro de carbón activo hasta su
evaporación y, posteriormente, tratarlo como un residuo químico.
Durante la realización de estas actividades:
• Debe restringirse el acceso al laboratorio.
• Las personas responsables de la recogida deben estar equipadas con los EPI adecuados al
producto derramado.
• Se debe tener especial cuidado con derrames de líquidos inflamables y volátiles.