MEDICINA HUMANA

Facultad de Medicina Humana

Departamento de Ciencias Básicas, Bioética y de la Vida Humana

Biología Celular y Molecular

MANUAL DE PRÁCTICAS DE
LABORATORIO
Lima, 2023-I

Página 0 de 5 Manual de Prácticas de Laboratorio: Ciclo 2022-I

Universidad de Piura Biología Celular y Molecular

LAB 03
Fraccionamiento Celular:
Indira Roel, Héctor Sánchez & Jhonathan Benites

1. Introducción:

El aislamiento de las fracciones nuclear, mitocondrial y citosólica de células y tejido de mamífero con
una pureza razonable; han generado gran interés, ya que permite el estudio y caracterización de
diferentes proteínas y organelas. El fraccionamiento celular es una técnica biológica que sirve para
separar diferentes organelas preservando sus funciones individuales. La técnica utilizada para separar
fracciones es la centrifugación diferencial, que utiliza el incremento secuencial en la fuerza gravitacional
resultando en la separación secuencial de organelas celulares de acuerdo a su densidad. Además, el
fraccionamiento subcelular es utilizado universalmente para la preparación de muestras antes de los
análisis ómicos.

En esta guía práctica realizaremos el procedimiento para el fraccionamiento celular y la subsiguiente

observación del núcleo y de las mitocondrias provenientes de hepatocitos de pollo.

2. Competencias:

Al finalizar la práctica, con la ayuda de esta guía de práctica y con los materiales audiovisuales
proporcionados, el alumno será capaz de:
• Entender y describir los pasos y el fundamento del fraccionamiento celular.
• Reconocer la técnica adecuada para la observación y/o identificación de las proteínas u
organelas purificadas o enriquecidas.
• Fundamentar la naturaleza tintórea del núcleo y mitocondrias.

3. Fundamento teórico

3.1. Disgregación de tejido y lisis cellular

El primer paso en el fraccionamiento celular es la disrupción de tejido y lisis celular. El objetivo es

disgregar y romper suavemente las células con el mínimo de daño a los componentes celulares.
Dependiendo del tejido y tipo celular y la fracción celular particular de interés, podemos lograrlo
mediante el uso de métodos físicos, químicos o enzimáticos. La técnica más ampliamente utilizada es
la homogeneización. La homogeneización es un proceso en el cual se utiliza el cizallamiento de fluidos
para romper las membranas celulares. Esta técnica implica el uso de un homogeneizador mecánico,
como una licuadora o mortero y pilón. Otra técnica implica el uso de ondas de sonido de alta
frecuencia para lisar las células. La energía mecánica de una sonda ajustada al equipo denominado
“Sonicador” inicia la formación de burbujas de vapor microscópicas que implosionan las células.
Además, se puede utilizar el método de lisis osmótica en células de mamíferos, utilizando soluciones
hipotónicas tamponadas. Finalmente, para células que contienen estructuras complejas, se puede
utilizar enzimas como: muramidasas, glucanasas, quitinasas, entre otras.

3.2. Centrifugación

Después de la lisis, los componentes celulares toman determinado tiempo en asentarse en el fondo del
tubo. En este sentido, para acelerar el proceso, el lisado celular puede ser sometido a centrifugación.
En el proceso de centrifugación, la muestra es sometida a una rotación a alta velocidad, imponiendo
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una fuerza en las partículas perpendicularmente al eje de rotación. Esta fuerza se llama “Fuerza
Centrífuga Relativa” (RCF), la cual es expresada como un múltiplo de la fuerza gravitacional de la
Tierra (x g). Los medios utilizados para la centrifugación diferencial son principalmente sacarosa,
manitol, glicerol, Ficoll 400 (un polímero de sacarosa), Percoll (sílica coloidal) y iodixanol (OptiPrep).

3.2.1. Centrifugación diferencial

Es un método de centrifugación en el cual el lisado celular es sometido a centrifugaciones

sucesivas incrementando la fuerza centrífuga progresivamente. La separación de los componentes
celulares se basa únicamente en la velocidad de sedimentación a través del medio de
centrifugación, que a su vez, dependen en el tamaño y forma de los componentes celulares. Cada
paso de centrifugación resulta en la obtención de un pellet, el cual contiene una mezcla de
componentes celulares del mismo tamaño y/o densidad. El sobrenadante, la solución remanente
encima del pellet, puede removerse y ser sometido a otro paso de centrifugación para generar
pellets conteniendo otros componentes celulares (Figura 3.1).

3.2.2. Centrifugación en gradiente de densidad

El núcleo es el más grande y denso de todas las estructuras celulares del hepatocito. Por lo tanto,
es relativamente fácil aislar la fracción nuclear utilizando la centrifugación en gradiente de
densidad. En este método el homogeneizado se centrifuga a través de una columna de medio de
centrifugación de densidad creciente, separando el núcleo y organelas basado en tamaño, masa y
densidad (Figura 3.2). Hay dos tipos básicos de centrifugación en gradiente de densidad:
Centrifugación de velocidad zonal y centrifugación isopícnica. La primera, separa las estructuras,
basada principalmente en el tamaño y la masa de las partículas. La segunda, separa las estructuras,
basada principalmente en la densidad de flotación.

4. Procedimiento experimental

a. Materiales y Reactivos

✓ 15g de hígado de pollo

✓ 01 mortero y pilón
✓ 02 gasas
✓ 01 tijera
✓ 01 bisturí con su cuchilla
✓ Guantes quirúrgicos
✓ 10 tubos eppendorf de 1.5ml
✓ 02 beacker de 50ml
✓ 01 cubeta de hielo
✓ 01 micropipeta de 1000μl
✓ 01 micropipeta de 200μl
✓ 01 micropipeta de 100μl
✓ 01 micropipeta de 10μl
✓ Puntas para micropipeta 1000μl, 200μl, 100μl, 10μl
✓ 01Marcador de vidrio
✓ 01 caja de láminas y laminillas
✓ 01 Papel lente
✓ 02 Papel filtro o secante
✓ 100ml de Buffer Tris 10mM pH 7.5
✓ Azul de Metileno
✓ Verde de Janus
✓ Microscopio de campo claro
✓ Microcentrífuga
✓ Balanza analítica
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b. Procedimiento

b.1. Para realizar en laboratorio

b.1.1. Homogeneizado y Filtración de la muestra

✓ Pesar 15g de hígado de pollo fresco en una balanza analítica. Retirando fibras y
ligamentos.
✓ Colocar los 15g de hígado en un mortero (que previamente se conserva en frío)
sobre la cubeta de hielo.
✓ Moler y homogeneizar adecuadamente, hasta que queda una pasta.
✓ Adicionar 20ml de la solución Tampón Tris 10mM pH 7.5 (previamente
enfriado).
✓ Filtrar con la ayuda de una gasa en el beacker de 50ml limpio y un embudo.

b.1.2. Centrifugación

✓ Rotular con la palabra núcleo 02 tubos eppendorf de 1.5ml.

✓ Con la ayuda de una micropipeta transvasar 250 μl del filtrado a los tubos
eppendorf y agregar 500 μl de la solución de Buffer Tris 10 mM pH 7.5.
✓ Centrifugar a 3000 rpm durante 3 minutos. El pellet que ha quedado en el
fondo se le denomina fracción nuclear.
✓ Colocar el sobrenadante del proceso anterior a 02 tubos eppendorf nuevos
(rotulados con la palabra mitocondrias).
✓ Resuspender el pellet en 200 μl de Buffer Tris 10 mM pH 7.5.
✓ Centrifugar a 10000 rpm durante 8 minutos. El pellet que ha quedado en el
fondo se le denomina fracción mitocondrial.
✓ Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 μl de buffer Tris 10
mM pH 7.5.

b.1.3. Observación microscópica de la fracción nuclear y mitocondrial

✓ Para observar la Fracción Nuclear, colocamos 10 μl del tubo eppendorf

resuspendido marcado como núcleo.
✓ Dispersar el volumen de la muestra con ayuda del tip sobre la lámina porta
objeto.
✓ Adicionar una gota de Azul de metileno. Dejar reposar por 5 min y lavar con
agua destilada.
✓ Cubrir con una lámina cubreobjeto y observar en el microscopio de campo
claro a 100X y 400X. Realizar esquemas.
✓ Para observar la Fracción Mitocondrial, colocar 10 μl del tubo eppendorf
resuspendido marcado como mitocondrias en una lámina portaobjeto.
✓ Dispersar el volumen de la muestra con ayuda del tip sobre la lámina porta
objeto.
✓ Adicionar una gota del colorante Verde de Janus. Dejar reposar por 5 min y
lavar con agua destilada.
✓ Cubrir con una lámina cubreobjeto y observar en el microscopio de campo
claro a 400X y 1000X. Realizar esquemas.
5. “Dato importante o para recordar”
La evaluación de la pureza de las estructuras de interés obtenidas en las diferentes fracciones,
pueden realizarse por: Morfología, marcadores moleculares o técnicas inmunológicas.

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6. Autoevaluación
✓ Si quisiéramos observar, ribosomas, centriolos, membrana celular ¿A cuántas RPM se
tendrán que centrifugar para obtener dichos componentes celulares?
✓ ¿Por qué se utiliza el Tampón Tris 10mM a pH 7.5?
✓ Explique ¿Por qué se utiliza el azul de metileno para observar la fracción nuclear?
✓ Explique ¿Por qué se utiliza el Verde de Janus para observar la fracción mitocondrial?
✓ Si se obtuviera la fracción lisosomal ¿Qué colorante se utilizaría y por qué?
7. Anexos

Figura 3.1. Esquema de la Centrifugación Diferencial.

Figura 3.2. Esquema de centrifugación en gradiente de densidad.

8. Referencias bibliográficas

✓ Cell Breakage and Fractionation – Part 1. Fuente:

http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/garland_PDFs/Panel_5.04a.pdf
✓ Cell Breakage and Fractionation – Part 2. Fuente:
http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/garland_PDFs/Panel_5.04b.pdf
✓ Exercise 3: Centrifugation techniques. Fuente:
http://shaker.umh.es/jmgr/PDF/TIBSP3ARA.pdf
✓ Guimaraes de Araújo M & Huber L. (n.d.). Subcellular Fractionation. Cardiovascular
Proteomics, 73-86. DOI: 10.1385/1-59745-214-9:73 ✓ Kotsias B. 2005. Las mitocondrias y El
verde Jano. 65: 75-79. Fuente: https://www.medicinabuenosaires.com/demo/revistas/vol65-
05/1/mitocondrias.PDF
✓ Lang E., Mueller S., Hoernstein S., Porankiewicz-Asplund J., Vervliet-Scheebaum M. & Reski R.
2011. Simultaneous isolation of pure and intact chloroplasts and mitochondria from moss as the
basis for sub-cellular proteomics. Plant Cell Rep. 30: 205-215. DOI: 10.1007/s00299-010-0935-4.

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