Tema 5

5- AISLAMIENTO Y
PURIFICACIÓN DE
MACROMOLÉCULAS
• Homogeneización. Extracción. Precipitación. Centrifugación. Filtración.
Electroforesis.
• Aplicaciones cromatográficas.
• Técnicas electroforéticas: Preparación de geles, revelado de bandas
de cadenas nucleotídicas y proteínas.
• Clasificación y almacenamiento de los residuos electroforéticos.
Procesado y registro de imágenes.
5- Aislamiento y purificación de macromoléculas
• Los pasos a seguir son:
• Homogeneización.
• Extracción.
• Precipitación.
• Centrifugación.
• Filtración.
• Electroforesis.
5.1- Homogeneización. Extracción. Precipitación.
Centrifugación. Filtración. Electroforesis.
• En Biología y Bioquímica, la homogeneización trata de
disgregar los tejidos y romper las células, con el menor

daño a la membrana plasmática.
• Un homogeneizador es un elemento del equipamiento de
laboratorio utilizado para la homogeneización de distintos

tipos de materiales, tales como tejidos, plantas,
alimentos, suelo, y muchos otros.
• La homogeneización es un paso muy común en la
preparación de muestras biológicas antes del análisis de

ácidos nucleicos y proteínas, o del estudio de células,
metabolismo, agentes patógenos y otros muchos
objetivos.
• Descritos en el punto 2.2

• La extracción con disolventes es la técnica de separación
de un compuesto a partir de una mezcla sólida o líquida,

aprovechando las diferencias de solubilidad de los
componentes de la mezcla en un disolvente adecuado.
Constituye una de las técnicas de separación de
compuestos más utilizada en el laboratorio químico.
• La precipitación es un proceso de obtención de un sólido
a partir de una disolución. Puede realizarse por una

reacción química, por evaporación del disolvente, por
enfriamiento repentino de una disolución caliente, o por
cambio de polaridad del disolvente. El sólido así obtenido
se denomina precipitado y puede englobar impurezas. En
general será necesario cristalizarlo y recristalizarlo.
• Tanto la extracción como la precipitación son dos
procesos distintos, pero buscan exactamente lo mismo, la

separación de cierto o ciertos compuestos de la
disolución.
• ¿Qué ejemplos hemos visto en laboratorio y clase?

• Ejemplos que hemos visto en laboratorio:
• Precipitación de proteínas, lípidos y debris celular con la solución
de precipitación o la neutralización de la lisis.

• Precipitación de los ácidos nucleicos utilizando isopropanol o
etanol.
• Extracción de lípidos y proteínas por fenol (extracción de DNA)
• Para poder hacer una separación eficiente de lo que
hayamos extraído o precipitado necesitamos hacer uso

de otra técnica muy común en el laboratorio.
• ¿Cuál es?
• En algunos casos, como en el de extracción de
plásmidos, también utilizamos la técnica de filtración para

obtener el componente que queramos.
• La filtración es uno de los procesos más utilizados a la
hora de purificar extractos de DNA y RNA

• Se utilizan membranas de sílica positivamente cargadas
• Por último, la etapa para verificar el resultado obtenido es la
electroforesis.
• La electroforesis es una técnica de laboratorio que se usa
para separar moléculas de ADN, ARN o proteínas en función

de su tamaño y carga eléctrica. Se usa una corriente eléctrica
para mover las moléculas a través de un gel o de otra matriz.
Los poros del gel o la matriz actúan como una red, lo cual
permite que las moléculas más pequeñas se muevan más
rápido que las moléculas más grandes.
• Para determinar el tamaño de las moléculas de una
muestra, se usan estándares de tamaños conocidos que

se separan en el mismo gel y luego se comparan con la
muestra.
• La gran mayoría de macromoléculas están cargadas
eléctricamente y, al igual que los electrolitos, se pueden

clasificar en fuertes y débiles dependiendo de la
constante de ionización de grupos ácidos y básicos. Por
ejemplo los ácidos nucleicos son poliácidos fuertes.
• Por lo general, para caracterizar la molécula se determina
la velocidad a la que esta se mueve en un campo

eléctrico y se utiliza para determinar, en el caso de
proteínas, la masa molecular o para detectar cambios de
aminoácidos y separar cuantitativamente distintas
especies moleculares; en el caso de ácidos nucleicos se
determina su tamaño, medido en pares de bases.
5.2- Aplicaciones cromatográficas.
• Una vez que hayamos extraído nuestra macromolécula
de interés, habrá veces en las que tengamos que hacer

algunos pasos adicionales para obtener una muestra más
pura dependiendo de la aplicación que le vamos a dar.
• La cromatografía es un método físico de separación para
la caracterización de mezclas complejas cuyo objetivo es

separar los distintos componentes, la cual tiene aplicación
en todas las ramas de la ciencia; en el principio de
retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos
componentes de una mezcla, permitiendo identificar y
determinar las cantidades de dichos componentes.
• ¿Qué es la fase estacionaria?
• ¿La fase móvil?
• ¿Tiempo de retención?
• ¿Eluyente?
• Una retención diferencial sobre la fase estacionaria
resulta en una separación efectiva en función de los

tiempos de retención de cada componente de la mezcla.
• En general, todos los tipos de cromatografía dependen de
una serie de instrumentos, compuestos químicos y

determinada tecnología. Debido a ello, es importante
conocer algunos conceptos para poder entender el
funcionamiento de las técnicas cromatográficas:
• Fase estacionaria. Es una sustancia que se mantiene
inmóvil mientras se ejecuta la cromatografía.

• Fase móvil. Es la sustancia que se mueve durante la
cromatografía. Puede ser un líquido o un gas. La muestra

que contiene el analito se administra en la fase móvil.
• Analitos. Son las sustancias que se van a separar,
cuantificar y/o identificar utilizando la cromatografía, es

decir, son las sustancias que se van a analizar.
• Muestra. Es la mezcla que se va a analizar. Puede estar
constituida por uno o varios analitos, y otros componentes que

pueden no ser de interés, de los que serán separados los analitos.
• Tiempo de retención. Es el tiempo que demora un analito en
pasar desde la columna o sistema por donde pase la fase móvil,

hasta el detector (equipo que puede dar una señal de detección
utilizando alguna propiedad del analito).
• Eluyente. También se refiere a la fase móvil cuando sale de la
columna cromatográfica.
• El método cromatográfico consiste en inocular una muestra en una
fase estacionaria o fase móvil (dependiendo del tipo de técnica

cromatográfica). Luego, si por ejemplo, la fase móvil es la que contiene
la muestra, pasa a través de una fase estacionaria determinada.
• La separación de los analitos dependerá de la afinidad de cada
uno de los componentes tanto por la fase estacionaria como por la

fase móvil.
• Según el soporte, ¿qué tipos de cromatografía existen?

Tipos de cromatografía
• Cromatografía en papel. La fase estacionaria está formada
por una tira de papel de filtro. La muestra a analizar se coloca

en forma de gota sobre un extremo del papel. Luego se
sumerge la tira de papel en un recipiente donde se encuentra
la fase móvil, teniendo en cuenta que el extremo donde está
colocada la muestra quede en la parte de abajo del papel.

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5- AISLAMIENTO Y

• Los pasos a seguir son:

• En Biología y Bioquímica, la homogeneización trata de

disgregar los tejidos y romper las células, con el menor

• Un homogeneizador es un elemento del equipamiento de

laboratorio utilizado para la homogeneización de distintos

• La homogeneización es un paso muy común en la

preparación de muestras biológicas antes del análisis de

• Descritos en el punto 2.2

• La extracción con disolventes es la técnica de separación

de un compuesto a partir de una mezcla sólida o líquida,

• La precipitación es un proceso de obtención de un sólido

a partir de una disolución. Puede realizarse por una

• Tanto la extracción como la precipitación son dos

procesos distintos, pero buscan exactamente lo mismo, la

• ¿Qué ejemplos hemos visto en laboratorio y clase?

• Ejemplos que hemos visto en laboratorio:

• Precipitación de proteínas, lípidos y debris celular con la solución

de precipitación o la neutralización de la lisis.

• Para poder hacer una separación eficiente de lo que

hayamos extraído o precipitado necesitamos hacer uso

• En algunos casos, como en el de extracción de

plásmidos, también utilizamos la técnica de filtración para

hora de purificar extractos de DNA y RNA

para separar moléculas de ADN, ARN o proteínas en función

• Para determinar el tamaño de las moléculas de una

muestra, se usan estándares de tamaños conocidos que

• La gran mayoría de macromoléculas están cargadas

eléctricamente y, al igual que los electrolitos, se pueden

• Por lo general, para caracterizar la molécula se determina

la velocidad a la que esta se mueve en un campo

• Una vez que hayamos extraído nuestra macromolécula

de interés, habrá veces en las que tengamos que hacer

• La cromatografía es un método físico de separación para

la caracterización de mezclas complejas cuyo objetivo es

• ¿Qué es la fase estacionaria?

• ¿La fase móvil?

• Una retención diferencial sobre la fase estacionaria

resulta en una separación efectiva en función de los

• En general, todos los tipos de cromatografía dependen de

una serie de instrumentos, compuestos químicos y

• Fase estacionaria. Es una sustancia que se mantiene

inmóvil mientras se ejecuta la cromatografía.

cromatografía. Puede ser un líquido o un gas. La muestra

cuantificar y/o identificar utilizando la cromatografía, es

• Muestra. Es la mezcla que se va a analizar. Puede estar

constituida por uno o varios analitos, y otros componentes que

pasar desde la columna o sistema por donde pase la fase móvil,

• El método cromatográfico consiste en inocular una muestra en una

fase estacionaria o fase móvil (dependiendo del tipo de técnica

• La separación de los analitos dependerá de la afinidad de cada

uno de los componentes tanto por la fase estacionaria como por la

• Según el soporte, ¿qué tipos de cromatografía existen?

• Cromatografía en papel. La fase estacionaria está formada

por una tira de papel de filtro. La muestra a analizar se coloca

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