1

Justificacin

Las plantas han sido utilizadas desde tiempos remotos con fines curativos para buscar nuevos
agentes teraputicos y siguen siendo una alternativa importante en la medicina moderna (Garca
y Morales, 2005).

En la actualidad existe un inters creciente por el estudio y la utilizacin de las plantas
medicinales, tanto en pases desarrollados, como en aquellos en vas de desarrollo (Garca y
Morales, 2005). Se ha incrementado el inters por las sustancias extradas de plantas, debido
quiz a la falta de eficacia de algunos tratamientos alopticos, al abuso o inadecuado uso de las
drogas sintticas, incrementando as sus efectos secundarios y a que un gran porcentaje de la
poblacin mundial no tiene acceso a los tratamientos farmacolgicos convencionales (Rates,
2001).

Los tratamientos tradicionales (folklricos) de plantas medicinales han sido utilizados en el
manejo de diversas enfermedades. As por ejemplo, para el tratamiento de la Enfermedad de
Parkinson (EP), basados en los principios de la medicina Ayurveda, se recomienda una coccin
en leche de varias especies de plantas: Mucuna pruriens (especie principalmente encontrada en
India), semillas de Hyosciamus reticulates, Withania somnifera y races de Sida cardifolia. Por
otro lado, ya existen preparados comerciales de M. pruriens que estn actualmente disponibles
en India (Nagashayana et al, 2000).

Diferentes preparaciones de las semillas de M. pruriens se han utilizado en el manejo de la EP
debido a que es una buena fuente de L-3,4-dihidroxifenil-alanina (L-Dopa). Estudios
fitoqumicos del extracto alcohlico fraccionado de las semillas de esta planta, demostraron la
presencia adems de otras sustancias qumicas, entre ellas, compuestos indlicos como la
triptamina y la 5-hidroxitriptamina (serotonina) (Tripathi y Upadhyay, 2001).

La EP es un sndrome clnico que se presenta principalmente en adultos mayores, en la mayora
de los casos llega a ser incapacitante, y sus tres principales sntomas son el tremor en reposo, la
acinesia y la bradicinesia, adems genera alteraciones de la marcha (Zigmond et al, 2002). La EP
idioptica posee como caracterstica fisiopatolgica clsica, la prdida de neuronas
dopaminrgicas pigmentadas de la parte compacta (pc) de la sustancia negra en el mesencfalo,
que es la regin con mayor cantidad de clulas dopaminrgicas del sistema nervioso central
(SNC) (Gibb, 1992).

Otro de los centros cerebrales de control del movimiento implicado en la EP, es el cuerpo
estriado. Dentro de ste, existen interneuronas colinrgicas; las cuales reciben aferencias
corticales glutamatrgicas excitatorias. Estas interneuronas son controladas colateralmente por la
va dopaminrgica proveniente de la sustancia negra (pc), que al activarse inhibe la liberacin de
acetilcolina de estas interneuronas. Es por esto, que uno de los tratamientos iniciales en la EP
fueron los anticolinrgicos (Braunwald et al, 2001). En relacin con lo anterior, distintos
metabolitos producidos por el gnero Mucuna, podran tener un efecto anticolinrgico,
mejorando de esta manera los signos y sntomas de la enfermedad (Morais et al, 2004).

2

Hussain y Manyam (1997), evaluaron el efecto que produca un preparado de endocarpo de
Mucuna pruriens mezclado con la alimentacin, en ratas macho Sprague-Dawley. Ellos
compararon dos dosis de L-Dopa (125 y 250 mg/Kg) + carbidopa, utilizando para tal efecto, el
modelo animal de lesin unilateral con 6-hidroxidopamina (6-OHDA). En este estudio, se
demostr que Mucuna pruriens, posee casi el doble de la actividad antiparkinsoniana que la
obtenida con L-Dopa + carbidopa. Basndose en lo anterior, los autores sugierieron que el
endocarpo de M. pruriens adems de L-Dopa podra contener otros componentes con actividad
antiparkinsoniana an no identificados, u otras sustancias que potencien la eficacia de ese
compuesto.

En el trabajo de tesis realizado por Molina y Sols (2003), de manera anloga a Hussain y
Manyam, se obtuvo evidencia del efecto antiparkinsoniano del extracto hidroalcohlico crudo de
Mucuna urens, una de las especies de este gnero que se encuentra en C.R. El tratamiento con M.
urens + carbidopa (intraperitoneal), mostr un efecto antiparkinsoniano mayor que el efecto
obtenido utilizando L-Dopa + carbidopa administrado por la misma va (Molina y Sols, 2003).

En otro estudio del Dr. Fornaguera y la Dra. Badilla an no publicado, M. urens provoc una
disminucin en la distancia recorrida por el carbn activado en la prueba de trnsito intestinal
con ratas comparado contra solucin salina; sugiriendo de este modo, la presencia de
componentes anticolinrgicos dentro del extracto crudo.

Adems, otros estudios preliminares an no publicados llevados a cabo en cultivos de clulas
PC-12 (por inters del Dr. Jaime Fornaguera en Crdoba, Espaa), sugieren que el
pretratamiento de dichas clulas con el mismo extracto de M. urens tiene un efecto
neuroprotector ante dosis crecientes de 6-OHDA. En el mismo estudio se demostr adems un
leve efecto de proliferacin celular.

Los hallazgos positivos encontrados hasta ahora en relacin con el extracto de M. urens (Molina
y Sols, 2003) fundamentan este trabajo, el cual pretende implementar estudios experimentales
que permitan por un lado, comprender mejor los mecanismos subyacentes de los efectos
observados, y por el otro, intentar sugerir las molculas responsables.

Por otra parte, los efectos nocivos reportados en la literatura sobre la utilizacin crnica de L-
Dopa en pacientes con la EP (Yahr, 1993), se convierten en una motivacin adicional para
continuar con ms estudios experimentales sobre posibles tratamientos que permitan
disminuirlos.


Objetivo General
Evaluar el efecto muscarnico in vitro del extracto crudo y fraccionado de las semillas de
Mucuna urens, mediante un modelo celular de receptores acoplados a protenas G.



3

Objetivos Especficos

Realizar la recolecta, el secado y la molienda de las semillas de Mucuna urens, para preparar el
extracto hidroalcohlico.

Preparar por percolacin el extracto hidroalcohlico 8:2 de las semillas molidas de M. urens.

Elaborar un liofilizado a partir del extracto hidroalcohlico obtenido de las semillas de Mucuna
urens.

Efectuar pruebas fitoqumicas preliminares en M. urens para la identificacin de grupos de
metabolitos secundarios.

Determinar el efecto farmacolgico in vitro del extracto hidroalcohlico crudo de M. urens sobre
receptores muscarnicos y sobre receptores para quimiocinas asociados con protenas G.

Obtener la huella digital cromatogrfica del extracto hidroalcohlico crudo de las semillas de
Mucuna urens.

Llevar a cabo el fraccionamiento cromatogrfico biodirigido del extracto hidroalcohlico crudo
de M. urens.

Determinar el efecto farmacolgico de las fracciones del extracto hidroalcohlico de M. urens
separadas por HPLC sobre receptores muscarnicos asociados con protenas G.


Marco Terico
Enfermedad de Parkinson
La EP, es un desorden progresivo del SNC, que se caracteriza por la degeneracin de las
neuronas dopaminrgicas en la sustancia negra, parte compacta. En muchos casos en estas
neuronas ocurre adems la aparicin de inclusiones eosinfilas intracelulares, llamadas cuerpos
de Lewy (Braunwald et al, 2001). En la EP, los sntomas caractersticos no aparecen hasta que el
grado de prdida celular alcanza casi un 80 % de la poblacin de las neuronas en el caudado
putamen y de un 60% en la sustancia negra (Braunwald et al, 2001; Zigmond et al, 2002). La EP
se caracteriza clnicamente por: temblor en reposo, rigidez, bradicinesia (lentitud en los
movimientos), dificultad con el balance corporal, depresin y demencia (Young, 1999).




4

Bases celulares de la EP
Resulta importante conocer los principios bsicos del funcionamiento cerebral, relacionados con
la EP, puesto que este conocimiento, permite comprender los signos y sntomas de la
enfermedad, as como las posibles dianas de tratamiento farmacolgico alopticas y folclricas.
Las neuronas de la parte compacta de la sustancia negra envan impulsos dopaminrgicos hacia
el cuerpo estriado (va nigroestriatal), el cual forma parte de los ganglios basales (Hardman et al,
2001).

A su vez, los ganglios basales se pueden considerar como un asa lateral reguladora que controla
el flujo de informacin desde la corteza hacia las neuronas motoras de la mdula espinal. Un
subgrupo pequeo pero importante, de las neuronas estriatales incluye interneuronas
colinrgicas, las cuales dentro del cuerpo estriado hacen sinapsis con neuronas gabargicas
(Hardman et al, 2001).





Figura 1. Diagrama de los circuitos cerebrales en los ganglios basales en estado normal
(modificado de Hardman et al, 2001).


La emisin de impulsos desde el cuerpo estriado se efecta por dos vas distintas denominadas
directa e indirecta (Hardman et al, 2001). La va directa est formada por neuronas del cuerpo
estriado que se proyectan hacia la parte reticulada de la sustancia negra y la parte medial del
STR
SNpc GPL SNT
Tlamo
VA / VL
SNpr / GPM
Corteza Cerebral
Neuronas
Glutamatrgicas
excitadoras.
Neuronas
Gabargicas
inhibitorias.
Neuronas
Dopaminrgicas.


+
-
STR = cuerpo estriado
(neoestriado)
SN = sustancia negra, pc = pars
compacta y pr = pars reticulata
GP = globo plido, L = lateral
(externo), M = medial (interno)
STN = ncleo subtalmico
VA = ventroanterior
VL = ventrolateral
Va
Indirecta
D
2
D
1

Va
Directa
5

globo plido (ver figuras 1 y 2); mientras que la va indirecta est formada por neuronas estriato-
palidales que se unen con la parte lateral del globo plido, luego otras neuronas conectan con el
ncleo subtalmico, y este a su vez con el globo plido medial (Gerfen, 2006).


Figura 2. Diagrama de los circuitos cerebrales en los ganglios basales con Enfermedad de
Parkinson (modificado de Hardman et al, 2001). En el diagrama las lneas punteadas representan
una disminucin en la actividad de la va, mientras que las lneas ms gruesas simbolizan una
actividad aumentada en la va esquematizada.

El neurotransmisor de la va directa es el cido -amino butrico (GABA), un neurotransmisor
con funciones inhibidoras; cuyo efecto neto de estimulacin por la va directa, consiste en un
incremento de la emisin de impulsos excitadores del tlamo hacia la corteza (ver figuras 1 y 2).
Por tanto, la dopamina que se descarga en el cuerpo estriado tiende a incrementar la actividad de
la va directa y a reducir la de la va indirecta, en tanto que, el agotamiento del neurotransmisor
que ocurre en la EP tiene el efecto opuesto (ver figura 2) (Hardman et al, 2001).

El xito de este modelo de funcin de los ganglios basales, radica en que explica los sntomas
observados en casos de EP, como una consecuencia de la prdida de neuronas dopaminrgicas
por el efecto diferencial de la dopamina en las vas directa e indirecta (ver figura 2). Las
neuronas dopaminrgicas de la parte compacta de la sustancia negra (SNpc) inervan todas las
partes del cuerpo estriado; sin embargo, las neuronas estriatales expresan dos tipos distintos de
receptores de dopamina. Las neuronas estriatales que originan la va directa, expresan
primordialmente el receptor dopaminrgico D
1
, cuya respuesta est asociada a un aumento de
adenilatociclasa (AC). En tanto que las neuronas estriatales que forman la va indirecta, expresan
fundamentalmente el D
2
cuya respuesta est asociada a una disminucin de AC (Marsden, 2006).

SNpc PGL SNT
SNpr / GPM
Corteza Cerebral
STR
Tlamo
VA / VL

Va
Indirecta
D
1
D
2

Va
Directa
Neuronas
Glutamatrgicas
excitadoras.
Neuronas
Gabargicas
inhibitorias.
Neuronas
Dopaminrgicas.

+
-
6

Manifestaciones clnicas
Algunas de las manifestaciones ms comunes y evidentes al avanzar la EP como se mencion
anteriormente, son el temblor en reposo, la bradicinesia y la rigidez. El temblor empeora con la
ansiedad. Suele comenzar con movimientos rtmicos de flexo-extensin de una o ambas
extremidades del mismo lado, antes de generalizarse. La manifestacin ms incapacitante es la
bradicinesia, que consiste en un enlentecimiento de los movimientos voluntarios asociado con
una disminucin de los movimientos automticos, como el balanceo de los brazos al caminar. La
fuerza en las extremidades se conserva, pero los movimientos finos y los movimientos alternos
rpidos estn alterados (Braunwald et al, 2001). La expresin facial se vuelve fija, las hendiduras
palpebrales se ensanchan y el parpadeo es escaso. La combinacin de temblor, rigidez y
bradicinesia, hace que la letra se vuelva pequea, temblorosa y con frecuencia ilegible
(Marjama-Lyons y Koller, 2001). La voz se vuelve hipofnica (dbil) y poco modulada. Los
pacientes tienen dificultad para levantarse de la cama o de una silla, y tienden a adoptar una
postura en flexin cuando estn de pie. Con frecuencia les cuesta iniciar la marcha, y tienen que
inclinarse cada vez ms hacia adelante para conseguir comenzar a caminar. En los estadios
finales, la marcha es a pasos cortos, arrastrando los pies, sin balanceo de los brazos, inestable en
los giros, y pueden tener dificultad para detenerse. Algunos pacientes caminan con una marcha
festinante, es decir con una velocidad cada vez mayor para evitar caerse, debido a que su centro
de gravedad ocupa una posicin anormal (Braunwald et al, 2001; Marjama-Lyons y Koller,
2001).
Tratamiento farmacolgico sintomtico
Muchas investigaciones acerca del Parkinson y sus posibles curas se realizan en el mundo entero,
pero pese a todos esos esfuerzos an no se dispone en el mercado de un tratamiento que logre
revertir completamente la enfermedad. Los tratamientos actuales se dirigen a compensar los
desajustes fisiolgicos y paliar los sntomas. Desde un inicio, el tratamiento de la EP se ha
dirigido a restablecer la funcin del sistema dopaminrgico; el cual, como ya se mencion, se
encuentra fuertemente afectado en esta enfermedad.

El tratamiento ms utilizado es la levodopa (L-Dopa) por sus evidentes beneficios teraputicos.
El uso de la levodopa, precursor metablico de la dopamina provoca una mejora sintomtica
especialmente sobre la bradicinesia. La presencia en la mucosa intestinal de la dopa
descarboxilasa, que convierte la levodopa en dopamina, hace que se pierda la mayor parte de la
dosis ingerida antes de que entre en la circulacin general. Por esa razn, la L-Dopa se
administra con un inhibidor extracerebral de la dopa-descarboxilasa (carbidopa en EU y
benserazida en Europa), el cual disminuye su transformacin perifrica en dopamina (que no
pasa la barrera hematoenceflica). De esta manera se disminuye la incidencia de efectos
secundarios perifricos producidos por ese neurotransmisor y se aumenta la biodisponibilidad del
medicamento en sangre y en cerebro (Braunwald et al, 2001).

Los efectos secundarios iniciales ms frecuentes de la levodopa son: nuseas, vmitos,
hipotensin postural y en algunos casos arritmias cardiacas. La utilizacin crnica de este
tratamiento produce otros sntomas como movimientos anmalos (discinesias), inquietud motora
(acatisia) y confusin (Braunwald et al, 2001). Un problema habitual es la aparicin del
7

fenmeno de desgaste; cada dosis de levodopa mejora de modo eficaz la movilidad durante
cierto periodo, pero rigidez y acinesia vuelven pronto al final del intervalo entre dosis. En las
etapas tardas de la EP, los pacientes pueden fluctuar con rapidez entre estar inactivos u off,
sin efectos beneficiosos de sus medicamentos, y estar activos on pero con discinesias
incapacitantes, situacin que se ha denominado fenmeno de actividad e inactividad
(encendido on y apagado off) (Hardman et al, 2001; Marjama-Lyons y Koller, 2001).

Otro de los tratamientos ms utilizados, han sido los antagonistas de los receptores muscarnicos.
Los cuales, actan dentro del cuerpo estriado disminuyendo su actividad anormalmente elevada
en los pacientes con la EP (Hardman et al, 2001). Los antagonistas muscarnicos no selectivos
(frmacos anticolinrgicos), pueden ser tiles sobre todo para mejorar el temblor. Diferentes
preparados estn disponibles en el mercado, tales como el trihexifenidilo, mesilato de
benztropina, clorhidrato de difenhidramina, la prociclidina y la orfenadrina (Braunwald et al,
2001).
Los efectos adversos de estos medicamentos son el resultado de sus propiedades
anticolinrgicas; causando as, problemas de sedacin y confusin mental. Tambin pueden
provocar estreimiento, retencin urinaria y visin borrosa (Hardman et al, 2001).

Otros tratamientos tambin usados para la EP son los agonistas del receptor de dopamina, los
inhibidores de la catecol-O-metil transferasa, los inhibidores de la enzima monoaminoxidasa
(MAO) y la amantadina (Hardman et al, 2001).

Entre los agonistas del receptor de dopamina estn la bromocriptina (agonista D
2
y antagonista
D
1
), la pergolida (agonista mixto D
1
y D
2
), el ropinirol y el pramipexol (agonistas selectivos D
2
).
Esta clase de medicamentos tienden a ser ms selectivos en sus acciones que la levodopa,
manifiestan buena selectividad por los diferentes subtipos de receptores; tienen acciones de
duracin mucho ms prolongada que la levodopa, y en muchos casos resultan tiles para tratar
las fluctuaciones del estado motor (Hardman et al, 2001).

Los inhibidores de la catecol-O-metil transferasa (COMT) como la tolcapona y la entacapona,
potencian los efectos beneficiosos de la levodopa al disminuir la conversin de levodopa a 3-O-
metildopa aumentando tanto la vida media plasmtica de levodopa, como la fraccin de cada
dosis que llega al sistema nervioso central.

La MAO es la enzima encargada de oxidar las monoaminas, esta presenta dos isoenzimas A y B,
que se encuentran tanto a nivel perifrico como cerebral. La isoenzima MAO-B es la modalidad
predominante en el cuerpo estriado, y la que hace posible la mayor parte del metabolismo
oxidativo de la dopamina a este nivel. A dosis bajas, la seleginina es un inhibidor selectivo de la
MAO-B, lo cual da como resultado la inhibicin irreversible de la enzima aumentando la
concentracin de dopamina disponible (Hardman et al, 2001).
Modelo experimental de la EP inducido por 6-hidroxidopamina
Ya que el presente trabajo se motiv en los resultados obtenidos por Molina y Sols en el 2003 es
que se describe brevemente a continuacin el modelo de 6-OHDA empleado por ellos.

8

De manera general, el desarrollo de los modelos animales de EP se ha orientado a inducir
modificaciones estructurales o funcionales de la transmisin dopaminrgica nigroestriada. As,
estos modelos son de gran utilidad para el estudio del funcionamiento de los ganglios basales, la
actividad antiparkinsoniana de determinadas sustancias y la eficacia de posibles tratamientos
neuroprotectores (Luquin, 1998).

La 6-OHDA es un anlogo sinttico de la dopamina. El primer efecto descrito fue la capacidad
de inducir deplecin noradrenrgica a nivel del sistema nervioso autnomo cardiaco. La accin
de la toxina sobre las neuronas dopaminrgicas y noradrenrgicas se debe a su analoga
estructural con las catecolaminas; as, cuando se administra en bajas concentraciones
intracerebralmente, se introduce a la neurona presinptica dopaminrgica por medio de un
sistema de recaptura de alta afinidad (Zigmond et al, 1992).

Una vez en el interior de la clula, la toxina provoca un aumento en el estrs oxidativo, que
afectar la estructura y funcin del ADN, produce la peroxidacin lipdica, alterando las
estructuras de las membranas celulares y de un gran nmero de protenas (principalmente los
puentes disulfuro). Por otro lado se ha visto que el estrs oxidativo causa la inhibicin de la
actividad mitocondrial del complejo I, el desacople de la fosforilacin oxidativa y la alteracin
del potencial de membrana mitocondrial celular (Lambeng et al, 2002).

Incapaz de atravesar la barrera hematoenceflica, la 6-OHDA, no puede inducir lesin de la
sustancia negra en la rata, a menos que sea inyectada estereotxicamente a nivel ventricular, en
la sustancia negra o en el cuerpo estriado. Desde el punto de vista conductual, una lesin
unilateral considerable del sistema dopaminrgico puede ser evidenciada mediante la
administracin perifrica de apomorfina o de anfetamina. Estos frmacos producen un
comportamiento giratorio caracterstico contra-lateral o ipsi-lateral respectivamente. As pues, el
comportamiento giratorio, permite sugerir un ndice del grado de degeneracin neuronal en los
animales y el efecto que pueden estar ejerciendo ciertas sustancias a este nivel (Lambeng et al,
2002).
Las plantas medicinales y su uso popular
En la actualidad existe un inters renovado y creciente por el estudio y la utilizacin de las
plantas medicinales, tanto en pases desarrollados como en aquellos en vas de desarrollo. En
pases desarrollados se trata, muchas veces de una moda, la cual intenta combatir el excesivo
consumo de frmacos de sntesis o evitar los efectos secundarios que de ellos se derivan. En
cambio, en los pases en desarrollo se trata ms bien de una opcin alternativa para una gran
parte de la poblacin, ante la imposibilidad por limitaciones econmicas, de acceder a una
terapia farmacolgica. Tanto en unos pases como en otros, el resultado del uso de plantas
medicinales ha desembocado, en muchas ocasiones, en el abuso de drogas de origen vegetal, lo
cual apunta a la importancia de validar cientficamente los efectos de las plantas de uso
medicinal y popular (Garca y Morales, 2005).

La etnobotnica (o el estudio del uso de las plantas en las sociedades tradicionales) ofrece
grandes posibilidades para descubrir nuevos productos tiles a la humanidad y para respaldar los
usos tradicionales de las plantas (Acua, 1954).
9


Las diversas especies latinoamericanas de Mucuna, poseen una gran variedad de usos en la
medicina popular, razn por la cual es importante comprobar cientficamente sus efectos y ms
aun, realizar estudios fitoqumicos sobre los metabolitos que contienen y el efecto de estos a
nivel fisiolgico.
Caractersticas y descripcin de la planta estudiada
Nombre cientfico: Mucuna urens (L.) DC: Fabaceae
Nombre comn: Ojo de buey, pica-pica (Ocampo, 1987).

Ubicacin geogrfica: es un bejuco propio de tierra templada, que ha sido introducido en un
gran nmero de pases. Se utiliza como alimento humano ya sea en forma de harina, espesante
para sopas u condimento. El frijol entero (semilla), tambin es usado en los platos cotidianos de
muchos pases de escasos recursos. Se usa adems como alimento para animales, forraje
(pastura) y abono para suelos, ya que les proporciona nutrientes y minerales (aminocidos,
calcio, magnesio e hierro). Su distribucin es muy amplia, se encuentra en pases de Amrica
como Mxico, Guatemala, Salvador, Honduras, Belice, Costa Rica, Colombia, Argentina, Brasil,
Estados Unidos y Hawai; as como en muchas partes de frica: Nigeria, Ghana, Zambia,
Malawi, Repblica de Benn, Repblica de Guinea y Asia: China, Malasia, Madagascar, India,
Sri Lanka, Indonesia, Filipinas y Java entre otros (Eilitt et al, 2002).

En Costa Rica, se puede encontrar este tipo de trepadoras en los bosques y malezas del Valle
Central. Tambin crece en tierras calientes del Pacfico, en el bosque nuboso de Monte Verde, en
manglares, cerros, crecimientos secundarios y hasta en las costas (Nez, 1982).

Existen muchas especies a nivel mundial, de las cuales la ms conocida y caracterizada es
Mucuna pruriens (St-Laurent et al, 2000). En nuestro pas se encuentran aproximadamente 8
especies del gnero Mucuna identificadas y reportadas por el Instituto de Biodiversidad (INBIO):
Mucuna urens, M. holtonii, M. andreana, M. argyropyilla, M. mutisiana, M. deeringiana, M.
sloanei y M. rostrata. (a)

Descripcin botnica de Mucuna sp: es un bejuco leoso y de extenso crecimiento. Las hojas
son grandes, suavemente vellosas en el dorso; pednculos grandemente alargados y pendientes;
el fruto es una legumbre (vaina) de cerca de 18 cm de largo y 4.5 cm de ancho, con 3 a 4 semillas
negras ovoides, de aproximadamente 3 cm de largo cada una (ver figura 3). El trmino ojo de
buey se debe a la apariencia de las semillas (Agharkar, 1991; Caius, 1989; Rastogi y Mehrotra,
1994).

La planta Mucuna es una enredadera de brote anual, sus hojas son trifoliadas (tienen 3 lbulos),
de forma elptica o rmbica y anchas en la base. Los pecolos son largos y sedosos, con un
tamao entre 6.3 y 11.3 cm. Las flores se encuentran en racimos colgantes, con un color que va
desde blanco hasta morado oscuro. El fruto de esta planta es una vaina gruesa y rugosa. La
superficie total y los rebordes de la vaina estn densamente cubiertos por tricomas (pelos
radicales o espinas) caf plido o amarillos, responsables del prurito al entrar en contacto con la
piel (Sastry y Kavathekar, 1990; Verma et al, 1993).
10



Figura 3: Detalles morfolgicos de Mucuna sp. (www.waynesword; www.cybertufle)
Usos y composicin qumica de Mucuna sp
Las races, de acuerdo con Ayurveda (conocimiento concerniente a la longevidad), son
antihelmnticas, diurticas, emolientes, afrodisacas, purgantes, febrfugas y tnicas (Warrier et
al, 1996; Nadkarni, 2001). Son consideradas tiles para aliviar el estreimiento, los problemas
menstruales, la amenorrea, la hidropesia, las neuropatas, las hemorroides, las lceras gstricas
(Warrier et al, 1996).

Las semillas tienen conocido efecto astringente, expectorante y se usan en el asma, la tos y las
infecciones de la lengua (Prakash et al, 2001). Sin olvidar su uso ms conocido en los sntomas
de la Enfermedad de Parkinson (Hussain et al, 1997; Manyam et al, 2004 (a); Vaidya et al,
1978).

Para Mucuna pruriens ha sido establecida su actividad como antidiabtica (Akhtar et al, 1990;
Grover et al, 2002; Grover et al, 2003; Rathi et al, 2002), antiprotozoaria (Ekanem et al, 2004),
antiinflamatoria, antipirtica, analgsica (Hishikar et al, 1981; Lauk et al, 1993) y
espermatognica (Saksena et al, 1987).

Hay pocas investigaciones sobre la composicin qumica de las semillas de Mucuna urens, por
esto an no se tienen reportes sobre sus componentes. La nica informacin publicada hasta el
momento, es la composicin de las semillas de Mucuna pruriens. Esta planta de la misma
especie contiene una gran cantidad de compuestos, entre ellos: L-dopa de un 1% a un 5% (L-3,4-
dihidroxi-fenilalanina), glutatin, cido glico, bufotenina, colina, lecitina, serotonina, cido 2-
amino-3-(3,4-dihidroxifenil) propnico, mucunina, NADH (nicotina adenina dinucletido),
coenzima Q-10, cidos grasos, prurienina, prurienidina y cido 1,2,3,4-tetrahidro-6,7-dihidroxi-
3-isoquinolinico (Manyam et al, 2004 (b); Prakash et al, 2001). Es adems una buena fuente de
minerales como: calcio, magnesio y hierro (Bell et al, 1971; Eilitt et al, 2002; Rastogi y
Mehrotra, 1991 (a) y (b); Singh et al, 1995).

La actividad ejercida por las sustancias bioactivas que entran en contacto con los tejidos, se lleva
a cabo a nivel molecular por unin a sus receptores que desencadenan una respuesta
farmacolgica. En los ltimos aos ha ocurrido un veloz avance en el conocimiento de la
estructura qumica y los mecanismos bioqumicos de accin de los receptores fisiolgicos.
11

Tipos de receptores fisiolgicos: Generalidades y clasificacin
Las molculas con que los frmacos son capaces de interactuar selectivamente, generndose
como consecuencia de ello una modificacin constante y especfica en la funcin celular, se
denominan receptores farmacolgicos (Flrez, 1997).

La decodificacin del genoma humano y la clonacin han permitido la identificacin y
descubrimiento de nuevos receptores. Tambin se ha avanzado en la purificacin de muchas
clases de receptores, protenas efectoras y protenas transductoras de seal mediante estrategias
genticas de expresin celular. Con estos modelos, se logra inducir la expresin de receptores
endgenos y exgenos en muy diversos tipos celulares para facilitar su purificacin y la
caracterizacin de sus mecanismos de accin (Hardman et al, 2001).

Existen varios tipos de receptores y de mecanismos bioqumicos de transduccin asociados con
ellos tenemos a los receptores de membrana como por ejemplo los receptores enzima, los canales
inicos, y los receptores acoplados a protenas G. Adems existen los receptores intracelulares,
como los receptores de hormonas esteroideas (Hardman et al, 2001; www.123bio.net). A
continuacin se describirn en ms detalle los receptores acoplados a protenas G ya que sern
objeto de estudio en el presente trabajo.

Receptores acoplados a protena G: es una gran familia de receptores conocidos como protenas
G, que utilizan protenas reguladoras heterotrimricas que unen GTP, para realizar la
transduccin de seales hasta las protenas efectoras. Los efectores regulados por protenas G
incluyen enzimas como la adenilato ciclasa, la fosfolipasa C y los canales selectivos para calcio y
potasio. Los receptores acoplados a protenas G, atraviesan las dos capas de la membrana
plasmtica en forma de un haz de siete hlices alfa con el grupo amino en la cara extracelular y
el grupo carboxilo en la cara intracelular. Los ligandos pueden unirse de tres formas diferentes al
receptor: 1) los que se ligan a nivel de las regiones transmembrana del receptor sin interaccionar
con su grupo amino terminal. 2) los que se unen a nivel de los bucles extracelulares e
interaccionan con el grupo amino terminal del receptor. 3) los que se ligan al receptor solo por
unin al grupo amino terminal de extremo largo. Las protenas G se ligan a la superficie
citoplasmtica de los receptores. Los receptores de esta familia al ser estimulados por agonistas
promueven la unin de GTP con la protena G y as la protena se disocia y queda en su forma
activa. Los sistemas de protenas G forman redes complejas de interacciones divergentes y
convergentes que permiten una regulacin multifsica de la funcin celular (Hardman et al,
2001).
Segundos mensajeros citoplasmticos
Algunas seales fisiolgicas asociadas con los mecanismos de transduccin anteriormente
citados, se integran dentro de la clula como resultado de interacciones entre vas de segundos
mensajeros. Entre los segundos mensajeros hidroflicos ms conocidos estn el AMP, GMP
cclicos, el inositol trifosfato (IP
3
) y los iones calcio; entre los mensajeros hidrfobos estn el
xido ntrico y el diacilglicerol.

12

Calcio: los iones de calcio constituyen un segundo mensajero bastante estudiado; su
concentracin intracelular es regulada a travs de diversos mecanismos: receptores de membrana
plasmtica asociados con protenas G; cambios en el potencial de membrana, los propios iones
potasio o calcio, y receptores en regiones especializadas del retculo endoplasmtico que
reaccionan al IP
3
. El calcio citoplasmtico es eliminado por extrusin y/o posterior retorno hacia
el retculo endoplsmico (Hardman et al, 2001).
Regulacin de receptores
La estimulacin ininterrumpida de clulas por agonistas suele culminar en un estado de
desensibilizacin (llamado tambin estado resistente o de regulacin sustractiva), de modo que
disminuye el efecto que surge con la exposicin continuada o ulterior del frmaco a la misma
concentracin.
La desensibilizacin de la respuesta a un agonista, es llevada a cabo principalmente mediante
cuatro mecanismos: disminucin de la concentracin de agonista por degradacin o recaptura
pre-sinptica; desacople funcional por fosforilacin y unin de arrestinas; internalizacin de
complejos fosforilados ligando-receptor y regulacin negativa del nmero de receptores en la
superficie celular (disminucin de sntesis y degradacin) (www.123bio.net).

La inhibicin de seales por medio de retroalimentacin puede limitarse a las que enva
solamente un receptor estimulado, llamado desensibilizacin homloga. Mientras que la
desensibilizacin heterloga comprende la inhibicin o la prdida de una o ms protenas
corriente abajo que participan en el envo y recepcin de seales de otros receptores (Hardman
et al, 2001).

Dada la relacin de la acetilcolina con el funcionamiento general de los ganglios basales, a
continuacin se describen los receptores para este neurotransmisor.
Receptores muscarnicos su y transduccin de seales
La acetilcolina es un neurotransmisor liberado de las terminales de nervios presinpticos en
vesculas, actuando luego sobre receptores nicotnicos y muscarnicos. Dos tipos de receptores de
acetilcolina, muy diferentes en cuanto a su estructura y funcin (Felder, 1995).
La familia de receptores muscarnicos fueron descubiertos gracias a su habilidad de unir el
alcaloide muscarina, derivado del hongo venenoso Amanita muscaria. Los receptores
muscarnicos estn compuestos de una sola protena con el mismo conjunto de caractersticas
estructurales unidas a la superfamilia de los receptores acoplados a protenas G (Felder, 1995).

La estimulacin del receptor M
1
activa la fosfolipasa C, resultando en la liberacin del segundo
mensajero inositol 1,4,5-trifosfato (IP
3
) y la subsiguiente movilizacin de calcio intracelular (ver
figura 4). La activacin de receptores cuyos efectos son mediados por la fosfolipasa C, resulta en
la liberacin de diacilglicerol (DAG) e IP
3
a travs de la hidrlisis del fosfolpido de membrana
fosfatidil inositol 4,5-bifosfato (PIP
2
). Mientras el DAG se une y estimula a la protena cinasa C
(PKC), el IP
3
por su parte saca el calcio almacenado en el retculo endoplasmtico por unin al
receptor de IP
3
(IP
3
R). La familia de enzimas fosfolipasa C (PLC) ha sido agrupada en tres clases
, y ; de las cuales PLC ha sido sugerida en algunos experimentos, como el efector para el
13

receptor M
1
(Berstein et al, 1992). La activacin del receptor M
2
en contraste, atena la
actividad de la adenilato ciclasa, reduciendo de este modo los niveles intracelulares de AMPc
(ver figura 4).



Figura 4: Resumen de las vas de transduccin celular moduladas por receptores muscarnicos.
1) Receptores muscarnicos M
2
y M
4
correspondientes a la va celular acoplada a Gi. 2)
Receptores muscarnicos M
1
, M
3
y M
5
correspondientes a la va celular acoplada a Gq.
Modificado de Dautzenberg y Hauger, 2002 (Fig 2).

A travs de la clonacin, cinco subtipos de receptores muscarnicos han sido identificados y
denominados de M
1
hasta M
5
de acuerdo con su orden de descubrimiento (Felder, 1995). Los
receptores muscarnicos se agrupan generalmente de acuerdo con su acoplamiento funcional, por
la movilizacin de calcio intracelular (M
1
, M
3
y M
5
) o por su inhibicin de la adenilato ciclasa
(M
2
y M
4
). Cada subtipo M
1
, M
3
y M
5
tiene el potencial adicional de activar la fosfolipasa A
2
, las
fosfolipasas C y D; adems favorecen el influjo de calcio. Los subtipos M
2
y M
4
solo juegan un
rol adicional en el aumento de fosfolipasa A
2
(Felder, 1995).
Dinmica de las concentraciones de calcio intracelular
La activacin de los receptores muscarnicos produce cambios tpicos en el calcio intracelular,
caracterizados por una rpida espiga que representa la liberacin de calcio estimulado por el IP
3

de los almacenes intracelulares, seguida en ocasiones de una fase de meseta luego de la espiga
14

rpida, que representa la entrada de calcio extracelular a travs de canales de calcio. En clulas
excitables como las clulas musculares y las neuronas, el calcio pasa predominantemente a travs
de un canal de calcio voltaje dependiente (VOCC) que se abre despus de la despolarizacin de
la membrana. En clulas no excitables como las clulas epiteliales, el calcio pasa a travs de una
familia poco caracterizada de canales de calcio insensibles a voltaje (VICC) (Felder, 1995).

Los VICC se abren en respuesta a la activacin de un receptor y han sido clasificados en tres
grupos generales: 1) canales de calcio operados por receptor (ROCCs), los cuales son
independientes de segundos mensajeros, 2) canales de calcio operados por segundos mensajeros
(SMOCCs) y 3) canales de calcio operados por deplecin (DOCCs), los cuales se abren despus
de la deplecin del almacn de calcio intracelular mediado por IP
3
y proveen una fuente para
volver a llenar los almacenes de calcio (ver figura 4A). La activacin de los VICC mediada por
los receptores muscarnicos ha sido menos estudiada. Pero evidencia indirecta usando pruebas
fluorescentes de calcio intracelular, apunta a un rol de interaccin de los receptores M
1
, M
3
y M
5

con todos los tipos de VICC mencionados (Felder, 1995).

Puesto que muchas patologas incluyendo la EP han sido asociadas con procesos inflamatorios,
es que resulta interesante estudiar adems algunas de las vas relacionadas con la inflamacin
como por ejemplo la de las citocinas de la familia CXCR.
Receptores para citocinas de la familia CXCR
Citocinas: las citocinas son protenas solubles secretadas por muy diversos tipos celulares
hematopoyticos y no hematopoyticos. Su importancia es crucial para que las respuestas
inmunitarias innata y adaptativa se desarrollen con normalidad; su expresin puede alterarse en
la mayora de las enfermedades inmunitarias, inflamatorias e infecciosas (Braunwald et al,
2001).

Las citocinas participan en la regulacin del crecimiento y del desarrollo, as como en la
activacin de las clulas del sistema inmunitario y en la mediacin de la respuesta inflamatoria.
En general, las citocinas se caracterizan por una considerable redundancia, en el sentido de que
diferentes citocinas comparten idnticas funciones. Adems, muchas citocinas son pleiotrpicas,
es decir, son capaces de actuar sobre muy diversos tipos de clulas. Este pleiotropismo deriva de
la expresin en mltiples tipos celulares de receptores para la citocina (Braunwald et al, 2001).
Las quimiocinas son factores que regulan el desarrollo y la migracin de varios tipos de clulas;
ms de 40 quimiocinas han sido identificadas en humanos hasta el momento (Spano et al, 2004).

Las quimiocinas pueden ser clasificadas dentro de 4 grupos (CC, CXC, CX3C y C), basados en
la posicin de los residuos de cisteinas altamente conservados de la secuencia amino acdica. Los
receptores de quimiocinas pertenecen al grupo de las protenas de siete dominios transmembrana,
acoplados a las protenas G antes mencionadas (Schioppa et al, 2003).

La evidencia indica que la activacin inapropiada del receptor CXCR4 puede estar involucrada
en enfermedades neuroinflamatorias y neurodegenerativas como por ejemplo la demencia
asociada al virus de inmunodeficiencia adquirida (HIV) (Khan et al, 2003).

15

La quimiocina (citocina quimiotctica) factor derivado de las clulas del estroma (SDF-1) y su
receptor CXCR4, estn constitutivamente expresados en el cerebro en desarrollo y adulto. Su
expresin se da tanto en clulas neuronales como no neuronales, implicadas en varios procesos
fisiolgicos (Spano et al, 2004).

Aunque el laboratorio colaborador de la Universidad Louis Pasteur en Estrasburgo Francia
trabaja con varios de los receptores para quimiocinas, tales como: CXCR1, CXCR2, CCR5,
CCR2 y CXCR4 (Zoffmann et al, 2002), se eligi probar el receptor CXCR4 antes que
cualquier otro, porque se encuentra relacionado con la respuesta inflamatoria cerebral; y porque
en el laboratorio colaborador de Estrasburgo, se posean la mayor cantidad de herramientas y de
protocolos de medidas de unin ligando/receptor y respuesta celular puestas a punto para este
receptor de quimiocina.

Para tratar de identificar posibles receptores involucrados en el efecto antiparkinsoniano la
administracin de Mucuna urens; se estudi la actividad biolgica del extracto crudo y
fraccionado de esa planta. La actividad biolgica de los compuestos presentes en el extracto de
Mucuna urens, puede ser cuantificada mediante la respuesta de calcio desencadenada en las
clulas al activarse diferentes receptores de 7 dominios transmembrana (muscarnicos,
purinrgicos, etc).
Medicin de actividad biolgica y sondas fluorescentes
Los receptores investigados en este trabajo, se encuentran asociados con las protenas G, que son
protenas integrales de membrana. Cuando los receptores se encuentran acoplados al tipo G q,
su activacin provoca indirectamente la liberacin de calcio del retculo endoplasmtico. El
calcio liberado puede ser medido mediante sondas fluorescentes especficas como indo-1, fura-2,
fluo-3, fluo-4, entre otras (Takahashi et al, 1999). La unin del calcio a la sonda provoca un
aumento ( una disminucin en otros tipos de sondas) en la emisin del espectro de fluorescencia
de esta, el cual puede ser cuantificado por medio de un espectrofluormetro (Takahashi et al,
1999). Los distintos tipos de clulas, expresan diversos tipos de receptores; que pueden utilizar el
mismo mecanismo de transduccin asociado con los niveles de calcio intracelular. Por esta razn
y para obtener informacin especfica de la actividad sobre alguno de ellos, es que se hace
imprescindible la utilizacin de tipos celulares que expresen diferencialmente los receptores que
se desean estudiar.

Por otro lado, es posible sobreexpresar ciertos receptores de inters en tipos celulares que no los
poseen, o los poseen en bajas proporciones. Este proceso se conoce como transfeccin celular, y
se realiza utilizando plsmidos (Gonzlez y Coroas, 2002; Ovidio y Portelles, 1997; Rocha et al,
2002).

Algunos de los tipos de clulas utilizadas para mediciones de calcio por activacin de receptores
asociados con protenas G son: las CHO (chinese hamster ovary; ovario de hamster chino) y las
HEK-293 (human embryonic kidney; rin de embrin humano). En el caso de las CHO stas no
expresan de manera endgena los receptores muscarnicos; lo cual concede especificidad a las
respuestas del receptor muscarnico, ya que solo posee el M
1
transfectado de forma estable
(Sternfeld et al, 2007). En las clulas HEK-293 se expresan de manera endgena receptores
16

muscarnicos M
3
entre otros; aparte de que pueden ser transfectadas con receptores para
quimiocinas CXCR4, que s poseen, pero en baja proporcin (Sternfeld et al, 2007).

La fluorescencia es un tipo de emisin de luz producida por algunas molculas al relajarse; esta
emisin proporciona un instrumento til para medir fenmenos biolgicos. La excitacin de
molculas fluorescentes relacionadas con los procesos celulares y su dinmica de activacin en
el transcurrir del tiempo, permiten cuantificar y comparar las respuestas de dichos sistemas
biolgicos.
Procesos de fotoluminiscencia: la fluorescencia
El fenmeno de fotoluminiscencia ocurre cuando una especie qumica es excitada por medio de
radiacin electromagntica y como consecuencia la especie pierde la energa adquirida
reemitiendo sta en forma parcial o total (Skoog et al, 1994).

La fluorescencia es un proceso de emisin en el cual las molculas son excitadas a niveles
energticos superiores por la absorcin de radiacin electromagntica. Las especies excitadas se
relajan al estado fundamental, liberando su exceso de energa en forma de fotones (Skoog et al,
1994).

La desactivacin o prdida de la energa en exceso se puede efectuar a travs de diferentes
procesos. El camino ms probable hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el tiempo
de vida del estado excitado. Por tanto, si la desactivacin por fluorescencia es rpida con
respecto a los procesos sin radiacin, se observa tal emisin.

La fluorescencia y la fosforescencia son dos manifestaciones diferentes del fenmeno
fotoluminiscente. La fluorescencia cesa casi inmediatamente despus de que a la muestra se le ha
suspendido la radiacin electromagntica (<10
-6
seg.). La fluorescencia puede existir en: gases,
slidos o lquidos (Skoog et al, 1994).

Las sondas son molculas qumicas que se unen con mayor o menor afinidad a los iones (calcio,
magnesio, etc) y regularmente su estructura qumica se basa en un quelante asociado a un
fluorforo. De esta manera es posible seguir y cuantificar las variaciones que sufre el calcio
celular en diferentes procesos biolgicos.
Las sondas fluorescentes dependientes del calcio
Las sondas mencionadas se unen especialmente al calcio con mayor o menor afinidad. Estas
molculas, poseen constantes de disociacin (Kd) que les permiten marcar dbiles cambios del
calcio intracelular en diferentes tipos de clulas. La unin al calcio provoca una variacin de la
intensidad de fluorescencia emitida por la sonda. Esas variaciones son cuantificadas por medio
de diferentes equipos de lectura de fluorescencia y se utilizan en tcnicas como la citometra de
flujo, la foto-activacin atrapada por quelantes, los sistemas de segundos mensajeros,
neurotransmisores y el cribaje en el descubrimiento de nuevos frmacos (Takahashi et al, 1999).

17

La mayor parte de los indicadores fluorescentes de calcio, son aniones policarboxilados
impermeantes. Para solucionar este problema, las molculas han sido permeabilizadas por
adicin de un grupo acetoximetil ster (AM), destinado a enmascarar las cargas negativas. Bajo
esta forma AM, la sonda puede atravesar la membrana celular, pero es insensible al calcio. La
insensibilidad al calcio se soluciona por la accin de las esterasas celulares endgenas, que
cortan los enlaces ster; permitiendo la acumulacin intracelular de sonda en su forma qumica
funcional (Leclerc et al, 2004).

Existen varios tipos de sonda dependiendo de su estructura y funcin. En general, todas ellas
permiten un marcaje fluorescente del sistema biolgico (una protena, un in, un nucletido, etc).
Entre algunas de las ms utilizadas se encuentran: el Indo-1 y el Fluo-4.
Sondas Indo-1 y Fluo-4
Como ya se describi antes, estas sondas son molculas estructuralmente derivadas de quelantes
de calcio, las cuales se unen a dicho in y cambian sus mximos de emisin de fluorescencia;
adems, estas dos sondas requieren la desesterificacin a nivel intracelular para unirse al calcio y
fluorecer. Estos marcadores permiten evidenciar los procesos intracelulares relacionados al
calcio en tiempo real.

Tsien y colaboradores han utilizado como modelo estructural del Indo-1 y otras sondas
fluorescentes el BAPTA y el EGTA (quelantes de calcio). El Indo-1 es uno de los llamados
indicadores raciomtricos de calcio; ya que produce una longitud de onda () de emisin
diferente al tener unido calcio o al estar sin l. As, la razn de ambas longitudes de onda (401 y
475nm) permite una estimacin ms exacta de la concentracin de calcio intracelular;
independientemente de la distancia ptica y la concentracin total del marcador (Invitrogen,
2008).

La razn entre las longitudes de onda corrige diferencias como: cargas desiguales de la sonda, la
fuga o expulsin, el fotoblanqueamiento y los cambios en el volumen celular (Takahashi et al,
1999). Las principales desventajas de Indo-1 son: el rpido fotoblanqueamiento que sufre y la
necesidad de excitacin en el espectro UV que causa dao celular (Invitrogen, 2008).

El Fluo-4 es un anlogo del Fluo-3, con la sustitucin de dos tomos de cloro por tomos de
fluor, correspondiente a la nueva generacin de sondas de excitacin en el espectro visible.
Fluo-4 exhibe una alta Kd para el calcio (345 nM) y una fuerte seal de fluorescencia. La fuerte
seal de fluorescencia resulta una ventaja particular al trabajar con clulas como las HEK-293,
puesto que estn comnmente en menor nmero respecto al volumen usado para los ensayos de
cribaje farmacolgico (Invitrogen, 2008). Los derivados esterificados de Fluo-3 y Fluo-4 no son
fluorescentes por s mismos, diferencindose en esto de los derivados de Indo-1; esto disminuye
el ruido de fondo. Otras de las ventajas del Fluo-4 son: sus cortos tiempos de incubacin para
cargar las clulas (introduccin de la sonda al interior) y las menores concentraciones de sonda
requeridas para realizar los anlisis (Invitrogen, 2008).

18

La mayor desventaja del Fluo-4 es que no exhibe un cambio en el mximo del espectro de
emisin al unirse al calcio. Lo anterior, hace imposible realizar medidas raciomtricas de las
concentraciones de calcio (Takahashi et al, 1999).

De acuerdo con los resultados de Molina y Sols, 2004 en los que se demostr en el extracto
crudo, una actividad antiparkinsoniana mayor que la del L-Dopa, se supone que existen otras
sustancias que potencian la actividad de este compuesto. Para corroborar tal suposicin, se
pretende separar y purificar algunas de las fracciones del extracto crudo para caracterizar de una
mejor manera el o los compuestos responsables de la actividad biolgica observada.
Tcnicas de separacin y purificacin de sustancias
Para tal efecto, el extracto crudo debe ser sometido a separacin qumica; siendo la
cromatografa una de las tcnicas ms usadas y accesibles para este fin. La cromatografa es una
tcnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial
de los mismos. La separacin se establece al ser arrastrados los solutos por una fase mvil
(lquida o gaseosa) a travs de un lecho cromatogrfico que contiene la fase estacionaria (slida
o lquida) (Skoog et al, 2001).

Segn la relacin que se establezca entre la fase estacionaria y la fase mvil, cabe distinguir
entre: cromatografa de adsorcin, cromatografa de intercambio inico, cromatografa de
exclusin (de geles) y cromatografa de afinidad (Morrison et al, 1992).

El principio ms comn y con mayor aplicacin entre las diferentes tcnicas cromatogrficas, es
la cromatografa de adsorcin; en la cual, el slido adsorbe al componente que inicialmente
estaba en la fase mvil por medio de las fuerzas de Van der Waals (Morrison et al, 1992).
Determinacin de la huella cromatogrfica
Los anlisis de huella cromatogrfica han sido aceptados como criterio de calidad por la
Organizacin Mundial de la Salud (WHO) y como un requerimiento de regulacin por la SDFA
(State Food and Drug Administration of China) para productos naturales (Alaerts et al, 2007;
Han et al, 2007; Jiang et al, 2007). Entre los mtodos para determinacin de la huella digital en
general se encuentran: la electroforesis capilar, la cromatografa de gases, los rayos X, la
cromatografa en capa fina y la cromatografa lquida de alta resolucin (Chen et al, 2007; Ma et
al, 2007).

La huella cromatogrfica es una representacin grfica de las seales que producen el conjunto
de componentes de un extracto de origen vegetal (Li et al, 2007). Las huellas cromatogrficas
son normalmente cromatogramas complejos, que exigen una alta capacidad de resolucin en el
proceso de separacin (Han et al, 2007; Jiang et al, 2007).

Es muy conocido que los efectos teraputicos de las plantas medicinales, se deben a los efectos
sinrgicos de mltiples componentes bioactivos presentes en los extractos. De tal manera, la
determinacin de control de calidad por medio de uno o unos pocos componentes del extracto
natural no ha resultado ser suficientemente representativa. Por lo tanto, la implementacin de la
19

huella digital cromatogrfica como parmetro de control de calidad para plantas medicinales, se
perfila como un mtodo de anlisis bastante integral (Chen et al, 2007; Wang et al, 2008).

La huella digital cromatogrfica es especfica para cada especie de planta o tipo de extracto
natural, por lo que en la actualidad, se ha comenzado a usar como mtodo de identificacin de
las plantas medicinales y sus derivados (Chen et al, 2007; Han et al, 2007).

Adems, la huella digital cromatogrfica tambin puede emplearse como un marcador de
actividad farmacolgica; ya que si un patrn cromatogrfico es responsable de cierto efecto
establecido por un modelo farmacolgico, se puede asumir que subsiguientes extractos de la
planta que presenten el mismo cromatograma de huella digital, mantendrn las propiedades
farmacolgicas determinadas por el modelo (Figueroa et al, 2007; Li et al, 2007).
Cromatografa lquida de alta resolucin
La cromatografa lquida de alta resolucin o High performance Liquid Chromatography
(HPLC) es una tcnica en la cual la fase estacionaria es un slido y la fase mvil, es un lquido.
Se utiliza para separar los componentes de una mezcla, basndose en los diferentes principios de
interaccin qumica entre los analitos y la columna (Skoog et al, 1994).

En la HPLC, el analito disuelto en la fase mvil, pasa por la columna cromatogrfica a travs de
la fase estacionaria a alta presin. Los componentes de la muestra analizada son detectados
diferencialmente en el tiempo, dependiendo de las interacciones qumicas y fsicas que
establezcan con la fase estacionaria y de la composicin qumica de la fase lquida. El tiempo
que tarda un compuesto en ser eluido de la columna se denomina tiempo de retencin y se
considera una propiedad identificativa del compuesto en una determinada fase mvil y
estacionaria a cierta temperatura. Para la fase mvil, los disolventes ms utilizados por sus
diferentes caractersticas de polaridad son: el agua, el metanol y el acetonitrilo. Tambin se
utilizan sustancias como tampones, sales, o el cido trifluoroactico, que ayudan a la separacin
de los compuestos (Prez et al, 2002).

La fase mvil en el HPLC puede ser isocrtica o en gradiente; en el primer caso, la fase mvil
permanece constante durante todo el anlisis, mientras que en el segundo, la fase mvil cambia
su composicin durante el periodo del anlisis. El gradiente utilizado vara en funcin de la
hidrofobicidad de la fase mvil y busca separar los componentes de la muestra como una funcin
de la afinidad del compuesto por la fase mvil utilizada, respecto a la afinidad por la fase
estacionaria (Prez et al, 2002).

La deteccin de analitos en el HPLC puede llevarse a cabo mediante diferentes tipos de detector,
tales como: ndice de refraccin, ultravioleta/visible, electroqumico, espectrmetro de masas y
fluorimtrico (Skoog et al, 1994). De ellos, el ms utilizado es el detector ultravioleta/visible
(UV/VIS), el cual consiste en un espectrmetro que excita los analitos con radiacin
electromagntica fija o variable. Esta radiacin corresponde a longitudes de onda entre 200-380
nm en el UV y 380-780 nm en el VIS (visible). La absorcin de dicha energa depende de
requisitos estructurales del analito como: presencia de dobles enlaces y grado de conjugacin en
el UV y presencia de color en el VIS. As por ejemplo, la cantidad exacta de luz UV absorbida
20

por una sustancia se expresa como absortividad molar, la cual es una constante fsica
caracterstica de cada sustancia en particular (McMurry, 2000).
Hiptesis
Existen efectos anticolinrgicos producidos por el extracto hidroalcohlico crudo de Mucuna
urens.
Materiales y Mtodos
I Parte: Recoleccin y tratamiento del material vegetal
I a) Recoleccin del material vegetal
Los frutos de la planta Mucuna urens se recolectaron, secaron y separaron de las vainas en forma
manual con ayuda de guantes y alicate.

Las semillas se recolectaron en la localidad de Fraijanes de Pos de Alajuela, Costa Rica. A una
altitud de 1650 m.s.n.m. con las siguientes coordenadas Norte 10 7 40.8, Oeste 84
1146.3, con un error estimado de 5 metros. En el mismo sitio donde se haban llevado a cabo
las colectas anteriores para la tesis de Molina y Sols, 2003. Depsito de la muestra en el
herbario Juvenal Valerio Rodrguez de Heredia (UNA); recibido por don Marco Otrola Rojas.
I b) Tratamiento del material vegetal
Se recolectaron aproximadamente 600 gramos de material fresco (semillas). El material se
separ de cualquier impureza y se sec en una bandeja al calor del sol (poca de verano) por
aproximadamente 6 das. Una vez secas las vainas, se extrajeron las semillas; se molieron
completas en un molino Dietz-motor WRB hasta ser convertidas en un polvo fino. Luego el
polvo resultante se someti a extraccin por percolacin con una mezcla de etanol (95 ) y agua
(8:2) por tres das. Para este fin, el material se introdujo en una bolsa de manta sellada; la cual,
luego se coloc en un recipiente de vidrio que contena la mezcla hidroalcohlica. La
percolacin se realiz dos veces, con el fin de maximizar la extraccin de los componentes
presentes. El extracto obtenido de las dos extracciones se conserv en botellas mbar de vidrio
debidamente tapadas y en refrigeracin por aproximadamente 15 das para su posterior
concentracin. La concentracin del extracto por evaporacin se llev a cabo utilizando un
evaporador rotatorio a presin reducida (rotavapor) Bchi R152 (de aprox. 10 L), a una
temperatura entre 38-40 C, y el extracto acuoso obtenido, se conserv entre 4-7 das en
refrigeracin (0-8 C) hasta ser liofilizado.
I c) Liofilizacin
El extracto acuoso se congel a una temperatura aproximada de -40 C en frascos de vidrio
especiales para liofilizador (Labconco 500 mL), el procedimiento anterior se realiz rotando el
frasco con el concentrado en un bao de hielo seco (CO
2
), con etanol como sustancia criognica.
Dicho proceso se llev a cabo hasta que la muestra estuviera completamente congelada. Los
frascos se llenaron con el extracto acuoso sin exceder la tercera parte de su capacidad e
inmediatamente congelados fueron unidos a los conectores del liofilizador Labconco. Para
21

asegurar un secado completo, las muestras se mantuvieron en el liofilizador por cerca de 48
horas, luego de lo cual el material se almacen en frascos de vidrio bien tapados (recubiertos
adems con papel parafina) y guardados en un congelador a -20 C marca Forma Scientific
modelo 8339 hasta el momento de su uso.
I d) Preparacin de soluciones madre del extracto liofilizado
Se realizaron cuatro disoluciones en diferentes solventes de 100 mg del extracto hidroalcohlico
liofilizado cada una. Estas diluciones se ajustaron a concentraciones finales de 50 mg/mL en uno
de los siguientes solventes: 1) Solucin salina + 1% DMSO; 2) DMSO 100%; 3) Agua + 5%
DMSO y 4) Etanol/Agua 8:2. Todas las disoluciones fueron agitadas fuertemente a temperatura
ambiente por algunos minutos utilizando un vrtex; luego se centrifug cada solucin a 10000
r.p.m por 2.5 minutos. A continuacin, se filtr cada solucin resultante a travs de una
membrana Millipore de 0.22 m. Los filtrados constituyeron las soluciones de 50 mg/mL de
M. urens que se utilizaron sobre las clulas, en los experimentos de respuesta al calcio y en las
inyecciones de HPLC.
II Parte: Pruebas para identificacin de metabolitos secundarios
II a) Pruebas cualitativas para identificacin de grupos de metabolitos secundarios
Se llevaron a cabo pruebas cualitativas de tubo de ensayo para alcaloides, taninos, flavonoides y
glicsidos antracnicos con el extracto hidroalcohlico 8:2 de Mucuna urens. Para estas pruebas,
se coloc directamente 1 mL de extracto hidroalcohlico de M. urens o 1 mL de los residuos
provenientes de extracciones aplicadas al extracto en cada tubo de ensayo. Se agregaron 3 4
gotas de uno de los reactivos de prueba a cada tubo de ensayo, repitindose el mismo
procedimiento por separado hasta completar la lista de reactivos que se muestran en la Tabla 1.
Luego de agregar cada reactivo, se permiti que sucediera la reaccin durante 2 minutos sin
agitacin. Se observ cuidadosamente cada tubo de ensayo y se anotaron los cambios ocurridos.
Finalmente, antes de descartar los tubos de reaccin, se sometieron a agitacin manual y se
confirmaron las observaciones inicialmente realizadas (Lock, 1994; Harborne, 1973).

Las pruebas para flavonoides se realizan directamente con el extracto hidroalcohlico de M.
urens, ya que el etanol extrae bien este tipo de compuestos, y los solventes utilizados son una
mezcla mayormente etanlica (8:2). Para los dems grupos de metabolitos, se realiz la
extraccin y separacin pertinente a partir del extracto inicial.

El procedimiento seguido para la separacin y extraccin de alcaloides, glicsidos y taninos fue
el siguiente: se calentaron hasta ebullicin agitando peridicamente 20 mL del extracto
hidroalcohlico 8:2 de M. urens con 20 mL de solucin HCl al 10% por 5 min. A continuacin,
se dej enfriar la dilucin, se filtr y se extrajo 2 veces con 10 mL de cloroformo cada vez. La
capa clorofrmica de ambas extracciones se coloc en un tubo de ensayo con tapa, se le
adicionaron 5 mL de solucin de amoniaco al 10%, se agit fuertemente por 2 minutos y se dej
cubierta reposar durante 2 horas; revisando peridicamente si ocurra un cambio de color en la
capa amoniacal (prueba para glicsidos antracnicos).


22

En la Tabla 1 se describen algunos detalles del procedimiento especfico para cada tipo de
metabolito:

Tabla 1: Pruebas y reactivos para la marcha fitoqumica de algunos grupos de metabolitos
secundarios (Lpez, 1998).

Metabolito
Secundario


Reactivos de prueba

Patrones

Alcaloides.

Reactivo de Mayer, Reactivo de
Valser, cido Tnico, Reactivo de
Dragendorff, Reactivo de Wagner
y Reactivo de Reineckato.


Solucin acuosa de sales de
Quinina, Cinchonina, Atropina y
Estricnina al 0.5% cada uno.

Taninos.

Molibdato de Sodio, Ferrocianuro-
amoniaco, solucin de iones
Plomo (Pb(NO
3
)
2
), soluciones de
patrones para alcaloides, Yodato
de Potasio y Nitrito de Sodio.


Solucin acuosa de cido Tnico
al 2%.

Flavonoides.

Reactivo de Shinoda o Cianidina,
Reactivo de Wilson, cido
Sulfrico y Cloruro Frrico.


Solucin hidroalcohlica de
Quercetina al 1%.

Glicsidos
Antracnicos.

Reaccin de Borrntraeger (o
amoniaco diluido).


No se dispuso de patrn, pero se
reporta resultado de acuerdo con
la literatura (Robinson, 1967).



Con la capa acuosa restante de la extraccin, se continu trabajando de la siguiente manera: se
coloc en un embudo separador limpio, se le agregaron 10 mL de solucin de amoniaco al 30% y
se agit fuertemente. Tras la verificacin con un papel tornasol de que la solucin era alcalina
(pH >7), se realizaron nuevamente 2 extracciones sucesivas con 10 mL de cloroformo. La capa
clorofrmica obtenida de estas dos extracciones se uni y se coloc a secar en el evaporador
rotatorio a presin reducida (rotavapor). El residuo resultante de la evaporacin se volvi a
disolver en 10 mL de metanol, el cual constituy la solucin utilizada para hacer las pruebas de
alcaloides. La capa acuosa remanente de la ltima extraccin se utiliz directamente para llevar a
cabo las pruebas correspondientes a taninos.

23

III Parte: Ensayos biolgicos del extracto crudo y separado
III a) Cultivo de Clulas
Se cultivaron placas de 10 cm de dimetro (Falcon) de cada tipo celular: HEK-293, CHO, CHO-
M1 y HEK CXCR4 a una temperatura de 37 C en atmsfera humedecida de 5% CO
2
y 95%
aire. Por ser lneas de clulas adherentes fueron despegadas de las placas en cada dilucin con
tripsina 0.5% - EDTA. Las clulas HEK (transfectadas o no) se diluyeron a 1/4 cada 3 4 das;
utilizan el mismo medio de cultivo descrito a continuacin: 500 mL de medio MEM (Minimum
Essential Medium) con sales de Eagle, sin glutamina marca Gibco, ms 10% de suero fetal
bovino (no descomplementado), ms 10 mL de PSG (100 U/mL final de Penicilina, 100 g/mL
final de Estreptomicina y 2 mM final de L-Glutamina marca Invitrogen las tres).

Las clulas CHO (transfectadas o no) se diluyeron a 1/10 cada 4 das utilizando otro medio de
cultivo comn entre ellas, descrito a continuacin: 500 mL de medio F-12 (Ham) marca Gibco,
ms 5% de suero fetal bovino (no descomplementado), ms 5 mL de PS (100 U/mL final de
Penicilina y 100 g/mL final de Estreptomicina marca Invitrogen ambos). Los subcultivos
(diluciones de clulas) fueron realizados con el fin de mantener las clulas en fase de crecimiento
y disponer de clulas en condiciones ptimas para los experimentos de respuesta al calcio
(correcto % de confluencia). Se realizaron cada 3 4 das, segn la velocidad de crecimiento de
cada lnea celular. Los subcultivos, se efectuaron en una cmara de flujo laminar vertical de
seguridad biolgica marca Holten; se utilizaron materiales plsticos desechables de uso nico.
Se siguieron en toda esta parte los mtodos del Laboratorio UMR 7175 del CNRS de
Estrasburgo, Francia.
III b) Curva Dosis/Respuesta a la Acetilcolina (Ach)
Antes de comenzar a probar el extracto sobre las clulas, se realiz una curva dosis respuesta con
acetilcolina (agonista muscarnico). La curva dosis/respuesta se lleva a cabo para verificar que se
obtiene una correcta respuesta celular del sistema biolgico, que el protocolo de carga es
adecuado, que los parmetros del espectrofluormetro son correctos y que con un agonista
conocido, el valor de EC
50
es prximo al esperado.

Esta curva se llev a cabo mediante un experimento de respuesta al calcio en clulas CHO-M
1
al
90% de confluencia, suspendidas en 15 mL de tampn Hepes/ BSA/ Probenecid 2.5 mM,
utilizando como sonda Indo-1 AM 5 M final incubado por 1 hora a 37 C. Los tubos de
suspensin celular una vez preparados se guardaron por 15 minutos protegidos de la luz en un
bao-mara a temperatura regulada de 21 C antes de iniciar los ensayos. En los ensayos se
emplearon cubetas de cuarzo provistas con una pequea barra de agitacin magntica y 1.0 mL
de suspensin celular (~ 1 x 10
6
clulas/cubeta).

Los parmetros establecidos en el espectrofluormetro fueron los siguientes: Tiempo total: 240 s,
tiempo de integracin: 0.3 s, tiempo de incremento: 0.3 s, (longitud de onda) de excitacin: 338
nm, de emisin: 401 nm y ancho de rendijas: excitacin 2 nm y emisin 4 nm.

Se prepararon por aparte diluciones seriadas de acetilcolina (Ach) a partir de una solucin madre
en agua 100 mM; conservada a -20 C. Las diluciones de Ach usadas se presentan en la Tabla 2:

24

Adems se utiliz solucin madre de digitonina en agua 25 mM; almacenada tambin a -20 C.
La digitonina se adicion a las clulas en una concentracin final de 50 M un minuto antes de
terminar cada prueba. Todas las soluciones de trabajo de Ach y de digitonina se mantuvieron a 4
C durante el tiempo de experimentacin.

Tabla 2: Concentraciones de Ach realizadas para la curva dosis/respuesta sobre clulas CHO-
M
1
.
Concentracin nM para
la solucin de trabajo.
Concentracin nM final/mL en
suspensin celular.
250 1
750 3
2500 10
7500 30
25000 100
75000 300

III c) Experimentos de respuesta por calcio
Las clulas se diluyeron en el medio de cultivo respectivo descrito en la seccin IIIa, con 2 o 3
das de anticipacin. El da de la prueba se verific que se encontraran entre un 80-90% de
confluencia para continuar con la carga (introduccin de la sonda). Las clulas se lavaron con
PBS (tampn salino de fosfatos) y se colocaron a cargar por 45 minutos o por 1 hora en la
incubadora a 37 C con una mezcla de tampn Hepes/BSA (NaCl 137.5mM, MgCl
2
6H
2
O
1.25mM, CaCl
2
2H
2
O 1.25mM, KCl 6mM, Glucosa 10mM, HEPES 10mM, NaH
2
PO
4
H
2
O
0.4mM pH: 7.4) + Indo-1 AM 5 M (o Fluo-4 AM 2 M). Despus, se lavaron nuevamente las
clulas, se despegaron de la placa con una dilucin de Tripsina-EDTA (Gibco) al 0.5% y 0.2%
respectivamente a 37C, se homogenizaron, se centrifugaron y el precipitado de clulas se
resuspendi en 10 12 mL (de acuerdo con el % de confluencia) de solucin de Hepes/BSA a
temperatura ambiente. La suspensin de clulas fue distribuida en viales de polietileno con
capacidad para 1.5 mL protegidos de la luz y dejados a temperatura ambiente hasta que hubiesen
transcurrido 30 minutos desde el momento en que se quit la sonda y se realiz el lavado
posterior a la carga. Lo anterior, permiti la adecuada desesterificacin del Indo-1 AM o el Fluo-
4 AM (acetoximetil ster). Alcanzado este paso se pudo comenzar las lecturas de fluorescencia
en el espectrofluormetro con cubetas de cuarzo equipadas con una barra de agitacin magntica
y 1.0 mL de suspensin celular a temperatura regulada (21 C 37 C). Las lecturas de
fluorescencia pueden efectuarse por un periodo mximo de 90 minutos luego de concluido el
paso de desesterificacin. Para marcaje con Indo-1 se excit a 338 nm y se colectaron las
emisiones a 401 y 475 nm, por otro lado para Fluo-4, la excitacin se realiz a 494 nm y la
emisin se colect a 516 nm. Para los anlisis con Indo-1, los resultados de la emisin
fluorescente se presentan como una razn 401/475 nm.

En todos los ensayos celulares de esta seccin, se usaron 10 L de M. urens 50 mg/mL. Adems
se realizaron controles positivos con agonistas conocidos, de acuerdo con el tipo de receptor
estimulado. Se realizaron tambin controles negativos con un antagonista, de acuerdo con cada
caso, para verificar el bloqueo de la respuesta. Para este trabajo, los marcajes del calcio se
25

efectuaron con dos tipos distintos de sondas fluorescentes: el Indo-1 y el Fluo-4 adquiridos de
Molecular Probes. Como se menciono antes, se siguieron con cada tipo de clulas los mtodos
del Laboratorio UMR 7175 del CNRS de Estrasburgo, Francia.

Clulas HEK-293 no transfectadas
Se realizaron experimentos de respuesta al calcio a 21C marcado con Indo-1 y Fluo-4,
utilizando 4 disoluciones del extracto liofilizado de M. urens en:
a) DMSO 100%
b) Etanol/Agua 8:2
c) Solucin salina + 1% DMSO
d) Agua + 5% DMSO
Como agonista muscarnico se utiliz carbacol 50 M final y como antagonista se utiliz
atropina a 8 M o 10 M segn la efectividad del antagonismo.

Clulas CHO no transfectadas
Se realizaron experimentos de respuesta al calcio a 21 C marcado con Fluo-4, utilizando las
mismas 3 disoluciones del extracto liofilizado de M. urens en:
a) DMSO 100%
b) Etanol/Agua 8:2
c) Solucin salina + 1% DMSO

Como agonista se us el ATP 20 M ya que este tipo de clulas contienen receptores
purinrgicos endgenos P
2
Y. No se realiz antagonismo a falta de disponibilidad de un reactivo
con dicha funcin.

Clulas CHO-M
1
transfectadas
Se realizaron experimentos de respuesta al calcio a 21 C marcado con Fluo-4, utilizando las
siguientes disoluciones del extracto liofilizado de M. urens en:
a) DMSO 100%
b) Etanol/Agua 8:2
c) Solucin salina + 1% DMSO

Como agonistas muscarnicos se utilizaron el carbacol 50 M final y en algunas ocasiones la
acetilcolina (100 nM de acuerdo con la curva dosis/respuesta). Como antagonista se utiliz la
atropina 8 M o 10 M.

Clulas HEK CXCR4 transfectadas
Se realizaron experimentos de respuesta al calcio a 37 C marcado con Fluo-4 utilizando las
mismas 3 disoluciones del extracto liofilizado de M. urens en:
a) DMSO 100%
b) Etanol/Agua 8:2
c) Solucin salina + 1% DMSO

Como agonista CXCR4 se utiliz SDF-1 5 nM (stromal-cell derived factor 1; factor 1
derivado de las clulas del estroma) y como antagonista se utiliz el pptido T-134 a 500 nM.
26

Para confirmar que las respuestas vistas sobre las clulas no correspondieran a la accin sobre
receptores muscarnicos M
3
endgenos, se realizaron bajo las mismas condiciones, experimentos
de respuesta al calcio marcados con Fluo-4 para las 3 diluciones de M. urens. Como agonista
muscarnico se utiliz el carbacol 50 M final y como antagonista se utiliz la atropina 10 M
final.
III d) Espectros de emisin de fluorescencia de M. urens
III d1) Separacin del extracto por HPLC para la elaboracin del espectro de emisin de
fluorescencia
Para esta prueba se us la columna C
18
marca Beckman ya que result ptima para la
separacin de los componentes del extracto en las pruebas anteriores. Adems, se conserv la
misma variacin de fase mvil descrita en la seccin IV 1a) de Materiales y Mtodos. En este
caso, se realiz una inyeccin de 20 L de M. urens 25 mg/mL en solucin salina + 1% DMSO a
temperatura ambiente. La corrida se colect en fracciones de 1 ml/tubo para realizar los
espectros de emisin del extracto fraccionado. El total de fracciones colectadas fue de 51; ya que
se incluy todo el tiempo hasta alcanzar un 100% de solvente Y, ms 1 mL extra. El mL extra,
contempla el retraso existente entre la seal del detector y la recoleccin hecha por el colector de
fracciones; no obstante, los registros de los canales de deteccin se detuvieron automticamente
en el minuto 45.
III d2) Espectros de Emisin de Fluorescencia para las fracciones del extracto
Este experimento se divide en dos partes: la primera donde se excita y se colecta a las longitudes
de onda () correspondientes al Indo-1 y la segunda, las correspondientes al Fluo-4.

Para la primera parte del experimento, en el espectrofluormetro Fluorolog ISA se estableci
338nm como longitud de onda de excitacin, la cual corresponde a la misma longitud de onda de
excitacin del Indo-1. De manera que se simulan las condiciones de anlisis por fluorescencia en
la respuesta celular. Las emisiones de fluorescencia fueron colectadas de 355-500 nm, con un
incremento de 1 nm; un tiempo de integracin de 0.5 s, un ancho de rendijas espectrales de 2 nm
y una temperatura ambiente de aproximadamente (~) 21 C. Bajo las condiciones descritas, se
realiz la lectura de fluorescencia de cada una de las 51 fracciones colectadas.

Para la segunda parte del experimento, excepto las de excitacin y deteccin (emisin), todos
los dems parmetros fueron iguales a los descritos arriba. Segn lo anterior, se estableci 494
nm como de excitacin (la cual corresponde a la excitacin del Fluo-4) y la emisin de
fluorescencia fue colectada de 510-700 nm. De igual manera se realiz la lectura de
fluorescencia de las 51 fracciones colectadas ms las lecturas de ambos solventes de
cromatografa.
27

III e) Experimentos de respuesta al calcio en clulas CHO-M
1
del extracto de M. urens
separado
III e1) Pruebas de respuesta al calcio para los pooles inicialmente separados de M. urens
Los pooles 1 y 2 provenientes de una corrida especfica (C2.001) se volvieron a ensayar sobre las
clulas CHO-M
1
; procurando mantener las mismas condiciones experimentales que en las
pruebas anteriores con el extracto crudo (no fraccionado).

Se realiz un experimento de respuesta al calcio a 21 C marcado con Fluo-4 para los pooles del
extracto de M. urens resuspendidos en DMSO 100%; 5 L de cada pool por prueba. En este
experimento se realiz como en todos los casos una prueba de control inicial solo con agonista y
digitonina. Como agonista muscarnico se utiliz carbacol 50 M y como antagonista atropina
10 M.
III e2) Experimentos de respuesta al calcio en clulas CHO-M
1
para el fraccionamiento
final del extracto
Todas las fracciones de 5 minutos pertenecientes a la corrida llamada Zao7.001, se probaron
sobre las clulas CHO-M
1
. Las fracciones fueron resuspendidas en DMSO 100%; se procur
mantener las mismas condiciones experimentales que en las pruebas anteriores.

Se realizaron experimentos de respuesta al calcio a 21 C marcados con Fluo-4 para cada una de
las fracciones del extracto de M. urens, 5 L de cada fraccin por prueba. Simultneamente se
realizaron pruebas de control con solventes, agonista y digitonina. Como agonista muscarnico se
utiliz carbacol 50 M y como antagonista atropina 10 M.

IV Parte: 1) Anlisis de las disoluciones del extracto por HPLC
IV 1a) Inyecciones cromatogrficas de prueba para definir condiciones de anlisis
Las inyecciones se realizaron en un HPLC con inyector manual; cuya separacin se realiza por
medio de una columna de fase estacionaria reversa C
8
o C
18
. El gradiente de presin fue
generado por dos bombas marca Gilson 306 y 307 conectadas a un mezclador tambin
Gilson Dynamic mixer 811C. Se utiliz un detector UV-Visible marca Gilson 119 de
deteccin variable. Los canales de deteccin fueron fijados en 219 nm y 280 nm debido a que
corresponden con las longitudes de onda de mxima absorcin del Espectro ultravioleta-visible
realizado para el extracto (ver anexos, figura 1).

Las especificaciones de las columnas analticas utilizadas fueron:
C8 marca Zorbax Z5C8-25QS, dimetro de poro: 5 m, dimensiones: 4.6 mm x 25 cm.
C18 marca Beckman, dimetro de poro: 5 m, dimensiones: 4.6 mm x 15 cm.
C18 marca Phenomenex Luna, dimetro de poro: 5 m, 100 , dimensiones: 4.6 mm x 15 cm.

En esta seccin, las corridas fueron realizadas a temperatura ambiente, empleando una
combinacin de fase mvil isocrtica y en gradiente, como se muestra en la Tabla 3. El solvente
X corresponde a agua pura (Milli-Q), mientras que el solvente Y corresponde a acetonitrilo
28

(ACN) puro calidad HPLC. Las columnas fueron equilibradas con 100% X por 15 minutos,
previo al inicio de las inyecciones.

Excepto en este experimento en particular, las condiciones de fase mvil para HPLC a lo largo
de todos los ensayos, mantuvieron la adicin a ambos solventes (X y Y) de cido trifluoroactico
(TFA). El TFA se agreg a una concentracin final de 0.1% a cada solvente para bajar el pH de
la fase mvil.

Tabla 3: Fase mvil aplicada en cromatografa lquida de alta resolucin, X: H
2
O Milli-Q; Y:
ACN calidad HPLC.
Tiempo (min) X% Y% Fase Mvil Flujo (mL/min)

0 100 0 1.0
Isocrtica
10 100 0 1.0
Gradiente lineal
50 0 100 1.0
Isocrtica
51 0 100 1.0
Gradiente lineal
54 100 0 1.0
Isocrtica
55 100 0 0.1

Se realizaron inyecciones de 10 L de Mucuna urens 50 mg/mL disuelta en DMSO 100% y de
20 L de M. urens 25 mg/mL en solucin salina + 1% DMSO. Para estas primeras inyecciones
se utiliz la columna Zorbax C
8
. Luego se realizaron nuevas inyecciones de 20 L de M. urens
25 mg/mL en solucin salina + 1% DMSO y solventes solos. En estas nuevas inyecciones, se
emple una columna Beckman C
18
en la separacin. El fin de estas mltiples inyecciones, fue
determinar con cual columna (C
8
u C
18
) se lograba resolver mejor los picos de las sustancias
contenidas en el extracto de M. urens.

IV Parte: 2) Anlisis de las disoluciones del extracto por HPLC
IV 2a) Inyecciones para determinacin de la huella digital del extracto de M. urens en
diferentes solventes
Se realizaron inyecciones cada una de 20 L de Mucuna urens 50 mg/mL disuelta en 4
diferentes solventes: DMSO 100%; en Etanol/Agua 8:2; en solucin salina + 1% DMSO y en
agua + 5% DMSO utilizando la misma columna C
18
Beckman previamente seleccionada. Las
corridas se realizaron con el gradiente de fase mvil descrito en la seccin IV 1a); con la
modificacin antes mencionada de agregar el cido trifluoroactico (TFA) 0.1% a cada una de
las botellas de fase mvil. Todos los siguientes anlisis cromatogrficos de este trabajo incluyen
ese cambio.

29

Para mejorar la repetibilidad, se decidi implementar entre cada inyeccin los siguientes pasos
de limpieza: primero se hizo una inyeccin de agua Milli Q correspondiente al doble del
volumen de la capacidad del lazo usado. Se dej el lazo en posicin de inyeccin (abierto).
Luego, con un flujo de 1.0 mL/min se asciende hasta 100% ACN + 0.1% TFA en 10 minutos, se
permiti que se estabilizaran las longitudes de onda con 100% ACN y luego se hace un gradiente
hacia agua + 0.1% TFA en 10 minutos al mismo flujo. Para finalizar, se verific antes de volver
a inyectar, la estabilidad de ambos canales de deteccin (seal en cero a lo largo de la lnea base
para 219 nm y 280nm).
IV 2b) Inyeccin para determinacin de la huella digital mejorada del extracto de M. urens
en DMSO 100%
Luego de varias pruebas de separacin por HPLC, se realiz la huella digital del extracto disuelto
en DMSO 100% con la mejor separacin obtenida. Se utilizaron 5 L de extracto crudo con un
gradiente de fase mvil descrito en la Tabla 4.
Tabla 4: Fase mvil aplicada en cromatografa lquida de alta resolucin, X: H
2
O Milli-Q +
0.1% TFA; Y: ACN + 0.1% TFA calidad HPLC.
Tiempo (min) X% Y% Fase Mvil Flujo (mL/min)

0 100 0 1.0
Isocrtica
10 100 0 1.0
Gradiente lineal
40 70 30 1.0
Isocrtica
50 70 30 1.0
Gradiente lineal
60 0 100 1.0
Isocrtica
75 0 100 1.0
Gradiente lineal
80 100 0 1.0
Isocrtica
85 100 0 1.0

IV Parte: 3) Separacin y fraccionamiento inicial de las disoluciones
del extracto por HPLC
IV 3a) Inyecciones de separacin y fraccionamiento inicial del extracto crudo
Se realizaron dos inyecciones de 200 L de extracto de Mucuna urens 50 mg/mL disuelto en
DMSO 100% bajo el mtodo de separacin C2 descrito en la Tabla 5. Solo se presentan los datos
para una de las corridas aunque se analizaron ambas; adems en la colecta se contempla el
retraso de 1 mL/min entre el detector y el colector de fracciones.
30

Tabla 5: Fase mvil aplicada en HPLC, para la corrida B de separacin, X: H
2
O Milli-Q + 0.1%
TFA; Y: ACN calidad HPLC + 0.1% TFA.
Tiempo (min) X% Y% Fase Mvil Flujo (mL/min)

0 100 0 1.0
Isocrtica
20 100 0 1.0
Gradiente lineal
55 0 100 1.0
Gradiente lineal
60 100 0 1.0
Isocrtica
62 100 0 0.1


Con la ayuda de un colector de fracciones Gilson FC 205 se colectaron las fracciones a 5
mL/tubo durante el tiempo de corrida (60 minutos), luego se eligieron los puntos de separacin
de acuerdo con la polaridad de las seales obtenidas. Se establecieron los pooles 1 y 2 de
caractersticas hidroflicas e hidrofbicas respectivamente (ver figura 35). El Pool 1
corresponde a las fracciones de los minutos 1-20 del cromatograma, y el Pool 2 a las fracciones
comprendidas entre los minutos 20-60 del mismo cromatograma.
IV 3b) Preparacin, concentracin y redisolucin de los pooles establecidos en la
separacin inicial
Las fracciones colectadas cada 5 minutos en tubos de vidrio se concentraron utilizando una
centrfuga de vaco marca Speed-Vac a velocidad baja por ~30 horas. Los residuos secos de las
fracciones cada cinco minutos se diluyeron nuevamente por separado en un volumen de 5 L de
DMSO 100% cada una y se agitaron en un vrtex a alta velocidad por 2 minutos. Luego de
disueltas las fracciones, se juntaron las cuatro fracciones del minuto 1-20 en lo que constituy el
Pool 1 (20 L) y las ocho fracciones del minuto 20-60 en lo que constituy el pool 2 (40 L).

Todo el proceso anterior se llev a cabo de la misma manera para las colectas de las corridas C2.
Estas nuevas diluciones de los pooles del extracto separado constituyeron el material de prueba
para continuar los ensayos sobre clulas CHO-M
1
.
IV 3c) Inyecciones para comprobacin de fraccionamiento inicial del extracto
Con los pooles de las corridas C2 obtenidos en el paso anterior, se realizaron inyecciones de 5
L de extracto de la corrida C2.001 para verificar la separacin entre los pooles. La fase mvil
empleada en este caso fue la misma que para la corrida de separacin IV 1a). Las inyecciones se
realizaron a temperatura ambiente y adems se realiz al finalizar, una inyeccin de blanco con 5
L de DMSO 100% (solvente).


31

IV Parte: 4) Separacin y fraccionamiento final de las disoluciones
del extracto por HPLC
IV 4a) Inyecciones de separacin y fraccionamiento final del extracto crudo
Se realizaron varias pruebas de HPLC variando el gradiente de fase mvil, inyectando la
disolucin de M. urens 50 mg/mL en DMSO 100% (datos no mostrados). Lo anterior con el
objetivo de mejorar la separacin de los componentes de M. urens a partir directamente de la
disolucin del extracto.

De estas pruebas, en la que comienza a observarse una mejor separacin de los componentes del
extracto, es la corrida llamada Zhao.001. Se usaron 20 L de M. urens 50 mg/mL en DMSO
100% con la fase mvil Zhao descrita en la Tabla 6.
Tabla 6: Fase mvil Zhao aplicada en HPLC, para los ensayos de separacin, X: H
2
O Milli-Q
+ 0.1% TFA; Y: ACN calidad HPLC + 0.1% TFA.
Tiempo (min) X% Y% Fase Mvil
0 100 0
Isocrtica
10 100 0
Gradiente lineal
40 70 30
Isocrtica
50 70 30
Gradiente lineal
60 0 100
Gradiente lineal
70 100 0
Tabla 7: Fase mvil Zao7 aplicada en HPLC para los ensayos de fraccionamiento del extracto,
X: H
2
O Milli-Q + 0.1% TFA; Y: ACN calidad HPLC + 0.1% TFA.
Tiempo (min) X% Y% Fase Mvil
0 100 0
Isocrtica
20 100 0
Gradiente lineal
50 70 30
Isocrtica
60 70 30
Gradiente lineal
70 0 100
Isocrtica
85 0 100
Gradiente lineal
90 100 0
32

El registro de los canales de deteccin se detuvo a los 65 minutos y la velocidad de flujo durante
la corrida completa fue de 1 mL/min.

Como prueba final, se llev a cabo una inyeccin de 400 L de extracto de M. urens 50 mg/mL
en DMSO 100%, utilizando una fase mvil similar a la anterior. Los eventos de la fase mvil
Zao7 se muestran en la Tabla 7. Ambos canales de deteccin se detuvieron a los 90 minutos.
La corrida se colect cada 5 mL/tubo a partir del minuto 1 del cromatograma hasta el minuto 91;
por el retraso existente entre el detector y el colector. El flujo de la fase mvil se mantuvo en 1
mL/min y los canales de deteccin a 219 y 280 nm.
IV 4b) Preparacin, concentracin y redisolucin de las fracciones provenientes de la
separacin final
Las fracciones colectadas cada 5 minutos en tubos de vidrio se concentraron utilizando una
centrfuga de vaco marca Speed-Vac a velocidad baja por ~30 horas. Los residuos secos de las
fracciones cada cinco minutos se diluyeron nuevamente por separado en un volumen de 20 L de
DMSO 100% cada una y se agitaron en un vrtex a alta velocidad por 2 minutos. Luego de
disueltas, se ensay en el modelo biolgico cada una de las fracciones (o sea 18 fracciones en
total).

Resultados
I Parte: Pruebas para identificacin de metabolitos secundarios
Tabla 8: Pruebas cualitativas para identificacin de alcaloides en el extracto hidroalcohlico 8:2
de Mucuna urens.
Pruebas para
Alcaloides
Reactivo de
Mayer
Reactivo de
Valser
Solucin
de cido
Tnico
Reactivo de
Dragendorff
Reactivo
de Wagner
Reactivo
de
Reineckato

Patrn de
alcaloides al 0.5%
(Quinina,
Cinchonina,
Atropina y
Estricnina)

Precipitado
color blanco
en el fondo
Precipitado
color
amarillo en
el fondo
Precipitado
color
blanco en
el fondo
Precipitado
color naranja
en el fondo
Precipitado
color
marrn en el
fondo
Precipitado
color rosado
floculante
Extracto
hidroalcohlico 8:2
de Mucuna urens

negativa

negativa

negativa negativa negativa negativa
33

Tabla 9: Pruebas cualitativas para identificacin de glicsidos antracnicos en el extracto
hidroalcohlico 8:2 de Mucuna urens.

Prueba para Glicsidos Antracnicos

Solucin amoniacal acuosa o
reaccin de Borrntraeger
Extracto hidroalcohlico 8:2 de Mucuna urens





negativa

(color rojo cereza en la capa acuosa si es
positiva la prueba)




Como se observa en las Tablas 8 y 9, no se detect ninguna reaccin positiva para alcaloides
(Tabla 8), ni para glicsidos antracnicos (Tabla 9).

En la tabla 10 se observa como cuatro de las pruebas para taninos fueron positivas, por lo que se
puede presumir que M. urens contiene componentes del grupo de los taninos.

Tabla 10: Pruebas cualitativas para identificacin de taninos en el extracto hidroalcohlico 8:2
de Mucuna urens.
Pruebas para
Taninos

Molibdato
de Sodio
Ferrocianuro-
amoniaco
Solucin
de iones
Plomo
Solucin
de
alcaloides
Yodato
de
Potasio
Nitrito de
Sodio
Patrn de cido
Tnico al 2%



Solucin
translcida
rojo-naranja
Solucin
translcida
amarilla
Precipitado
blanco en el
fondo
(cristales)
Precipitado
blanco en el
fondo
(grnulos)
Solucin
naranja
oscuro
translcido

Reaccin
burbujeante
que deja
solucin
amarillo
oscuro

Extracto
hidroalcohlico 8:2
de Mucuna urens

positiva negativa positiva negativa positiva positiva



34

Tabla 11: Pruebas cualitativas para identificacin de flavonoides en el extracto hidroalcohlico
8:2 de Mucuna urens.
Pruebas para
Flavonoides

Reactivo de
Shinoda o
Cianidina
Reactivo de Wilson
cido
Sulfrico
Cloruro
Frrico



Patrn de Quercetina al
1%




Solucin
translcida rojo
sangre
Solucin translcida
amarilla que da
fluorescencia
amarillo-verdoso a
365 nm (UV)
Solucin
translcida
amarillo
oscuro
Solucin
opaca verde
oscuro
Extracto hidroalcohlico
8:2 de Mucuna urens

negativa negativa negativa positiva


Cabe la posibilidad de que algn (os) metabolito (s) con grupos estructurales similares a los
flavonoides o con varios grupos OH, est presente en el extracto (ver tabla 11); ya que la prueba
de cloruro frrico fue positiva. Sin embargo, si solo esa prueba fue positiva no se puede
presumir que existan flavonoides en el extracto; pues la prueba de cloruro frrico, no es
especfica de flavonoides (tambin se usa para taninos) y las dems pruebas del grupo fueron
negativas.

II Parte: Ensayos biolgicos del extracto crudo y separado
II 1) Experimentos de respuesta de calcio sobre receptor M
3
. Clulas HEK-293 no
transfectadas

II 1a) Comparacin de disoluciones de extracto bruto en diferentes solventes
La actividad que se busc en estas clulas fue aquella relacionada con el receptor M
3
endgeno,
aunque es importante mencionar que las clulas poseen otros receptores endgenos que podran
ser susceptibles a activacin por las sustancias presentes en el extracto.
35



Figura 5: Respuesta al calcio desencadenada por el receptor M
3
en clulas HEK-293 empleando
como sonda Indo-1. Emisiones tomadas a 401 y 475 nm; temperatura regulada a 21 C. A) M.
urens 50 mg/mL en solucin salina + 1% DMSO y solvente, datos brutos. B) Extracto y solvente
de la misma prueba, con valores de fluorescencia normalizados.


En la figura 5A se observa como seala la primera flecha (tiempo 1 min) que se agrega extracto
crudo disuelto en solucin salina o solvente segn corresponda; como puede notarse la adicin
del extracto produjo un incremento sbito en el nivel de fluorescencia pero sin ninguna respuesta
celular (auto fluorescencia del extracto). La adicin de solvente no mostr ningn efecto ni de
fluorescencia, ni de liberacin intracelular de calcio sobre las clulas. A los 4 min y 4 min 40 s se
sealan la adicin de carbacol, agonista que produjo la respuesta por movilizacin de calcio en
ambas ocasiones. En la cuarta flecha (tiempo 7 min) se seala la adicin de digitonina,
detergente que produce el aumento mximo posible de fluorescencia al tomar en cuenta todo el
calcio (intra y extra celular). Como puede notarse, las medidas de fluorescencia para el solvente
(verde claro), tanto en el carbacol como en la digitonina parecen mayores; sin embargo, como se
demuestra en la figura 5B (parte superior), al normalizar los datos tomando la digitonina como el
mximo de calcio (100% de respuesta), ambas respuestas son de amplitud equivalente.

36

Para las primeras pruebas, el marcaje del calcio fue realizado con la sonda Indo-1. En todos los
casos donde se use esta sonda, se hizo una razn de ambas longitudes de onda para presentar los
datos; a menos que se indique lo contrario. La temperatura en este caso fue fijada a 21 C.

En la figura 6A y 6B se observa en la primera flecha (minuto 1) que se agrega extracto disuelto
en DMSO puro o agua + DMSO respectivamente; junto a los solventes de cada caso. Como
puede notarse en la figura 6A, la adicin del extracto produce un incremento sbito en el nivel de
fluorescencia, pero sin ninguna respuesta celular. La adicin de solvente en ambos casos no
realiz ningn efecto ni de fluorescencia, ni de liberacin intracelular de calcio al minuto uno. Al
minuto 4 se seala la adicin de carbacol, este agonista produce la respuesta por movilizacin de
calcio (espiga) en ambas figuras (A y B) tanto para el extracto como para los solventes. En el
minuto 7 se seala la adicin de digitonina (detergente que rompe las membranas), para asegurar
el nivel mximo de fluorescencia (calcio intra y extra celular). Al igual que para el caso anterior,
la normalizacin de los grficos siguientes, mostr una respuesta de amplitud equivalente del
carbacol en cada uno de los casos (datos no mostrados).




Figura 6: Respuestas al calcio desencadenadas por el receptor M
3
, en clulas HEK-293
empleando como sonda Indo-1; emisiones tomadas a 401 y 475 nm; temperatura regulada a 21
C. A) M. urens 50 mg/mL en DMSO 100%. B) M. urens 50 mg/mL disuelta en agua + 5%
DMSO.

37



Figura 7: Respuesta al calcio desencadenada por el receptor M
3
, al adicionar M. urens 50
mg/mL disuelta en EtOH/H
2
O 8:2, clulas HEK-293 cargadas con la sonda Indo-1; emisiones
tomadas a 401 y 475 nm; temperatura regulada a 21 C.


En la figura 7 se observa como seala la primera flecha (minuto 1) que se agrega extracto
disuelto en etanol/agua 8:2 o solvente segn corresponda. La lnea en la que se agrega atropina y
extracto posee un minuto de retraso en la adicin de extracto (minuto 2) y no disminuy la giba.
Como puede notarse la adicin del extracto produce un incremento sbito en el nivel de
fluorescencia y una cuantificable respuesta celular en forma de giba.

La adicin de solvente provoca un efecto de aumento muy sutil en la lnea base por movilizacin
de calcio, el cual no es de la misma magnitud que aquel producido por el extracto. En el minuto
4 y 5 se seala la adicin de carbacol que produce la respuesta por calcio en los ensayos de
extracto solo y solvente, pero no en el que fue agregada anteriormente la atropina al extracto,
debido al bloqueo muscarnico.

En la ltima flecha (tiempo 7 min) se seala la adicin de digitonina que asegura el mximo de
fluorescencia posible en cada ensayo (100% al normalizarlo).

38



Figura 8: Respuesta al calcio desencadenada por el receptor M
3
en clulas HEK-293, empleando
como sonda Fluo-4; emisin tomada a 516 nm; temperatura regulada a 21 C.
A) M. urens 50 mg/mL en solucin salina + 1% DMSO y solvente. B) M. urens 50 mg/mL en
EtOH/H
2
O 8:2 y solvente.

En la figura 8, se observa un experimento de respuesta al calcio en el mismo tipo de clulas y
con las mismas condiciones anteriores, variando en esta ocasin solamente el tipo de sonda
utilizado para el marcaje (Fluo-4). La dinmica de adicin de los compuestos tal como se indica
en la figura 8A (extracto disuelto en solucin salina + 1% DMSO) y 8B (extracto disuelto en
EtOH/ H
2
O 8:2) fue: a 1 minuto extracto crudo o solvente, a los 4 minutos carbacol 50 M final
y a los 7 minutos digitonina 50 M. Ninguna de estas dos disoluciones de extracto o solvente
produjo respuesta M
3
.


Figura 9: Respuesta al calcio desencadenada por el receptor M
3
en clulas HEK-293, empleando
como sonda Fluo-4; emisin tomada a 516 nm; temperatura regulada a 21 C.
A) M. urens 50 mg/mL en DMSO 100% y solvente. B) M. urens 50 mg/mL en agua + 5%
DMSO y solventes.
39

Finalmente, en la figura 9A y 9B se muestra el mismo tipo de experimento; pero utilizando el
extracto disuelto en DMSO 100% y agua + 5% DMSO respectivamente. La dinmica de adicin
de los compuestos fue la misma que para la figura 8 y se encuentran indicadas en los grficos.

En ninguno de los dos ltimos casos de M. urens en diferentes solventes (DMSO y agua + 5%
DMSO) se present una respuesta al calcio por el receptor M
3
; aunque estos receptores se
encontraban en condiciones de responder al estmulo de un agonista, como puede comprobarse
en cada uno de los grficos mediante la giba producida por el carbacol.


II Parte: Ensayos biolgicos del extracto crudo y separado
II 2) Espectros de emisin de fluorescencia de M. urens
II 2a) Separacin del extracto por HPLC para la elaboracin del espectro de emisin de
fluorescencia
Se realiz la inyeccin de 20 L de M. urens cruda 25 mg/mL disuelta en solucin salina + 1%
DMSO como se muestra en la figura 10; con el fin de colectar todas las fracciones de la corrida a
1 mL/tubo cada una. Con esas fracciones, se efectu luego el espectro de emisin fluorescente a
las longitudes de onda del Indo-1 y del Fluo-4.




Figura 10: Cromatograma resultado de un anlisis de HPLC en gradiente con columna C
18
,
inyeccin de 20 L de M. urens 25 mg/mL en solucin salina + 1% DMSO a T. A. Colecta de
fracciones a 1 mL/min.
40

II 2b) Espectros de Emisin de Fluorescencia para las fracciones del extracto
En la figura 11 se muestran las fracciones ms representativas del extracto (aunque se analizaron
las 51 mencionadas en la metodologa), representando solo unas del inicio de la corrida y otras
del final; as como uno de los solventes utilizados en HPLC y en los cuales salen disueltas las
fracciones colectadas (blanco de fluorescencia). Se eligieron estas fracciones, ya que mostraron
los valores ms altos de fluorescencia bajo las condiciones del Indo-1 o del Fluo-4.



Figura 11: Espectro de Emisin de Fluorescencia para fracciones colectadas por HPLC de M.
urens 25 mg/mL en solucin salina + 1% DMSO a T. A.

Como puede observarse en la figura 11, para la primera parte de la prueba la excitacin se realiza
a 338 nm, la cual corresponde a la misma longitud de onda de excitacin de la sonda Indo-1 que
luego se utilizar en los ensayos biolgicos con clulas. Siguiendo con el grfico, el espectro de
emisin es colectado entre 355 y 500 nm que comprende ambas longitudes de onda de emisin
mxima que corresponderan al Indo-1 (401 y 475 nm) para determinar posibles interferencias
fluorescentes de las fracciones del extracto. En este caso se observa como las fracciones 8 y 9
producen la ms alta cantidad de fluorescencia, sobre todo a 401nm (marcado en el grfico), lo
cual coincide con la longitud de emisin ms importante del Indo-1.

Ese experimento fue llevado a cabo para las mismas fracciones pero simulando las condiciones
de anlisis del Fluo-4; excitacin 494 nm, espectro de emisin entre 510 y 700 nm, el cual
comprende la longitud de onda de trabajo del Fluo-4: 516 nm (marcada en el grfico); y como
41

puede observarse, la cantidad de fluorescencia producida por las fracciones del extracto fue
mnima comparada con la producida bajo las condiciones del Indo-1.

II 3) Experimentos de respuesta de calcio sobre receptor M
1
. Clulas CHO-M
1

transfectadas
II 3a) Curva Dosis/Respuesta a la Acetilcolina (Ach)
Antes de comenzar a hacer pruebas del extracto crudo y fraccionado, se realiz una curva
dosis/respuesta con acetilcolina que fue utilizado en los primeros experimentos (datos no
mostrados en este trabajo). La curva dosis/respuesta para carbacol no se realiz ya que los
protocolos de trabajo del laboratorio UMR 7175 del CNRS: Biomolculas, Biotecnologa e
Innovacin Teraputica la tenan establecida de antemano en: 50 M, as como la concentracin
de antagonista (atropina 10 M) a ser utilizado para bloquear dicha respuesta en clulas CHO-
M
1
.


Figura 12: Respuesta al calcio en clulas CHO-M
1
; curva Dosis/Respuesta correspondientes a la
Acetilcolina empleando como sonda Indo-1; emisin tomada solamente a 401 nm y temperatura
regulada a 21 C.

En la figura 12 se observa un experimento de respuesta al calcio en clulas CHO-M
1
en la cual
en cada ensayo se adicionan concentraciones crecientes de acetilcolina para formar una curva
dosis/respuesta.
42

En la misma figura, podemos ver como a concentraciones bajas de agonista no se obtiene
respuesta; no es sino hasta 10 nM que la acetilcolina supera el umbral de activacin sobre el
receptor movilizando calcio. La Ach contina aumentando la respuesta hasta un punto mximo
en el cual por ms exceso de agonista que se aplique, la amplitud de la respuesta no incrementa
(~300 nM). De la curva anterior se extrae que la EC
50
para la Ach es de 25.5 nM y que la
concentracin ptima que se debe utilizar sobre las clulas CHO-M
1
es de 100 nM, ya que
produce una respuesta considerable, pero no mxima.

Se calcul el porcentaje de respuesta de acuerdo a la normalizacin con digitonina como un
100% de respuesta. Dicho porcentaje de respuesta para las cuatro ltimas concentraciones de
Ach (de 10 a 300 nM) permiti obtener la figura de la parte superior. Al graficar el porcentaje de
respuesta obtenido de Ach versus la concentracin de Ach utilizada se consigue una funcin que
sigue la forma hiperblica de la curva dosis/respuesta terica.

II 3b) Comparacin de disoluciones de extracto bruto en diferentes solventes y bloqueo por
atropina
Se realizan las mismas pruebas que para el receptor M
3
sobre el M
1
, usando Fluo-4 como sonda;
ya que como se vio en los espectros de emisin de las fracciones del extracto, con esta sonda las
medidas de fluorescencia por calcio presentan muy poca interferencia. Se omiti la solucin en
agua + 5% DMSO; ya que en algunas pruebas iniciales sobre el receptor M
1
marcadas con Indo-
1 (datos no mostrados) no se obtuvo ningn tipo de actividad (agonista o antagonista).

Como se aprecia en la figura 13A el extracto disuelto en solucin salina no produce ninguna
respuesta por liberacin de calcio (activacin del receptor). Los solventes no muestran ninguna
interferencia o variacin en la lnea base. La dinmica de adicin de los compuestos fue la
misma que la expuesta para la figura 8 y adems se indica en cada grfico.



Figura 13: Respuesta al calcio en clulas CHO-M
1
empleando como sonda Fluo-4; emisin
tomada a 516 nm; temperatura regulada a 21 C.
A) M. urens 50 mg/mL en solucin salina + 1% DMSO y solventes. B) M. urens 50 mg/mL en
solucin salina + 1% DMSO al adicionar atropina 8 M.
43


Las lneas verticales sobre cada punto de evento, fueron producidas por la inyeccin de los
componentes en el espectrofluormetro. Estas lneas, provienen de la luz que entra al
compartimiento de prueba al abrir la ventanilla y descargar cada uno de los componentes antes
indicados.

La concentracin de atropina utilizada fue de 8 M o 10 M; pues as la recomendaban como
ptima los protocolos establecidos en el laboratorio de Biomolculas para Fluo-4 en ese tipo de
clulas.

Aunque con el extracto crudo disuelto en solucin salina no se obtuvo respuesta, se realiz un
ensayo con extracto y atropina (figura 13B), para confirmar el correcto bloqueo de la respuesta a
carbacol en presencia de extracto y el mximo de fluorescencia alcanzado por la digitonina.



Figura 14: Respuesta al calcio en clulas CHO-M
1
empleando como sonda Fluo-4; emisin
tomada a 516 nm; temperatura regulada a 21 C. A) M. urens 50 mg/mL en DMSO 100% y
solvente. B) M. urens 50 mg/mL en DMSO 100% al adicionar atropina 8 M.

En la figura 14A, el extracto disuelto en DMSO produjo una respuesta muscarnica apreciable
por liberacin de calcio (agonismo del receptor). El solvente en este caso no mostr ningn
cambio en la lnea base al ser adicionado a las clulas. Los controles con carbacol respondieron
realizando las gibas correspondientes en el caso de extracto y de solvente. La digitonina mostr
un nivel de fluorescencia correspondiente.

La respuesta desencadenada por el extracto (figura 14A), fue bloqueada completamente por la
atropina (respuesta muscarnica antagonisada) y el carbacol tambin fue correctamente
bloqueado como se muestra en la figura 14B.
44



Figura 15: Respuesta al calcio en clulas CHO-M
1
empleando como sonda Fluo-4; emisin
tomada a 516 nm; temperatura regulada a 21 C. A) M. urens 50 mg/mL en EtOH/H
2
O 8:2 y
solventes. B) M. urens 50 mg/mL en EtOH/H
2
O 8:2 calcio al adicionar Atropina 8 M.

En la figura 15A se muestra el mismo tipo de prueba pero adicionando el extracto disuelto en
etanol/agua 8:2; se obtuvo una gran respuesta agonista al agregar el extracto (giba azul luego de
1 minuto). El solvente no provoc ningn efecto sobre las clulas. La digitonina alcanz un nivel
mximo muy parecido (calcio total); ya que con la sonda Fluo-4 no se present el ruido de fondo
(autofluorescencia) de los componentes del extracto.

La respuesta vista en la figura 15A provocada por el extracto, fue bloqueada parcialmente segn
la figura 15B al agregar atropina (giba despus de 2 minutos). La cantidad de atropina colocada
fue suficiente puesto que se confirma en el minuto 5, el bloqueo completo de la respuesta a
carbacol.

Debido a la sospecha de una reduccin de amplitud en la respuesta del agonista control al colocar
el extracto, fue realizada una curva dosis/respuesta con Mucuna urens disuelta en DMSO 100%.
Dicha curva dosis/respuesta, es presentada en los anexos, para corroborar si se trataba de un
efecto producido por el extracto en forma dosis dependiente o no (ver figura 2 en anexos).

Adems, se realiz otra prueba con agonistas de diferentes receptores (M
1
y purinrgicos) en las
mismas clulas. Lo anterior, con el fin de verificar si la disminucin en la respuesta al agonista
se deba a antagonismo muscarnico del extracto o a una desensibilizacin general de receptores
(ver figura 3 en anexos).

II 3c) Respuestas de las disoluciones del extracto bruto en clulas CHO no transfectadas,
sin receptor M
1

Las clulas CHO no poseen normalmente ningn receptor muscarnico asociado con protenas G
por lo que se verifica la respuesta mediante los receptores purinrgicos endgenos con adenosina
trifosfato (ATP) como agonista.

45



Figura 16: Respuestas al calcio por receptores endgenos en clulas CHO no transfectadas
empleando como sonda Fluo-4; emisiones tomadas a 516 nm; temperatura regulada a 21 C. A)
M. urens 50 mg/mL disuelta en salina + 1% DMSO y solvente. B) M. urens 50 mg/mL disuelta
en DMSO 100% y solvente.

Como se aprecia en las figuras 16A y 16B el extracto no produce ninguna respuesta por
liberacin de calcio (activacin de receptores). En 16B el extracto realiz una especie de
fluorescencia que no es una respuesta ya que no desciende en forma de giba. Los solventes no
mostraron ninguna respuesta, interferencia o variacin en la lnea base. En ambas figuras se
observa como al agregar el ATP, este produce una respuesta agonista desencadenada por los
receptores purinrgicos endgenos.



Figura 17: Respuesta al calcio por receptores endgenos de clulas CHO no transfectadas, al
adicionar M. urens 50 mg/mL en EtOH/H
2
O 8:2 y solventes. Se emple como sonda Fluo-4,
emisin tomada a 516 nm; temperatura regulada a 21 C.
46

En la figura 17, a diferencia de lo visto en las figuras 16A y 16B; el extracto disuelto en
etanol/agua produce una pequea respuesta a ser considerada. Esta giba luego de 1 minuto, fue
producida por la liberacin de calcio al activarse algn receptor endgeno. El solvente en este
caso, no muestra ningn cambio en la lnea base. Y los dems controles con ATP (agonista
purinrgico) y digitonina, presentaron respuestas en forma de giba como las habituales.

II 4) Experimentos de respuesta de calcio sobre receptor CXCR4. Clulas HEK CXCR4
transfectadas
II 4a) Comparacin de disoluciones de extracto bruto en diferentes solventes
Estas clulas poseen el receptor CXCR4 (de quimiocinas) transfectado, hay que tomar en cuenta
que existen en ellas otros tipos de receptores endgenos. El acople del receptor a G q se realiza
a temperaturas fisiolgicas por lo que se regula la temperatura a 37 C. Para estos ensayos se
realiza el agonismo con el SDF-1 (stromal-cell derived factor 1) y el correspondiente
antagonismo con el conocido pptido T134.



Figura 18: Respuesta al calcio por CXCR4. Sonda empleada Fluo-4; emisiones tomadas a 516
nm, temperatura regulada a 37 C. A) M. urens 50 mg/mL en solucin salina + 1% DMSO y
solventes. B) M. urens 50 mg/mL en solucin salina + 1% DMSO + T134.


La dinmica de adicin de los compuestos como se observa en la figura 18A es la siguiente: a 1
minuto extracto crudo o solvente, a los 4 minutos SDF-1 5 nM final y a los 7 minutos digitonina
50 M. En el caso del extracto ms T134 (figura 18B) se produce un retraso de 1 min en el
tiempo de adicin del extracto (a los 2 min) y el SDF-1 (a los 5 min); ya que en el minuto 1 se
agrega el antagonista (T134 500 nM). La digitonina conserva su adicin a ~7 minutos y presenta
una leve disminucin en el nivel de fluorescencia por calcio total.

47



Figura 19: Respuesta al calcio por CXCR4. Sonda empleada Fluo-4; emisiones tomadas a 516
nm, temperatura regulada a 37 C. A) M. urens 50 mg/mL en DMSO 100% y solventes. B) M.
urens 50 mg/mL en DMSO 100% + T134.


Como se aprecia en la figura 18 A y B, el extracto produce una respuesta notoria por liberacin
de calcio (activacin de un receptor), la cual no es bloqueada por el T134. El solvente no mostr
ningn cambio en la lnea base.

En la figura 19A se observa que el extracto produce una respuesta por liberacin de calcio
(activacin de un receptor), la cual no es bloqueada por el T134 (19B). La adicin de solvente,
muestra una respuesta en la lnea base de igual amplitud a la del extracto para la disolucin con
DMSO.

En la figura 19B se observa claramente que el extracto produce una respuesta bifsica, con una
giba rpida en forma de pico, seguida de una giba lenta y extensa, dicha respuesta no fue debida
al receptor de quimiocinas CXCR4, puesto que la respuesta a SDF-1 fue satisfactoriamente
bloqueada.

En las figuras 20A y 20B se observa que el extracto produce una respuesta notoria por liberacin
de calcio (activacin de un receptor); la cual no es bloqueada por el T134. La adicin de solvente
muestra por s misma una respuesta en la lnea base, pero de menor amplitud que para el extracto
disuelto en etanol/agua.
48



Figura 20: Respuesta al calcio por CXCR4. Sonda empleada Fluo-4; emisiones tomadas a 516
nm, temperatura regulada a 37 C. A) M. urens 50 mg/mL en EtOH/H
2
O 8:2 y solventes. B) M.
urens 50 mg/mL en EtOH/H
2
O + T134.
II 4b) Respuesta de disoluciones de extracto bruto bloqueadas con atropina
Por poseer estas clulas otros tipos de receptores endgenos como el M
3
se verifica si las
respuestas vistas con el extracto a 37 C corresponden a dicho receptor muscarnico. Para estos
ensayos se realiza el agonismo con carbacol 50 M y el correspondiente antagonismo con
atropina 10 M.

En el caso de la figura 21 A y B (disolucin en salina), la respuesta agonista del extracto se
mantiene igual aunque se agregue atropina; mientras el solvente no presenta respuesta.



Figura 21: Respuesta al calcio por M
3
en clulas HEK CXCR4. Sonda empleada Fluo-4;
emisiones tomadas a 516 nm, temperatura regulada a 37 C. A) M. urens 50 mg/mL en solucin
salina + 1% DMSO y solventes. B) M. urens 50 mg/mL en solucin salina + 1% DMSO +
atropina.
49


En la figura 22A (disolucin en etanol/agua) nuevamente se produce una respuesta, la cual no es
bloqueada por la atropina (figura 22B) y adems, la respuesta agonista que se obtiene con los
solventes es menor que la obtenida con el extracto crudo. En este caso la respuesta producida por
el extracto es de mayor intensidad que con la solucin salina y con una forma de giba diferente.



Figura 22: Respuesta al calcio por M
3
en clulas HEK CXCR4. Sonda empleada Fluo-4;
emisiones tomadas a 516 nm, temperatura regulada a 37 C. A) M. urens 50 mg/mL disuelta en
EtOH/H
2
O 8:2. B) M. urens 50 mg/mL disuelta en EtOH/H
2
O 8:2 + atropina y solventes.

II 5) Tabla resumen de todos los experimentos de respuesta de calcio realizados sobre los
diferentes receptores mencionados
Tabla 12: Resumen de las respuestas por calcio al agregar el extracto hidroalcohlico crudo
liofilizado de Mucuna urens en diferentes lneas celulares.

Antagonista
usado
CHO M
1

21C
CHO
21C
HEK-293
21C y 37C
HEK-293
CXCR4, 37C
Extracto en
solucin salina
+ 1 % DMSO

sin Atropina
con Atropina
sin T134
con T134
+/-
-
x
x
-
x
x
x
- -
- -
x x
x x
+
+
+
+

Extracto en
DMSO 100 %
sin Atropina
con Atropina
sin T134
con T134

+
Bloqueada
x
x
-
x
x
x
- +
- +
x x
x x
+/-
+/-
+/-
+/-

Extracto en
EtOH/H
2
O 8:2

sin Atropina
con Atropina
sin T134
con T134
+
Reducida
x
x
+/-
x
x
x
+/- +
+ +
x +
x +
+
+
+
+
50

+: Present respuesta agonista -: No present respuesta
x: Prueba no realizada o no pertinente +/-: En ocasiones present respuesta y en otras no

En la tabla 12 se registra un resumen de todas las pruebas realizadas con el extracto crudo en los
diferentes receptores y lneas celulares (mostradas anteriormente). Todos los ensayos,
corresponden a mediciones de calcio intracelular.
III Parte: 1) Anlisis de las disoluciones del extracto por HPLC
III 1a) Inyecciones cromatogrficas de prueba para definir condiciones de anlisis
En la figura 23A se observa la huella digital producida por los componentes de M. urens disuelta
en DMSO 100% separada en una columna C
8
; el gradiente de fase mvil es el mismo descrito en
la seccin IV 1a) de la metodologa. Esta fase mvil, permite una etapa de la corrida muy polar
(agua 100%) y otra no polar (gradiente ascendente hacia ACN 100%). Para la deteccin
ultravioleta (UV), se utilizaron dos longitudes de onda de mxima absorcin del extracto
confirmadas como se muestra en la figura 1 de los anexos. A 219 nm se registra la seal de
mayor intensidad; sta seal est compuesta por los solventes y los componentes del extracto. A
280 nm la seal registra principalmente los componentes del extracto La mayora de los picos se
agrupan cerca del frente solvente; con algunos picos al comienzo del gradiente hacia 100%
ACN.


Figura 23: Cromatogramas resultado de anlisis por HPLC en gradiente, columna C
8
Zorbax, a
temperatura ambiente (T. A). A) Inyeccin de 10 L de M. urens 50 mg/mL disuelta en DMSO
100%. B) Inyeccin de 20 L de M. urens 25 mg/mL disuelta en solucin salina + 1% DMSO.

Como se observa en la figura 23B, se realiz otra inyeccin de prueba con el extracto disuelto en
solucin salina + 1% DMSO. Dicha inyeccin se llev a cabo con el fin de ver la huella digital
del extracto bajo las mismas condiciones al cambiar solamente el disolvente. Los picos
mostraron un poco ms de resolucin (separacin entre picos) que en el cromatograma 23A; pero
siguieron apareciendo muy cerca al frente solvente. En esta corrida ya se puede apreciar mejor el
51

grupo de picos cercanos al comienzo del gradiente hacia ACN 100%. Los volmenes de
inyeccin se ajustaron de acuerdo con la concentracin de extracto en cada disolucin para
producir respuestas comparables entre s.

Debido a la mala resolucin vista en los dos casos anteriores, se decide probar con otra columna
de fase estacionaria, octadecilsilano (C
18
); la cual resulta aun ms hidrofbica y retrasa un poco
la salida de los analitos menos polares.



Figura 24: Cromatogramas resultado de anlisis por HPLC en gradiente, columna C
18
Beckman, a temperatura ambiente (T.A.). A) Inyeccin de 20 L de M. urens 25 mg/mL en
solucin salina + 1% DMSO. B) Inyeccin de 20 L de solvente, solucin salina + 2.5% DMSO.

Esta nueva inyeccin de extracto se muestra en la figura 24A. Se observa una mejor separacin
de picos a las dos longitudes de onda analizadas. Los tiempos de retencin aumentan, alejndose
de la lnea de frente de solvente y adems, los picos se resuelven ms entre s. El conjunto de
picos hidrofbicos vistos antes en mnima cantidad, ahora se logra resolver con mayor claridad.
La aparicin de estos picos hidrofbicos se da despus de cinco minutos de iniciado el gradiente
con ACN.

La figura 24B muestra un blanco con solo los solventes usados para la dilucin del extracto. Esta
composicin es similar a la mezcla de solventes de la inyeccin mostrada en la figura 27A, pero
con un mayor porcentaje de dimetilsulfxido (DMSO). Puede observarse en la figura 27B, que
una parte de los picos inmediatos al frente solvente, corresponden a seales provenientes de la
mezcla de solventes. Especialmente al DMSO que absorbe en el UV a aprox. 215 nm (www.kaye
y laby). Nuevamente 219 nm mostr seales correspondientes a los solventes ms los
componentes del extracto mientras que a 280 nm seales principalmente correspondientes a
componentes del extracto.

52

III Parte: 2) Anlisis de las disoluciones del extracto por HPLC
III 2a) Inyecciones para determinacin de la huella digital del extracto de M. urens
En la figura 25A se presenta la huella digital de M. urens redisuelta en agua + 5% DMSO. Se
producen varios picos en el frente solvente, otros dos picos no muy bien resueltos entre 7 y 13
minutos y un grupo de aprox. 8 picos entre 14 y 26 minutos con un carcter un poco ms
hidrofbico.

En la figura 25B se presenta la huella digital de M. urens redisuelta en una mezcla de solucin
salina y DMSO al 1%. Se obtiene un patrn similar al de la figura 25A pero con mayor
resolucin; el grupo de picos hidrofbicos se presenta visiblemente en mayor cantidad.



Figura 25: Cromatogramas resultado de anlisis por HPLC en gradiente con columna C
18
Beckman. A) Inyeccin de 20 L de M. urens 50 mg/mL en agua + 5% DMSO a T.A.
B) Inyeccin de 20 L de M. urens 50 mg/mL en solucin salina + 1% DMSO a T.A.



Figura 26: Cromatogramas resultado de anlisis por HPLC en gradiente con columna C
18
Beckman. A) Inyeccin de 20 L de M. urens 50 mg/mL en DMSO 100% a T. A. B) Inyeccin
de 20 L de M. urens 50 mg/mL en etanol/agua 8:2 a T. A.
53

En forma similar, la figura 26A presenta la huella digital de M. urens disuelta en DMSO 100%,
obtenindose un patrn con menor resolucin. Con este disolvente, los tiempos de retencin de
todas las sustancias del extracto disminuyen. Las sustancias hidroflicas se encuentran entre 8 y
10 minutos y el grupo ms hidrofbico se encuentra entre los minutos 14 y 24.

En la figura 26B se presenta la huella digital de M. urens disuelta en etanol/agua 8:2,
obtenindose un patrn de picos no tan parecido a los anteriores, aunque los tiempos de retencin
de algunos picos son los mismos de la disolucin en DMSO 100%. La cantidad de componentes
disueltos con respecto a las otras disoluciones probadas fue considerablemente menor.

Luego de varias pruebas cromatogrficas para optimizar la separacin de los componentes del
extracto de M. urens, se obtuvo el gradiente mostrado en la figura 27. Este gradiente permiti
una adecuada separacin de gran parte de los componentes del extracto. Se establece solo la
huella digital de M. urens en DMSO 100%, ya que fue el tipo de disolucin que se contino
desarrollando a lo largo de este trabajo.



Figura 27: Cromatograma resultado de un anlisis de HPLC en gradiente con columna C
18
Phenomenex, inyeccin de 5 L de M. urens 50 mg/mL en DMSO a T. A.

En los primeros 10 minutos salen varias seales de componentes completamente hidroflicos;
seguidos de seales estrechamente relacionadas entre s posiblemente en su estructura y que
aumentan paulatinamente su hidrofobicidad, pues eluyen conforme aumenta el porcentaje de
54

ACN hasta un 30%. Es importante hacer notar que la mayora de los componentes del extracto
poseen un carcter altamente hidroflico, el cual dificulta su separacin, purificacin y anlisis.
Los grupos de picos que eluyeron cercanos reflejan la presencia de componentes
estructuralmente similares.

En la figura 28 se muestra un blanco de DMSO 100% donde se observan las seales producidas
por el solvente en s mismo. Se debe tomar en cuenta que esta inyeccin utiliz un volumen de
solvente considerablemente mayor al empleado en el cromatograma de huella digital, por lo que
las seales del solvente son de mayor intensidad. Se observa que a 219 nm tanto la giba que se
forma como el ltimo pico en las seales, estn presentes tambin en la seal del solvente.



Figura 28: Cromatograma resultado de un anlisis de HPLC en gradiente con columna C
18
Phenomenex, inyeccin de 200 L de solvente, DMSO 100% a T. A.
III Parte: 3) Separacin y fraccionamiento inicial de las disoluciones
del extracto por HPLC
III 3a) Inyecciones de separacin y fraccionamiento inicial del extracto crudo
Se realizaron dos inyecciones de gran volumen bajo el gradiente C2.001 para obtener los pooles
separados (figura 29, datos mostrados solo para una de las corridas).

En la corrida C2.001, se inyect un volumen de 200 L de Mucuna urens disuelta en DMSO
100%. Como puede observarse en la figura 29, la separacin de los pooles ocurri en la fraccin
20; donde se estableci como pool 1 el primer grupo de fracciones de carcter hidroflico (1-20
min) y como pool 2 el segundo grupo de fracciones de carcter hidrofbico (21-60 min).
55

Las fracciones se colectaron utilizando un flujo de 1 mL/min cada 5 minutos y fueron secadas
individualmente, para luego ser resuspendidas en el solvente de partida y unidas en los pooles.



Figura 29: Cromatograma resultado de un anlisis de HPLC en gradiente con columna C
18
Phenomenex, inyeccin de 200 L de M. urens 50 mg/mL en DMSO 100% a T. A. Colecta de
fracciones a 5 mL/min y separacin en pooles de la corrida C2.001.

III 3b) Inyecciones de comprobacin para los pooles fraccionados inicialmente del
extracto
Se realizaron inyecciones de 10 L de pool 1 y 2 concentrado, obtenidos en la colecta de
separacin (figura 29). Se utiliz el mismo gradiente que el usado para la determinacin de la
huella digital del extracto de M. urens en diferentes solventes (figuras 25 y 26).

Como puede observarse en la figura 30A, el pool 1 de Mucuna urens resuspendido en DMSO
100% no muestra una separacin muy eficiente de los componentes hidroflicos e hidrofbicos;
ya que aunque se encuentran concentrados los compuestos correspondientes al pool 1
(hidroflico), se conserva una buena cantidad de pool 2 mezclado (picos entre 18 y 22 minutos).
Mientras que para el pool 2, presentado en la figura 30B (hidrofbico), se encuentran bastante
bien separados los compuestos hidrofbicos, pues no posee prcticamente seales del pool 1.
56



Figura 30: Cromatogramas resultado de anlisis por HPLC en gradiente con columna C
18
Phenomenex. A) Inyeccin de 5 L de pool 1 de M. urens concentrado y resuspendido en
DMSO 100% a T. A. B) Inyeccin de 5 L de pool 2 de M. urens concentrado y resuspendido en
DMSO 100% a T. A. Revisin para la separacin de pooles correspondientes a la corrida
C2.001.



Figura 31: Cromatogramas resultado de anlisis por HPLC en gradiente con columna C
18
Phenomenex. A) Inyeccin de 5 L de solvente DMSO 100% a T. A. Blanco para la revisin
de pooles.

Se presenta adems una corrida de 5 L de solvente (DMSO 100%) bajo el mismo gradiente que
para la verificacin de pooles, con el fin de determinar cules seales del cromatograma son
debidas al solvente (figura 31). Solo se observa una fuerte seal en el frente solvente a los 2
minutos aproximadamente y a los 31 minutos se ve otra seal pequea no correspondiente a los
solventes, sino ms bien a contaminacin restante en la columna de las inyecciones anteriores de
extracto.
57

III Parte: 4) Repeticin de experimentos de respuesta al calcio en
clulas CHO-M
1
del extracto separado
III 4a) Pruebas de respuesta al calcio para los pooles inicialmente separados de M. urens
Debido a que el extracto crudo disuelto en DMSO mostr actividad sobre el receptor
muscarnico M
1
(figura 14) se tom como base esa disolucin de extracto para preparar la
separacin de los pooles. Luego de concentrarlos a sequedad y resuspenderlos en el solvente de
partida, se volvieron a ensayar los pooles sobre las clulas, procurando mantener las mismas
condiciones experimentales que con el extracto crudo. Para el ensayo mostrado se usan los
pooles concentrados obtenidos de la corrida C2.001 sobre clulas CHO-M
1
.

En el caso de la figuras 32A (disolucin de pooles en DMSO), se realiz un control con
solamente las clulas ms carbacol para verificar la respuesta mxima que alcanza el agonista
(trazo violeta); continuando con la misma figura, se observa una importante respuesta al calcio,
desencadenada por el pool 1 de extracto. La cual es casi totalmente bloqueada cuando se agrega
atropina (trazo azul). En el ensayo de Mucuna sin atropina (trazo naranja), es importante hacer
notar la fuerte disminucin de la respuesta al carbacol observada ya en otras ocasiones.



Figura 32: A) Respuesta al calcio al adicionar Pool 1 de M. urens en DMSO 100% en clulas
CHO-M
1
empleando como sonda Fluo-4; emisin tomada a 516 nm; temperatura regulada a 21
C. B) Respuesta al calcio al adicionar pool 2 de M. urens en DMSO 100% en clulas CHO-M
1

bajo las mismas condiciones.

De manera consistente con los resultados iniciales de extracto crudo (figura 14), el pool 2 del
extracto produce una respuesta muscarnica pequea por movilizacin de calcio (figura 31B), la
cual es completamente bloqueada por la atropina como se observa en la figura 32B (trazo azul).
58

III Parte: 5) Separacin y fraccionamiento final de las disoluciones
del extracto por HPLC
III 5a) Inyecciones de separacin y fraccionamiento final del extracto crudo
Se realizaron algunas pruebas a partir de la disolucin madre de M. urens 50 mg/mL disuelta en
DMSO 100% con miras a mejorar la separacin por cromatografa lquida, con las columnas
disponibles, de los componentes del pool 2 y pool 1 para continuar con estudios de fracciones
ms reducidas.

Con este objetivo, se realiz la inyeccin de 20 L de M. urens 50 mg/mL en DMSO 100%
variando la fase mvil. Como se observa en la figura 32: los primeros 10 minutos 100% de agua
+ 0.1% de TFA, seguido de un gradiente hasta 30% de ACN en 30 minutos, 10 minutos ms de
30% de ACN constante, luego de los cuales comienza a ascender nuevamente el porcentaje de
ACN hasta 100% en 10 minutos. Para finalizar la corrida el gradiente regresa a 100% agua
quedando listo para la siguiente inyeccin. Los canales de deteccin se registran hasta los 65
minutos. Como puede verse en la figura 33, logran separarse tres grandes seales de entre el
grupo perteneciente al pool 2, las cuales podran fraccionarse ms para continuar los estudios
biolgicos en clulas CHO-M
1
.





Figura 33: Cromatograma resultado de un anlisis de HPLC en gradiente con columna C
18
,
inyeccin de 20 L de M. urens 50 mg/mL en DMSO 100% a T. A. Optimizacin para la
separacin de pooles.

59



Figura 34: Cromatograma resultado de un anlisis de HPLC en gradiente con columna C
18
Phenomenex, inyeccin de 400 L de M. urens 50 mg/mL en DMSO 100% a T. A. Colecta de
fracciones cada 5 minutos; separacin optimizada final, corrida llamada Zao7.001.

En la figura 34 se muestra una inyeccin de 400 L del extracto crudo disuelto en DMSO 100%,
pero aumentando 15 minutos de tiempo a 100% ACN para permitir salir las sustancias ms
hidrofbicas del extracto. A pesar de ser un considerable volumen de extracto, algunos picos
logran diferenciarse entre s. Esta inyeccin se efectu con un flujo de 1 mL/min y se colect
cada 5 minutos.

III 5b) Experimentos de respuesta al calcio en clulas CHO-M
1
para el fraccionamiento
final del extracto
Aunque se prob cada una de las fracciones cada cinco minutos de la figura 34, se muestran a
continuacin solamente las fracciones que arrojaron resultados significativos, un control y una de
las fracciones en las que no se obtuvo ningn tipo de efecto.


60


Figura 35: Respuestas al calcio en clulas CHO-M
1
al adicionar 5 L de cada fraccin
empleando como sonda Fluo-4; emisin tomada a 516 nm; temperatura regulada a 21 C.
A) Control con solvente. B) Fraccin 65-70 resuspendida en DMSO 100%.

En la figura 35A se presenta un ensayo control, como puede notarse en la flecha a un minuto se
agregaron 5 L de solvente, con el que no se produjo ninguna respuesta de liberacin de calcio
por activacin del receptor M
1
. En el mismo grfico se muestra el bloqueo con atropina 10 M
(trazo azul, 35A). En el caso de la figura 35B se observa la fraccin 65-70 del extracto, con la
que no se present ningn tipo de respuesta. Sin embargo es importante subrayar la correcta
respuesta por parte del carbacol y la digitonina en el ensayo, que aseguran el buen
funcionamiento del sistema biolgico.



Figura 36: Respuestas al calcio en clulas CHO-M
1
al adicionar 5 L de cada fraccin
empleando como sonda Fluo-4; emisin tomada a 516 nm; temperatura regulada a 21 C. A)
Fraccin 70-75 resuspendida en DMSO 100%. B) Fraccin 75-80 resuspendida en DMSO 100%.
En la figura 36A puede notarse como la fraccin 70-75 produjo una considerable respuesta de
liberacin de calcio por activacin del receptor M
1
, la cual fue parcialmente bloqueada por la
61

atropina 10 M (trazo azul, 36A). As mismo se observa como la atropina utilizada en el ensayo
tampoco fue capaz de bloquear completamente la respuesta a carbacol agregado a los cuatro
minutos. En el caso de la figura 36B; se observa la siguiente fraccin 75-80, con la que se
present una pequea respuesta de fluorescencia (giba) producto de actividad muscarnica, ya
que la atropina bloque completamente la respuesta al extracto (trazo azul 36B). Tal como se
observ con la fraccin anterior el bloqueo de la respuesta a carbacol no fue completo, aunque s
se redujo la respuesta del agonista.




Figura 37: Respuestas al calcio en clulas CHO-M
1
al adicionar 5 L de cada fraccin
empleando como sonda Fluo-4; emisin tomada a 516 nm; temperatura regulada a 21 C.
A) Fraccin 1-5 resuspendida en DMSO 100%. B) Fraccin 5-10 resuspendida en DMSO 100%.


En la figura 37A puede notarse como la primera fraccin (1-5) produjo una considerable
respuesta de liberacin de calcio por activacin del receptor M
1
, la cual es totalmente bloqueada
por la atropina 10 M (trazo azul, 37A). En el caso de la figura 36B se observa la siguiente
fraccin (5-10), con la que se present un pequeo pico de fluorescencia, el cual no parece ser
producto de actividad muscarnica, debido a que la atropina no produjo ningn efecto
significativo sobre el mismo y a la forma del pico no parece una respuesta por liberacin de
calcio del retculo endoplasmtico (no tiene forma de giba). En ambos casos (37A y B), se
produjo una considerable reduccin de la respuesta celular control desencadenada por el carbacol
si se compara con respecto al control de la figura 35A.




62

Tabla 13: Resumen de las respuestas por calcio al agregar el extracto hidroalcohlico
fraccionado de Mucuna urens sobre clulas con receptor M
1
.

Fracciones del extracto en
DMSO 100%
(provenientes de la figura 34)
Antagonista usado: Atropina CHO M
1

21C
1-5

sin
con
+
Bloqueada
5-10 sin
con
-
x
10-15 sin
con
-
x
15-20 sin
con
-
x
20-25 sin
con
-
x
25-30 sin
con
-
x
30-35 sin
con
-
x
35-40 sin
con
-
x
40-45 sin
con
-
x
45-50 sin
con
-
x
50-55 sin
con
-
x
55-60 sin
con
-
x
60-65 sin
con
-
x
65-70 sin
con
-
x
70-75

sin
con
+
Reducida
75-80

sin
con
+
Bloqueada
80-85 sin
con
-
x
85-90 sin
con
-
x

+: Present respuesta agonista -: No present respuesta x: Prueba no realizada o no necesaria

63

Discusin
La enfermedad de Parkinson es una patologa de alta incidencia en la poblacin mundial. Pese a
que ya existen medicamentos para mejorar los sntomas y signos de este mal, sus efectos
adversos y la incapacidad de frenar su progreso, motivan la continua bsqueda de nuevas
opciones teraputicas. Molina y Sols (2003) encontraron que el liofilizado del extracto
hidroalcohlico de la semilla de Mucuna urens posee actividad antiparkinsoniana en el modelo
unilateral de 6-OHDA.

El presente estudio evalu el efecto muscarnico in vitro del extracto crudo de las semilla de M.
urens y sus fracciones.

Luego de comprobar los efectos de un extracto natural crudo mediante algn modelo biolgico,
se vuelve sumamente necesario conocer los grupos de metabolitos presentes en dicho extracto.
Debido a que los extractos naturales pueden contener varios tipos de metabolitos para ejercer su
efecto fisiolgico, ya sea por medio de un nico metabolito o una mezcla de ellos en forma
sinrgica.

Los estudios realizados por otros investigadores en el gnero Mucuna (Grover et al, 2002;
Grover et al, 2001 y Ahmad et al, 2007) demuestran varios efectos que podran ser de
importancia en el tratamiento de diversas dolencias; entre ellas el Parkinson (Katzenschlager et
al, 2004; Mahajani et al, 1996; Manyam et al, 2004 (a y b); Nagashayana et al, 2000) por lo que
vale la pena conocer los componentes causantes de los efectos farmacolgicos en este gnero de
plantas.

Teniendo en cuenta lo anterior, y adems por la falta de estudios qumicos precedentes en lo que
respecta a la semilla de Mucuna urens; al inicio de este trabajo se realizaron las pruebas
fitoqumicas preliminares para detectar diferentes grupos de metabolitos secundarios como:
flavonoides, taninos, alcaloides y glicsidos antracnicos (Soriano et al, 2004).

En estas pruebas cualitativas, si al menos cuatro de los diferentes reactivos resultan positivos
para un mismo grupo de metabolitos secundarios, se puede considerar que el extracto posee
componentes con estructuras del tipo de metabolito evaluado. De esta manera, segn las tablas 8,
9, 10 y 11 el extracto hidroalcohlico 8:2 de M. urens, posee con certeza taninos. La presencia de
taninos, (estructuras polifenlicas) en el extracto de M. urens, aunque esperable resulta notable,
en el sentido de que pocas caracterizaciones y reportes del contenido de estos en el gnero
Mucuna se han llevado a cabo. Al respecto, un estudio Filipino de legumbres indgenas
comestibles que incluy a la Mucuna curanii, report en esta, la presencia en bajos niveles de
taninos condensados y polifenoles en general (Laurena et al, 1994).

La posibilidad de algn flavonoide con grupos fenoles surge en la reaccin llevada a cabo con
cloruro frrico, aunque esta prueba no es especfica, pues tambin se utiliza para la
determinacin de taninos (Isaza et al, 2005; Bell et al, 1971). En estos casos un color verdoso es
presuntivo de un derivado catecol; mientras que un color azul es sugestivo de un derivado de
pirogalol (Lock, 1994). Sin embargo, con solo una reaccin inespecfica positiva para
flavonoides no se puede afirmar que existan estos metabolitos en el extracto, a menos que se
64

efecten ms pruebas qumicas especficas como espectrometra infrarroja, RMN y HPLC-MS
que as lo confirmen. Todas las pruebas para alcaloides y glicsidos antracnicos resultaron
negativas, probablemente debido a que la planta los posee en muy bajas concentraciones para ser
detectados por una prueba visual. Esto se sugiere ya varios autores han reportado para otras
especies de Mucuna la presencia de alcaloides utilizando resonancia magntica nuclear (RMN)
(Bell et al, 1971; Manyam et al, 2004; Mehta et al, 1944; Santra et al, 1953).

Se realiz la identificacin de estos cuatro grupos de metabolitos secundarios debido a que son
de los ms abundantes en las plantas, poseen diferentes actividades biolgicas y sus pruebas de
caracterizacin visual son ampliamente conocidas.

Algunas de las actividades biolgicas y de las caractersticas qumicas de estos grupos de
metabolitos son las siguientes: los taninos son sustancias no cristalizables con aplicacin
medicinal, principalmente gracias a su efecto astringente. A los alcaloides, por su parte, se les
han atribuido muy variadas acciones, tales como estimulantes, antiespasmdicas, analgsicas,
anestsicas, sedantes, hipnticas, antiemticas, expectorantes, antipirticas, antiasmticas y como
relajantes musculares (www.salud.com). Los flavonoides por otra parte, son sustancias
cristalizables que poseen entre otras, propiedades astringentes, estrognicas, antioxidantes y
antifngicas (Gonzlez et al, 2008; Ishige et al, 2001). Por ltimo, los glicsidos antracnicos se
caracterizan principalmente por sus efectos laxantes y catrticos (www.salud.com).

Respecto a actividades fisiolgicas ya descritas para M. pruriens; se han publicado sus efectos
antiparkinsonianos, hipoglicmicos, hipocolesterolmicos, antitumorales, antioxidantes,
neuroprotectores, potenciadores del aprendizaje y la memoria, afrodisacos, antiprotozoarios,
antiinflamatorios y analgsicos (Sathiyanarayana et al, 2007).

En estudios de plantas medicinales, se han desarrollado dos conocidas tendencias: aquella basada
en la identificacin y purificacin de componentes qumicos, provenientes de extractos de
plantas medicinales a partir de las cuales se desarrollan nuevos frmacos mediante la modelacin
de sus farmacforos (Zepeda y Lira, 2007; Lager et, 2006). O los que utilizan los extractos de
plantas medicinales crudas; sin purificacin posterior. En esta segunda corriente, se rescata que
la mezcla de compuestos presentes en un extracto crudo, producen interacciones de la accin
biolgica in vivo. Los seguidores de esta tendencia abogan por no purificar los extractos crudos,
debido a que pierden o disminuyen su accin in vivo (Chen et al, 2007; Wang et al, 2008).

Debido al alto costo de las purificaciones en los extractos llevadas a cabo por los partidarios de
la primera tendencia y a la razn de disminucin en la actividad biolgica de la segunda, es que
se justifica la disminucin general del nmero de estudios fitoqumicos de purificacin; as como
el nmero de estudios recientes para el gnero Mucuna.

Como se mencion en la introduccin de este trabajo, la planta estudiada, (M. urens) tiene al
igual que otras plantas medicinales, varios efectos biolgicos. Uno de los efectos descritos y
probados en el laboratorio del Programa de Neurociencias utilizando el extracto hidroalcohlico
de esta planta, tiene que ver con una recuperacin funcional mayor de animales experimentales
que recibieron el extracto, comparada con la de los controles que recibieron L-Dopa en el
modelo unilateral de 6-OHDA (Molina y Sols, 2003). Inspirados en dichos datos y tratando de
65

buscar una posible explicacin para el efecto del extracto, es que en este estudio se investig su
posible accin sobre el sistema colinrgico, que tambin ha sido implicado en el funcionamiento
normal y patolgico de los ganglios basales.

De acuerdo con lo anteriormente mencionado, se estudiaron algunos de los receptores de este
sistema y especficamente aquellos relacionados con protenas Gq como el M
1
y el M
3
que
desencadenan la liberacin de calcio, cuantificable con el mtodo experimental usado. Puesto
que se postula una accin del extracto sobre receptores muscarnicos, se debe conocer la
distribucin de estos en el cerebro, si se quiere sugerir la accin del extracto sobre alguno de
ellos en especfico.

Los receptores muscarnicos M
1
se encuentran abundantemente en la corteza cerebral, el
tubrculo olfatorio, el hipocampo y el cuerpo estriado (Flores et al, 2005; Hardman, 2001; Levey
et al, 1991). Los receptores M
2
se encuentran en el cuerpo estriado, la corteza (principalmente
tubrculo olfatorio), el hipocampo, algunos ncleos talmicos (Flores et al, 2005; Gattu et al,
1997), el tronco enceflico y principalmente en el cerebelo (Flores et al, 2005; Levey, 1993;
Levey et al, 1991). Los receptores M
3
se encuentran en un porcentaje notable en corteza, cuerpo
estriado, estructuras talmicas e hipocampo (Flores et al, 2005; Levey, 1993). El receptor M
4
se
distribuye ms en prosencfalo, corteza y cuerpo estriado de las ratas (Levey, 1993). Mientras
que el receptor M
5
se encuentra en el cuerpo estriado, el hipocampo y la corteza cerebral (Flores
et al, 2005).

En los pacientes parkinsonianos se ha visto un incremento de los receptores muscarnicos M
1
y
M
4
en los lbulos occipitales del cerebro y una marcada disminucin de los mismos en los
lbulos temporales y frontales de ambos hemisferios (Colloby et al, 2006).

Puesto que en el cerebro adulto de los seres humanos, las sinapsis muscarnicas estn
involucradas en una gran variedad de funciones tales como el sueo, la conducta de huida, el
aprendizaje, la memoria, el humor, la atencin, la regulacin neuroendocrina en el hipotlamo y
la modulacin del control de movimientos extrapiramidales (Gremo et al, 1987) es que resulta
importante conocer el efecto del extracto de M. urens sobre receptores muscarnicos.

As, en las pruebas biolgicas de respuesta al calcio se busc el tipo de actividad sobre
receptores muscarnicos M
1
y M
3
en las clulas CHO-M
1
y HEK-293 respectivamente. No se
prob los subtipos M
2
y M
4
;

ya que estos tienen como acoplaje Gi y disminucin de AMPc el
cual debe cuantificarse con otros mtodos analticos no disponibles para este trabajo. El receptor
M
5
no fue ensayado, ya que no encontraba disponible en las clulas adquiridas de forma
endgena, ni bajo transfeccin. La mayora de ensayos se realizaron a 21 C pues esta
temperatura es suficiente para producir la activacin de G q y la liberacin de calcio va
fosfatidil inositol 4,5-bifosfato (PIP
2
) (Sallese et al, 2000; Stehno-Bittel et al, 1995). Otros
ensayos se hicieron a 37 C para producir la activacin ms eficiente de los receptores acoplados
a G q como los CXCR4, aunque es posible que adems de la activacin del retculo
endoplasmtico, a temperaturas fisiolgicas se presente la activacin de los canales operados por
receptor (ROCCs) que permiten la entrada de este in desde el lquido extracelular (Brown et al,
2005; Zagranichnaya et al, 2005). Aunque la entrada de calcio extracelular no fue corroborado
por una prueba experimental en la que se elimine dicho ion; se sabe de acuerdo con otros
66

investigadores, que en las ocasiones donde los experimentos presentan un comportamiento
bifsico, la segunda parte de esta respuesta, se debe frecuentemente a la entrada de calcio
extracelular (Putney, 1994).

Segn la respuesta al calcio del receptor M
3
a 21 C, marcada con Indo-1 para las cuatro
disoluciones diferentes ensayadas del extracto, solo la solucin en etanol/agua 8:2 muestra un
efecto agonista de M. urens, el cual no es de tipo muscarnico ya que no es bloqueado por la
preincubacin con atropina.

Dicho efecto podra corresponder a cualquiera de los otros receptores endgenos de estas clulas,
asociados con Gq (vitronectina, adenosina 2B (A
2B
), 1 adrenrgicos, adrenrgicos,
bradicininas, endotelina, purinrgicos Y
1
, Y
2
y Y
13
, somatostatina, esfingosina y trombina entre
otros) (Cooper et al, 1997; Linden et al, 1999). De ellos, los nicos que han sido asociados con la
teraputica de Parkinson son los receptores de adenosina, en especial un antagonismo de los
receptores A
2A
, A
2B
y A
1
, al mejorar los efectos secundarios producidos por los anticolinrgicos
dados como terapia antiparkinsoniana (Gngora et al, 2005).

Por otro lado, la respuesta al calcio por accin del extracto sobre el receptor M
3
a 21 C en
clulas HEK, marcadas con la otra sonda fluorescente (Fluo-4), no mostr ninguna actividad
agonista ni antagonista sobre el receptor muscarnico M
3
. En este caso la respuesta agonista no
muscarnica de la disolucin en etanol/agua no apareci. Lo anterior pudo ser consecuencia del
envejecimiento celular que se haba producido en los cultivos de prueba, lo que disminuira la
efectividad en la movilizacin de calcio intracelular (comunicacin personal con Muriel Hachet,
laboratorio de RPM, Estrasburgo); o a que Fluo-4 no fue capaz de marcar pequeas variaciones
de calcio; si la carga de sonda se realiza a una concentracin mnima efectiva (2 M)
(comunicacin personal con Sandrine Daval, laboratorio de RPM, Estrasburgo). Sin embargo,
aun no est clara la causa de este efecto; y no se puede esclarecer con las pruebas aportadas en
este trabajo.

Siguiendo con la discusin de los resultados, se llev a cabo una parte del anlisis y separacin
cromatogrfica del extracto para corroborar y explicar la autofluorescencia vista en las pruebas
celulares realizadas y discutidas anteriormente en las que se uso la sonda Indo-1, luego de esta
breve discusin, se continuar el estudio del extracto sobre los receptores M
1
.

Con la columna C
18
se efectu una inyeccin de colecta de fracciones presentada en la figura 10.
Para la colecta se eligi inyectar el extracto liofilizado disuelto en solucin salina + 1% DMSO;
ya que solucin salina, fue el solvente usado en el trabajo anterior de Molina y Sols (2003); con
el cual se obtuvo el efecto antiparkinsoniano de M. urens. En el caso de las pruebas celulares de
este trabajo, se le adicion un 1% de DMSO para mejorar la solubilidad del extracto liofilizado.
Tambin, se adicion el cido trifluoroactico (TFA) al 0.1% a ambas botellas de fase mvil en
el presente estudio, con el fin de mejorar la separacin de picos y solubilizar sustancias de
carcter bsico al bajar el pH.

Continuando el anlisis de las fracciones anteriormente separadas por medio de pruebas de
fluorescencia, se adquirieron los datos mostrados en la figura 11. De dicha figura se obtuvo
67

informacin confirmativa e importante sobre el comportamiento del extracto y de sus
componentes.

Primero que todo, queda claro que bajo las condiciones de anlisis del Indo-1, se produce una
seal interferente (autofluorescencia o fluorescencia nativa) proveniente de las fracciones 8 y 9
(carcter hidroflico) de la colecta. Tal fluorescencia nativa encontrada en el extracto podra
haber sido prevista si las pruebas cualitativas iniciales hubiesen mostrado ms resultados
positivos para flavonoides y alcaloides, ya que se sabe que varios de estos tipos de estructuras
con anillos de resonancia y grupos hidroxilo unidos a heterociclos, poseen fluorescencia nativa
(autofluorescencia), la cual es muy sensible a cambios en la polaridad del entorno (disolventes) y
el pH (Romero et al, 2002). Segn esta observacin, las fracciones 8 y 9 de la corrida mostrada
en la figura 10, podran contener este tipo de compuestos.

La seal autoflorescente vista en las condiciones del Indo-1 no se produjo o lo hizo en una
proporcin mnima bajo las condiciones de anlisis del Fluo-4. En este caso, es de notar que son
las fracciones 36 y 45 (carcter hidrofbico) de la colecta, las que presentaron un pequeo
aumento en el nivel de fluorescencia; mientras las fracciones 8 y 9 (hidroflicas) se mantuvieron
en la lnea base junto con los solventes. Teniendo en cuenta las evidencias expuestas, la mayora
de anlisis biolgicos de este trabajo se realizaron marcados con Fluo-4, aunque al inicio de la
etapa experimental se haban previsto en su mayora con Indo-1.

Con el fin de continuar los anlisis biolgicos del extracto crudo sobre receptores M
1
; e
implementando la utilizacin de la sonda Fluo-4 para el resto de pruebas celulares, se inici el
trabajo realizando una curva dosis/respuesta por varias razones. Algunas de ellas fueron: conocer
la concentracin final de acetilcolina a utilizarse como patrn, corroborar la EC
50
de este
agonista, verificar que todo el sistema biolgico se encontraba en un nivel ptimo de
funcionalidad y que tanto los procedimientos de dilucin de las clulas, como los procedimientos
de preparacin de carga de la sonda eran adecuados.

En la figura 12 podemos ver como bajas concentraciones de ligando (1 nM y 3 nM), no
desencadenan fluorescencia por movilizacin de calcio, ya que son incapaces de activar la va de
sealizacin intracelular acoplada al receptor. Sin embargo, al incrementar la concentracin de
Ach aplicada, se supera el umbral de activacin del receptor (~3-10 nM) y se produce una
respuesta en forma de giba debida a la liberacin de calcio del retculo endoplasmtico por
accin del IP
3
sobre su receptor endoplasmtico; seguido de su posterior recaptura (Qi et al,
2000; Quintanar y Caldern, 2007) en tiempo real. La cantidad de calcio movilizada por accin
del agonista sobre el receptor asociado con protenas Gq, va en aumento al incrementar la
concentracin de agonista (Dawson et al, 2004). En la parte superior de la figura 12 se representa
la fluorescencia como el porcentaje de respuesta fluorescente medida en la inferior. Puede
notarse como las dos ltimas concentraciones se aproximan a la respuesta mxima del receptor
M
1
, ya que incrementos considerables (de 200 nM) en la concentracin de ligando, no logran
obtener porcentajes de respuesta proporcionalmente mayores. Tambin, como puede verse en la
parte superior de esta misma figura; la concentracin eficaz para una respuesta del 50% (EC
50
) es
de 25.5 nM. Este valor es bastante cercano a los datos experimentales que se manejan en el
Laboratorio UMR 7175 del CNRS de 20 nM para acetilcolina en este tipo de clulas. El valor del
ndice de ajuste de la figura superior R
2
= 0.9975 demuestra que el porcentaje de respuesta del
68

receptor se ajusta con la concentracin de Ach en una curva hiperblica (curva S), que sigue la
teora clsica de ocupacin del receptor (Hardman et al, 2001). Se escogi 100 nM de Ach como
patrn en experimentos celulares, ya que libera una considerable cantidad de calcio, sin alcanzar
la activacin mxima del receptor, lo cual podra producir desensibilizacin en los receptores
muscarnicos (Billington y Penn, 2002).

Siguiendo el anlisis de las pruebas sobre clulas CHO-M
1
marcadas con Fluo-4 (ver figuras 13-
15) se observaron efectos diferentes de los observados con el receptor M
3
. Se aprecia una
disolucin diferencial de los componentes de Mucuna en los solventes, ya que la solucin salina
no logra disolver los componentes que ejercen un efecto agonista del receptor muscarnico M
1
;
mientras que en el DMSO y el etanol/agua se comprueba que existen componentes agonistas M
1

susceptibles a bloqueo con atropina. En la disolucin del extracto en DMSO 100%, se obtuvo
una respuesta agonista completamente muscarnica M
1
(ver figura 14), mientras que en la
disolucin etanol/agua 8:2 adems de parte de un agonismo M
1
(ver figura 15), se obtuvo un
agonismo asociado con otro receptor endgeno, pues como se observa en la figura 15B, la
respuesta desencadenada por el extracto no logr ser completamente bloqueada por la atropina
(fue reducida su amplitud en aproximadamente la mitad).

De conformidad con los ensayos anteriores, al repetir las pruebas sobre receptor M
1
usando la
sonda Indo-1 para marcaje de calcio, las pruebas arrojaron idnticos resultados (datos no
mostrados), brindando ms consistencia y credibilidad; con la desventaja ya mencionada del
ruido de fondo producido por la autofluorescencia del extracto.

Con el fin de complementar los resultados anteriores, y recordando que las clulas CHO sin
transfectar, endgenamente presentan receptores purinrgicos del tipo P
2
Y, se realizaron
verificaciones con las disoluciones de M. urens cruda y ATP (agonista purinrgico) marcadas
con la sonda Fluo-4. Puede comprobarse en la figura 16 que no se obtuvo respuesta alguna
despus de agregar el extracto disuelto en solucin salina + 1% DMSO o en DMSO 100%. En la
disolucin de Mucuna en etanol/agua (figura 17), se present una pequea respuesta agonista de
alguno de los receptores endgenos reportados para estas clulas y asociados con movilizaciones
de calcio (adenosina (A
2B
),
2
adrenrgicos, adrenrgicos, calcitonina, complemento (C3a), 5-
HT1b, purinrgicos Y
1
, Y
2
y Y
13
, esfingosina, cido lisofosfatdico, bombesina o trombina); en
concordancia con los resultados antes vistos de agonismo no asociado con receptores
muscarnicos (figura 15) (Akerman et al, 1998; Brough et al, 2000; Holdsworth, et al, 2005;
Marcet et al, 2004).

Se realizaron adems pruebas con dosis crecientes de Mucuna, para determinar el efecto sobre la
respuesta al agonista muscarnico control (figura 2 de anexos). En la parte A de la figura 2 de
anexos se observa como a mayor concentracin de extracto, menor respuesta a la acetilcolina; sin
embargo, se realiz la normalizacin de los datos a 100% digitonina para asegurar la
comparabilidad de las respuestas (misma figura, parte B) y en este caso se confirma que a mayor
concentracin de extracto en la suspensin celular, menor respuesta al patrn de acetilcolina.
Esto podra deberse a la desensibilizacin rpida por fosforilacin del receptor M
1
que induce su
internalizacin (Billington y Penn, 2002), una interaccin de los componentes del extracto con
los ligandos agonistas patrn, o un agonismo por medio de una modulacin alostrica que afecte
la dinmica de unin del ligando patrn al sitio activo del receptor.
69

Con la perspectiva de aclarar si dicho comportamiento estaba relacionado con un efecto
antagonista sobre el receptor M
1
especficamente, se realiz la prueba mostrada en la figura 3 de
los anexos. El experimento realizado muestra que no importa el tipo de agonista (muscarnico o
purinrgico) que se agregue en presencia del pool 1 de M. urens, en ambos casos se reduce la
capacidad de respuesta.

De acuerdo con estos resultados; la hiptesis planteada en esta investigacin: existen efectos
anticolinrgicos producidos por el extracto hidroalcohlico crudo de Mucuna urens, se rechaza al
menos para los receptores muscarnicos M
1
y M
3
. Esto porque el extracto de Mucuna urens
disuelto en solucin salina + 1% DMSO no present ni agonismo, ni antagonismo de dichos
receptores asociados con protenas G; se hace nfasis en esta disolucin, puesto que fue la forma
ms parecida de disolver el extracto que el aplicado a las ratas en la tesis de Molina y Sols
(solucin salina), 2003 (Merino et al, 2003). Para las otras disoluciones ensayadas DMSO 100%
y etanol/agua 8:2 la hiptesis tampoco se cumple, ya que los resultados muestran un agonismo
muscarnico M
1
en vez de un antagonismo y ninguna accin sobre el receptor M
3
.

En oposicin a lo que predecira la teora antiparkinsoniana sobre efectos anticolinrgicos
benficos sobre la enfermedad, el efecto del extracto hidroalcohlico liofilizado de la semilla,
result agonista muscarnico selectivo M
1
en el modelo celular. Como se mencion antes, dichos
receptores se encuentran presentes en el cuerpo estriado y reciben regulacin inhibitoria por
parte de la dopamina. Estas interneuronas colinrgicas hiperactivas en la enfermedad de
Parkinson, intervienen en la modulacin de todas las vas que salen del cuerpo estriado; por lo
que un agonismo colinrgico puro en el cuerpo estriado probablemente tendra un efecto
contraproducente sobre la sintomatologa de la enfermedad de Parkinson. Sin embargo, si estos
componentes del extracto actuaran solamente como un agonista parcial de los receptores M
1

estriatales, podran mejorar los signos y sntomas parkinsonianos; ya que, al desencadenar una
menor activacin de la respuesta intrnseca de los receptores postsinpticos comparados con la
activacin producida por la Ach endgena que se encuentra aumentada en el cuerpo estriado
enfermo, se vera una disminucin general de la actividad muscarnica.

Dicha actividad muscarnica del extracto puede no estar directamente relacionada con la va de
los ganglios basales y la EP, pero debido a que existen receptores M
1
en diferentes vas
cerebrales como el hipocampo (Gremo et al, 1987; Levey et al, 1991), la accin agonista sobre
M
1
podra provocar efectos que modularan otros procesos asociados por ejemplo con la memoria
y el aprendizaje (Sathiyanarayana et al, 2007).

Sin embargo no se puede perder de vista que en este caso, nos encontramos en un sistema in
vitro, totalmente diferente del sistema nervioso central y ms an de las vas dopaminrgicas
degeneradas en la EP. Es entonces importante tomar en cuenta que el modelo in vitro de
receptores muscarnicos solo permite ver en un sistema aislado la interaccin del conjunto de
molculas presentes en el extracto de M. urens sobre el receptor de inters y otros receptores de
membrana celular endgenos sin toda la compleja interrelacin de un organismo. Pero al menos
estos modelos, nos permiten explicar en parte la informacin subyacente a los receptores sobre
los que acta el extracto y las vas intracelulares que se activan.

70

Adems debe quedar claro que para analizar los efectos muscarnicos agonistas encontrados
deben usarse in vivo las disoluciones de etanol/agua y DMSO 100% de M. urens, para
comprobar la toxicidad del extracto disuelto en estos vehculos especficamente y la
biodisponibilidad que con ellos se logra para los componentes del extracto hacia el SNC.
Estudios de toxicidad aguda llevados a cabo en la UCR por la Dra. Mildred Garca y el Dr. Jaime
Fornaguera para el extracto crudo de M. urens disuelto en solucin salina, demostraron que el
extracto no es txico ni a 5000 mg/kg (datos an no publicados). Adems de que en la prueba de
viabilidad con azul de tripn para las clulas CHO-M
1
el extracto mostr una mortalidad celular
semejante a la del control (ver tabla 1 de los anexos).

Por otra parte, este trabajo tambin incluy una pequea parte de experimentacin con
mediadores inflamatorios como lo son las citocinas, estas vas y otras, referentes a los procesos
inflamatorios han sido relacionadas con las etapas iniciales de la EP y con su progresin, as
como con varias enfermedades neurodegenerativas tipo Alzheimer, Huntington, Sndrome de
Down y esclerosis mltiple, donde se sugiere un mecanismo inflamatorio que est relacionado
con la muerte celular (Wersinger et al, 2002).

En el caso especfico de la EP se ha visto el aumento en la expresin del Complejo Mayor de
Histocompatibidad tipo II (MHC II) tanto en la microglia como en parte de linfocitos T de la
sustancia negra (parte compacta); mientras que se ha visto un aumento en la expresin del MHC
tipo I en el cuerpo estriado. Adems en pacientes con EP se ha encontrado un aumento en los
niveles de citocinas inflamatorias tales como IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, TNF-, TGF- y TGF- 1
a nivel cerebral y de fluido cerebroespinal (Wersinger et al, 2002).

Debido al conocido efecto de las citocinas y sus receptores como el CXCR4 en la activacin de
las clulas del sistema inmunitario (quimiotaxis) y en la mediacin de la respuesta inflamatoria,
se ensay el efecto del extracto sobre un modelo celular con sobreexpresin del receptor
CXCR4. El fin de realizar estas pruebas, fue determinar si el efecto antiparkinsoniano observado
con el extracto de Mucuna urens poda tener alguna relacin con procesos antiinflamatorios que
hubiesen coparticipado con los de la L-Dopa en la tesis de Molina y Sols.

Los resultados mostraron que el agonismo producido por el extracto sobre las clulas HEK-293
transfectadas con CXCR4 no estaba directamente relacionado con la actividad de este receptor.
Se puede afirmar, que mediante este receptor de quimiocinas, el extracto no posee efecto anti-
inflamatorio o pro-inflamatorio. Pues como se observa en la figura 18 de extracto en disolucin
salina, se desencadena una respuesta agonista sobre las clulas, la cual no es bloqueada por el
antagonista de CXCR4, T134. Lo mismo ocurre con las otras disoluciones de extracto (ver
figuras 19 y 20) marcadas con Fluo-4. Las mismas pruebas cambiando la sonda a Indo-1
confirman que en los casos donde se presenta una respuesta agonista del extracto, esta no es
mediada por el receptor transfectado CXCR4; sino ms bien por otro receptor endgeno de ese
tipo de clulas (datos no mostrados).

Probablemente si existe alguna actividad coadyuvante en el extracto, sea ms de tipo
antioxidante que anti-inflamatoria o anti-quimiotctica. Lo sugerido, se sustenta en datos
preliminares que se observaron en clulas PC-12 en el Laboratorio de Inmunologa de la
Universidad de Crdoba, Espaa los cuales mostraron un efecto protector y antioxidante del
71

extracto a concentraciones crecientes de 6-OHDA (comunicacin personal con el Dr.
Fornaguera).

Como un dato importante, se encuentra la presencia de sustancias tipo antioxidantes en el
extracto, ya que en la fraccin 20-25 del cromatograma de huella digital obtenido (figura 27), se
encontraron estructuras tipo bivanilinas, una trihidroximetoxiflavona y otro componente cuyos
fragmentos moleculares concuerdan con los del resveratrol. Estos anlisis, se llevaron a cabo
gracias a la colaboracin del Dr. Eric Marchioni de la Facultad de Farmacia de la Universidad
Louis Pasteur de Estrasburgo, Francia; mediante cromatografa de gases acoplada con
espectrometra de masas. El nico inconveniente al respecto, fue que los anlisis nunca fueron
realizados por duplicado y el programa computacional acoplado al cromatgrafo decidi la
identificacin de las estructuras de acuerdo con el in molecular y los otros iones carga/masa
obtenidos, mostrando porcentajes de probabilidad de 80.75 y 83.3%.

Para comprobar si las respuestas producidas por el extracto no estaban asociadas con el receptor
M
3
endgeno se realizaron las mismas pruebas a 37 C, agonizando con carbacol y
antagonizando con atropina. Como se observa en la figura 21 se obtiene nuevamente la respuesta
agonista del extracto disuelto en solucin salina, la cual no es muscarnica M
3
pues no es
bloqueada por la atropina. Resultados concordantes con los anteriores se obtienen tambin con el
extracto disuelto en DMSO 100%, en donde una pequea respuesta es desencadenada por los
solventes ms que por el extracto (datos no mostrados). Finalmente, en la figura 22 se observa
que la disolucin de extracto en etanol/agua present una pequea respuesta no muscarnica;
puesto que los solventes ejercieron parte de la respuesta, pero el extracto mostr una respuesta de
amplitud an mayor. Debido a que las clulas transfectadas con receptor CXCR4 son tambin
HEK, de forma endgena contienen los mismos receptores antes mencionados y cualquiera de
ellos puede estar siendo agonizado por los componentes de M. urens.

Se present a 37 C una respuesta bifsica al colocar el extracto, disuelto en DMSO 100% y
etanol/agua 8:2, como por ejemplo se muestra en la figura 22. Segn la literatura, la primera
parte de esa respuesta bifsica podra corresponder a la liberacin de calcio de las reservas
intracelulares (retculo endoplasmtico); mientras que la segunda parte podra darse por la
entrada de calcio a travs de los canales operados por receptor (ROCCs) o por los canales
capacitantes de calcio (SOCCs) (Bugaj et al, 2005; Gilon y Henquin, 2001; Zagranichnaya et al,
2005). Lo anterior sugiere que a nivel fisiolgico, mltiples vas celulares de activacin y
diversos efectos podran ser desencadenados con la aplicacin del extracto hidroalcohlico de
Mucuna urens.

Buscando realizar una caracterizacin ms precisa de los componentes activos en los ensayos
realizados, se procur conocer el espectro de absorcin de los compuestos por estudiar en HPLC
deteccin UV/Vis. Se realiz el correspondiente espectro de absorcin o densidad ptica del
extracto crudo disuelto en diferentes solventes. Las longitudes de onda de mxima absorcin
(longitudes de onda de trabajo) del extracto, se obtuvieron de los mximos mostrados en la figura
1 de los anexos (espectro de absorcin). A 219 nm se registr la seal de mayor intensidad; seal
que est compuesta tanto por solventes como por componentes del extracto. A 280 nm la seal
registra principalmente los componentes del extracto. En estas longitudes de absorcin se
encuentran comnmente seales de aldehdos, cetonas, sulfxidos, eninos, nitroderivados,
72

taninos condensados y sistemas conjugados. Resulta difcil predecir con certeza, cules de estos
tipos de compuestos se encuentran en el extracto con solo un espectro de absorcin UV-Vis, pero
parece probable la presencia de taninos condensados (polifenoles) y otros sistemas conjugados
segn las longitudes de onda del espectro (Isaza et al, 2005).

Una parte importante de la caracterizacin de los extractos naturales obtenidos de plantas es
obtener registros de sus propiedades fsicas o qumicas que permitan respaldar la
reproducibilidad de dichos ensayos y la identificacin de los extractos naturales. Como ya fue
mencionado en el marco terico, las huellas digitales cromatogrficas de los extractos
naturales son una representacin grfica de las seales producidas por los componentes del
extracto mediante la deteccin de diversas tcnicas analticas, y resultan de suma importancia ya
que permiten la identificacin, y el control de calidad de los productos naturales, as como el
estudio de sus componentes (Li et al, 2007).

Como puede verse en las figuras 23A y 23B, la separacin obtenida para dos disoluciones de
extracto liofilizado (M. urens) en distintos solventes con la columna C
8
, fue bastante deficiente.
La mayora de seales se unen al frente solvente y se ven como un solo bloque sin resolver. Ya
en estas primeras inyecciones, aunque no con buena resolucin, se observa que para solventes
diferentes con una misma columna, la huella cromatogrfica de las sustancias disueltas del
extracto liofilizado no es la misma. Se continan las pruebas bajo las mismas condiciones
realizando un cambio solo en el tipo de columna utilizada (figura 24). Con la columna C
18
se dio
una mejor separacin y migracin de los componentes de Mucuna de acuerdo con los distintos
gradientes. El aumento en la longitud de las cadenas no polares (C
18
) de la columna, aumentan la
superficie de contacto, y por tanto el rea de interaccin con los componentes hidrofbicos de M.
urens, permitiendo que sean retenidos por ms tiempo dentro de la fase mvil estacionaria. En la
figura 24B se muestra un blanco de una mezcla similar a la de los solventes de la inyeccin
anterior, donde se confirma que los picos inmediatos al frente de elucin corresponden en buena
medida a la mezcla de los solventes; especialmente al dimetilsulfxido que absorbe en el
ultravioleta a aproximadamente 215 nm (www.kaye and laby).

En las pruebas cromatogrficas siguientes, se procur obtener las huellas digitales del extracto
liofilizado resuspendido en diferentes solventes. Se realizaron varias pruebas hasta determinar
ms certeramente, el tiempo y la composicin de los solventes que deberan utilizarse para la
limpieza entre inyecciones, el tiempo de estabilizacin de las longitudes de onda, as como la
limpieza del lazo de inyeccin. Lo anterior, debido a que en las primeras pruebas llevadas a cabo
(datos no mostrados), desaparecan los picos entre inyecciones sucesivas, o se corran hacia el
frente de elucin. Principalmente, los picos hidroflicos cambiaban los tiempos de retencin al
paso de las inyecciones. En estas pruebas se mantuvo el lazo abierto los 55 minutos de corrida y
se cerraba durante la limpieza. El problema mencionado mejor con los pasos de limpieza
implementados (descritos en la metodologa) antes de la siguiente inyeccin de extracto; as
como, al permitir un tiempo de estabilizacin de las longitudes de onda del detector, con la
composicin de fase mvil inicial de inyeccin (agua). Una de las explicaciones posibles a los
problemas vistos, es que hayan quedado residuos de acetonitrilo del gradiente en el lazo, que
variaban la polaridad de la fase mvil al reiniciar las inyecciones. Sin embargo, consultando en
la literatura, algunos autores tambin reportan la falta de reproductividad en los tiempos de
retencin con columnas de fase reversa bajo condiciones de fase mvil 100% acuosa (Doshi et
73

al, 2003). Unos autores, lo explican en trminos de colapso de la matriz en la que se encuentran
las cadenas alqulicas de la fase estacionaria; mientras que otros, proponen una expulsin del
agua que hay dentro de los poros de la fase estacionaria a la salida de la columna (Doshi et al,
2003; Wolcott y Dolan, 1999). En el segundo caso mencionado; al disminuir o detener el flujo, la
expulsin de la fase mvil acuosa baja la presin dentro de la columna, y reduce los tiempos de
retencin de los analitos en la siguiente inyeccin. Estos autores, demuestran como los analitos
en fase mvil completamente acuosa, disminuyen hasta en un 80% sus tiempos de retencin con
columnas C
18
(Doshi et al, 2003).

Finalmente, luego de solucionar los problemas relacionados con el tiempo de retencin de los
componentes hidroflicos, se hicieron las inyecciones de M. urens mostradas en las figuras 25A,
25B, 26A y 26B. Las cuales demuestran una solubilidad diferencial de los componentes del
extracto de Mucuna urens con respecto a los solventes empleados. La solucin salina + 1%
DMSO y el agua + 5% DMSO cuya polaridad es similar y alta, solubilizan en mayor proporcin
los componentes hidroflicos como era de esperarse; mientras que el DMSO 100% y el
etanol/agua 8:2 cuya polaridad es menor, solubilizan en mayor proporcin los componentes
hidrofbicos. En las pruebas anteriores, solo se introdujo un cambio en el sistema cromatogrfico
respecto a las condiciones de las figuras 23 y 24, y fue la adicin de 0.1% TFA a cada una de las
botellas de fase mvil (agua y acetonitrilo).

Ya en la figura 27 se presentan los resultados de la huella digital cromatogrfica de M. urens
disuelta en DMSO 100%, la cual fue establecida al final de varias pruebas hasta mejorar el
gradiente de separacin. El extracto contiene componentes altamente hidroflicos que salen en
los primeros 10 minutos sin resolverse muy bien. Adems presenta una porcin de componentes
menos hidroflicos resueltos entre s en el gradiente hacia 30% acetonitrilo, la cercana
cromatogrfica de estos picos sugiere que este grupo de componentes poseen estructuras
qumicas similares entre ellos. Finalmente, el gradiente se hace ascender hasta 100% acetonitrilo;
aunque en esta porcin la salida de componentes parece mnima a ambas longitudes de onda, se
llev a cabo para eluir cualquier componente de carcter altamente hidrofbico que no presente
absorcin UV a las longitudes de onda registradas.

Se contino luego con las corridas de separacin del extracto, para ampliar el conocimiento
sobre el o los componentes agonistas M
1
encontrados en la primera fase de pruebas. La corrida
C2.001 de la figura 29 fue la elegida para llevar a cabo la separacin del extracto en pooles
segn su polaridad. Luego del secado y redisolucin se realizaron, pruebas cromatogrficas sobre
cada uno de los pooles separados. De acuerdo con lo que se observa en la figura 30B, el pool 2 se
obtuvo bastante limpio y concentrado, a pesar de utilizar la misma columna analtica en
inyecciones con un volumen preparativo. En el pool 1 (figura 30A) los resultados fueron menos
exitosos porque se obtuvo una mezcla con una cantidad considerable de pool 2. Sin embargo, la
separacin del pool 1 no fue del todo ineficiente, ya que s se encontr una mayor concentracin
de sustancias correspondientes a lo que se defini como pool 1 (sustancias hidroflicas). En la
figura 31 se realiz un blanco en las mismas condiciones que el anlisis anterior con el objetivo
de descartar las seales debidas al solvente.

En las nuevas pruebas sobre el receptor M
1
con los pooles separados, los resultados hallados
fueron que el o los componentes agonistas muscarnicos M
1
se repartan entre el pool 1 (ver
74

figura 32A) principalmente y en el pool 2 (figura 32B) en forma ms dbil. De acuerdo con lo
observado en la figura 32A, el pool 1 produce una considerable respuesta casi completamente
muscarnica M
1
comprobada con el bloqueo visto en la misma figura. Se nota tambin una
disminucin de la respuesta al agonista patrn, la cual puede relacionarse con una
desensibilizacin del receptor (Billington y Penn, 2002); una interferencia con la unin del
ligando patrn (carbacol) al receptor muscarnico o con la desensibilizacin de los receptores del
retculo endoplasmtico (IP
3
R).

Para la primera propuesta de disminucin de la respuesta al agonista, llamada desensibilizacin
(disminucin en la capacidad de respuesta), muchos autores la explican por medio de la
fosforilacin del receptor asociado a protenas G por una kinasa (va GRKs) y posterior unin de
este con molculas de arrestina. Al unirse las molculas de arrestina, estas promueven el
desacople del receptor con la protena G y favorecen la internalizacin del receptor (Billington y
Penn, 2002; Fuentes et al, 2005; Shinyama et al, 2003; Walsh et al, 2000) lo que
experimentalmente puede observase en una disminucin de la respuesta a las mismas
concentraciones de agonista patrn.

Los resultados de la figura 3 de anexos apuntan un poco ms a la tercera hiptesis de
desensibilizacin de los receptores del retculo endoplasmtico. Ya que cada receptor especfico
asociados con protenas G tiene diferente mecanismo y velocidad de desensibilizacin, mientras
que todos estos tipos de receptores comparten la estimulacin de los receptores de IP
3
y la salida
de calcio del retculo endoplasmtico. Esta salida de calcio, puede agotarse por activaciones que
vacen extensamente la organela celular mencionada.

Segn se observa en la figura 32B, el pool 2 produce una pequea respuesta completamente
muscarnica M
1
que prcticamente no desensibiliza la respuesta al agonista si se compara el nivel
de fluorescencia con el control de la figura 32A. Lo anterior confirma que hay presencia de
agonismo muscarnico tanto en la parte hidroflica como hidrofbica del extracto.

Nuevamente, se llevaron a cabo pruebas para mejorar la separacin de los componentes del
extracto por medio de HPLC. Como puede notarse en las figuras de huella digital y separacin
del extracto crudo (figura 25, 26, 29 y 30), la mayor parte de los componentes hidrofbicos (pool
2) salen en la primera parte del gradiente con ACN, por lo que comienza a trabajarse la
separacin del pool 2 extendiendo el tiempo para que la fase mvil alcance un 30% de ACN (ver
figura 33). En la parte final del gradiente se asciende hasta 100% ACN, pero se observan muy
pocas seales en la etapa final del cromatograma.

Luego de varias corridas (no mostradas), la inyeccin de extracto con la separacin final se
estableci como se muestra en la figura 34; dos fueron los cambios importantes respecto a la
figura 33. Primero, se agregaron 10 minutos ms a la fase mvil con agua, y segundo se
corrieron 15 minutos ms a 100% acetonitrilo para dejar salir todos los componentes
hidrofbicos del extracto. En esta inyeccin semi-preparativa del extracto (400 L, figura 34),
fueron colectadas las fracciones cada 5 minutos a partir del primer minuto hasta el minuto 90.
Cada una de las fracciones se concentraron y se resuspendieron para efectuar posteriores anlisis
de respuesta al calcio en las clulas CHO-M
1
, con miras a buscar en qu puntos de los pooles
75

hidroflico e hidrofbico se encontraban el o los compuestos del extracto de Mucuna urens
responsables del agonismo muscarnico M
1
.

En la figura 35B se muestra una de las fracciones finales (65-70) de lo que correspondera al
pool 2 de la separacin inicial, y se observa como con esta fraccin del extracto no se produjo
ningn tipo de respuesta (muscarnica ni de otro tipo acoplado a Gq). A pesar de la correcta
funcin del sistema celular, corroborada con el 60% de la respuesta a carbacol alcanzado.

En la figura 36A se muestra que la quinceava fraccin de la colecta (70-75) provoc una
respuesta muscarnica (correspondiente al 22% de la fluorescencia por calcio total), la cual es
bloqueada en la mitad por la atropina, por otro lado, la siguiente fraccin (75-80, figura 36B)
present solo una pequea respuesta muscarnica (5% del total) bloqueada completamente por la
atropina. En estos dos ltimos experimentos la eficacia en el bloqueo de la atropina parece
haberse disminuido tanto en el caso del extracto como en el caso del carbacol, posiblemente por
la competencia que se produce entre las dos cargas de agonistas (extracto y patrn) y el
antagonista aplicado al inicio (a 30 segundos). Se confirma de esta manera que entre el minuto
70 y 80 eluyen las molculas de agonista muscarnico responsables en la separacin inicial de
llevar a cabo la respuesta muscarnica M
1
del pool 2.

En la figura 37A se muestra que la primera fraccin de la colecta (1-5) provoc tambin una
respuesta muscarnica (correspondiente al 25% de la fluorescencia por calcio total), la cual es
casi totalmente bloqueada por la atropina, mientras que la siguiente fraccin (5-10, figura 37B)
present solo una pequea respuesta de fluorescencia ms rpida de lo normal no bloqueada por
atropina. Esto sugiere, que la primera fraccin de elucin (1-5) contiene principalmente la otra
parte de compuestos agonistas muscarnicos M
1
que se observaron en el pool 1 de la separacin
inicial. Para una ptima interpretacin y respaldo de los resultados en la figura 35A se muestra
un control que evidencia tanto la correcta respuesta celular como el bloqueo de la respuesta
agonista por la atropina.

Entre las figuras 35A y 37A, se observa como la respuesta del agonista control se ve reducida al
aplicar el extracto, sobre todo con la fraccin hidroflica; esta disminucin podra ser en parte
una desensibilizacin del receptor por el estmulo continuo en corto tiempo o por accin de algn
componente de M. urens contenido en las fracciones (Billington y Penn, 2002; Chen et al, 2008).

Basado en el agonismo muscarnico encontrado para M. urens, puede sugerirse que aunque la
accin agonista M
1
inducida por el extracto en las clulas, no concuerda con el efecto
antiparkinsoniano de los compuestos anticolinrgicos usados como terapia actualmente (Gngora
et al, 2005); s explica en parte y va en la direccin de los resultados vistos para otras Mucunas
como M. pruriens, de potenciacin de la memoria y el aprendizaje tan relacionados con la
actividad muscarnica hipocampal y la Enfermedad de Alzheimer (Sathiyanarayana et al, 2007).

Con respecto a los resultados mostrados por esta tesis; no se encontraron publicados en las bases
de datos disponibles, resultados directamente relacionados con la actividad muscarnica del
extracto de otra de las especies de Mucuna en estudios in vitro, ni in vivo.

76

Sin embargo, s se tiene bastante informacin acerca de la presencia de levodopa en este gnero
de plantas. El conocimiento cientfico de la especie ms estudiada, Mucuna pruriens, resulta un
poco contradictorio respecto a las bases fisiopatolgicas de la EP. El efecto de M. pruriens sobre
los neurotransmisores monoaminrgicos a nivel del sistema nervioso central en ratas no
lesionadas con 6-OHDA, no sugiere fuertes evidencias sobre el efecto antiparkinsoniano de esta
especie. Ya que aunque levodopa se encontr en la sangre de las ratas tratadas con el extracto, el
anlisis post-mortem de neuroqumica cerebral, no demostr cambios sobre la concentracin de
levodopa en corteza, hipocampo, estriado o sustancia negra. Adems, el neurotransmisor
dopamina solo aument a nivel de la corteza, sin variar en ninguna de las otras regiones
mencionadas (Manyam et al, 2004a).

Los autores del estudio anterior, sugieren que el efecto del extracto puede deberse a otros
componentes adems de la levodopa, sin especificar qu tipo de efecto podran tener esos otros
compuestos (Manyam et al, 2004a). Una limitante de ese estudio, fue que utilizaron animales
sanos para probar el efecto del extracto a nivel cerebral, y es conocido que la condicin basal de
las vas sanas y las lesionadas es muy diferente. Por ello la comparacin se hace difcil.

En otro estudio con ratas lesionadas por 6-OHDA, los cientficos identificaron efectos
neuroprotectores de M. pruriens a travs de su accin antioxidante. Este estudio identific en el
extracto la presencia de coenzima Q-10 y NADH en cantidades significativas, sin obtenerse
efecto alguno sobre la MAO. Adems este estudio mostr que el extracto restaur los niveles
generales de neurotransmisores monoaminrgicos en la sustancia negra mejor que la levodopa
sinttica pura (Manyam et al, 2004b). Estos efectos sobre las monoaminas pudieron deberse en
parte a la presencia de sustancias como la L-Dopa, precursor de dopamina y en otra parte a la
presencia de antioxidantes como la coenzima Q-10 y el NADH (Manyam et al, 2004b)
encontrados por estos investigadores.

A nivel clnico, un estudio de M. pruriens demostr contener L-Dopa, la cual se cuantific en la
sangre de los pacientes que recibieron el extracto. Los pacientes, presentaron una mejora motora,
equivalente a la observada con L-Dopa/carbidopa sinttica (patrn). En este estudio clnico, los
perfiles farmacocinticos de L-Dopa provenientes de la dosis de 30 g de extracto, produjeron un
inicio de accin ms rpido y una duracin del efecto teraputico ms prolongada que los
patrones (Katzenschlanger et al, 2004). Por lo tanto, en este estudio se evidenciaron las
potenciales ventajas del extracto de M. pruriens con respecto al tratamiento convencional de L-
Dopa/carbidopa.

Queda con este trabajo de tesis, abierta la posibilidad para el anlisis qumico e identificacin de
los compuestos presentes en las fracciones activas de M. urens, as como la comprobacin de la
actividad muscarnica M
1
de las fracciones activas en un modelo in vivo, ya sea de Parkinson
como el de 6-OHDA, o los de memoria de trabajo y aprendizaje relacionados con la enfermedad
de Alzheimer. Para de este modo, sustentar una lnea de investigacin con fundamentos ms
aplicables de la actividad muscarnica del extracto hidroalcohlico de esta especie de planta
presente en la biodiversidad costarricense.

Con este trabajo se logr comprobar la presencia de actividad muscarnica M
1
in vitro en el
extracto hidroalcohlico de M. urens crudo y fraccionado, inspirados en investigaciones de tesis
77

anteriores de la Universidad de Costa Rica. Se logr realizar una separacin cromatogrfica del
extracto de M. urens y establecer un cromatograma de huella digital del extracto que servir
como control de calidad o patrn de posteriores estudios de esta semilla. Adicionalmente, se
consigui dejar abiertas nuevas preguntas de investigacin orientadas a otras perspectivas
teraputicas, no imaginadas al inicio de este trabajo; tal como los efectos sobre algunos procesos
degenerativos subyacentes a la enfermedad de Alzheimer.

Conclusiones
1. El extracto hidroalcohlico 8:2 de la semilla de M. urens contiene cantidades
considerables de taninos, detectables por pruebas visuales. Sin embargo, no fue posible
detectar la presencia de otros grupos de metabolitos como glicsidos antracnicos,
alcaloides o flavonoides en dicho extracto.

2. En HPLC, la columna C
18
logr efectuar una mejor separacin de los componentes del
extracto hidroalcohlico de M. urens y permiti establecer la huella digital
cromatogrfica del extracto utilizado, el cual mostr segn dicho registro la presencia
mayoritaria de componentes hidroflicos.

3. En las pruebas de fluorescencia, las fracciones 8 y 9 del extracto liofilizado de M. urens
redisuelto en solucin salina + 1% DMSO produjeron una marcada autofluorescencia al
ser excitadas bajo las condiciones de anlisis del Indo-1; por lo que se confirm la
existencia de una interferencia propia del extracto que impidi continuar los anlisis con
dicha sonda.

4. Las pruebas biolgicas in vitro de respuesta al calcio evidenciaron que el extracto
hidroalcohlico de M. urens redisuelto en solucin salina + 1% DMSO, EtOH/H
2
O 8:2,
DMSO 100% o agua + 5% DMSO no posee actividad antagonista, ni agonista sobre el
receptor muscarnico M
3
a 21 C, por lo que aparentemente este receptor no estara
involucrado en los efectos antiparkinsonianos descritos para esta planta.

5. Las pruebas biolgicas in vitro de respuesta al calcio evidenciaron que el extracto
hidroalcohlico de M. urens redisuelto en solucin salina + 1% DMSO o agua + 5%
DMSO no posee ninguna actividad antagonista, ni agonista sobre el receptor muscarnico
M
1
a 21 C, por lo cual tampoco parece tener relacin la actividad de este receptor con los
efectos antiparkinsonianos descritos para M. urens.

6. Las pruebas biolgicas in vitro de respuesta al calcio con clulas CHO-M
1
transfectadas,
mostraron que el extracto hidroalcohlico de M. urens redisuelto en DMSO 100% posee
actividad agonista sobre el receptor muscarnico M
1
a 21 C. Mientras que el mismo
extracto redisuelto en EtOH/H
2
O 8:2 posee actividad tanto agonista sobre el receptor
muscarnico M
1
como agonista sobre otro(s) receptor(es) endgeno(s) no identificado(s).

7. En las pruebas biolgicas in vitro de respuesta al calcio con clulas CHO sin transfectar,
el extracto hidroalcohlico de M. urens redisuelto en EtOH/H
2
O 8:2 present actividad
78

agonista a 21 C sobre un receptor endgeno no identificado, lo cual demuestra y
comprueba la actividad agonista no muscarnica encontrada anteriormente sobre las
clulas transfectadas con el receptor M
1
.

8. Segn otras pruebas biolgicas in vitro de respuesta al calcio en clulas HEK
transfectadas con el receptor CXCR4, el extracto hidroalcohlico de M. urens redisuelto
en solucin salina + 1% DMSO, EtOH/H
2
O 8:2 o DMSO 100% no ejerci actividad
agonista o antagonista sobre este receptor a 37 C, pero s mostr una actividad agonista
sobre algn receptor endgeno celular no identificado.

9. Se estableci una huella digital cromatogrfica suficientemente separada para los
componentes del extracto crudo de M. urens redisueltos en DMSO 100%. Dicha huella se
obtuvo mediante HPLC y constituye un punto importante de referencia y control para
posteriores anlisis de la misma planta.

10. Los componentes del extracto hidroalcohlico liofilizado de Mucuna urens presentaron
una solubilidad diferencial en los cuatro solventes empleados para la redisolucin del
mismo. Lo anterior, se demostr al obtener distintos cromatogramas de huella digital por
HPLC, lo que adems podra explicar las diferencias vistas entre las respuestas biolgicas
in vitro al receptor M
1
.

11. El mtodo cromatogrfico usado en la separacin del extracto crudo fue ms eficiente
para el pool 2 (hidrofbico) que para el pool 1, debido a la gran cantidad de componentes
con carcter hidroflico presentes en l.

12. Las pruebas biolgicas in vitro en clulas CHO-M
1
transfectadas, demostraron que tanto
el pool 1 como el pool 2 de la separacin de M. urens redisuelto en DMSO 100% ejerci
actividad agonista sobre el receptor muscarnico M
1
a 21 C.

13. Las pruebas biolgicas in vitro sobre el receptor M
1
evidenciaron que tanto la fraccin 1-
5 (hidroflica) como las fracciones 70-75 y 75-80 (hidrofbicas) del extracto de M. urens
redisuelto en DMSO 100%, ejercieron actividad agonista muscarnica a 21 C. Esta
actividad podra de alguna manera relacionarse con el desarrollo y consolidacin de
procesos cognitivos como los de aprendizaje y memoria.

Recomendaciones
Mantener el lazo de inyeccin abierto durante la corrida y luego durante toda la etapa de
limpieza posterior a cada inyeccin de extracto disuelto de M. urens en el cromatgrafo.

Realizar limpiezas que incluyan polaridades de gradiente de fase mvil similares a los
usados en el anlisis de extracto entre cada inyeccin.

Verificar antes de realizar las inyecciones la estabilidad de las seales de deteccin, bajo
las condiciones de flujo inicial del anlisis antes de realizar la inyeccin.
79


Utilizar cido trifluoroactico 0.1% en cada una de las botellas de fase mvil para
mantener bajo el pH.

Para las inyecciones de separacin del extracto crudo por HPLC utilizar volmenes
pequeos para mejorar la separacin o emplear un sistema de HPLC semi-preparativo.

Utilizar solventes polares para evitar problemas de precipitacin del extracto en el
sistema cromatogrfico.

Llevar a cabo un cribaje con vehculos polares, prticos y aprticos para optimizar la
disolucin de los liofilizados provenientes de extractos naturales.

Conservar la tripsina y los medios de cultivo celular a 4 C para evitar la degradacin de
los aminocidos constituyentes.

No utilizar probenecid en el tampn de carga para clulas HEK-293 cuando el marcaje se
realiza con la sonda Indo-1, porque no se logran registrar posteriormente los cambios de
concentracin de calcio intracelular.

No utilizar las clulas cargadas por un periodo superior a 120 minutos ya que varia
considerablemente el nivel de fluorescencia total.

Controlar muy bien la temperatura experimental en los ensayos biolgicos celulares; as
como proteger de la luz las clulas ya cargadas.

Homogenizar por aspiracin y expulsin suave las alcuotas de suspensiones celulares
antes de cada prueba.

Realizar la descarga de las alcuotas de analitos de manera rpida y completa en las
pruebas celulares.

Ejecutar controles agonistas y antagonistas en cada pool de clulas preparadas para
experimentos por calcio fluorescente.

Controlar la temperatura y velocidad de secado al vaco de las fracciones del extracto, ya
que altas velocidades aumentan considerablemente la temperatura y pueden producirse
reacciones qumicas indeseadas.

Probar en el modelo animal de lesin unilateral con 6-OHDA las fracciones activas
(sobre M
1
) del extracto de M. urens para analizar sus efectos conductuales y potencial
antiparkinsoniano.

Realizar estudios en modelos animales para evaluar el efecto de las fracciones activas del
extracto de M. urens sobre memoria y aprendizaje.

80

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91

Anexos

Figura 1: Espectro de absorcin UV- Visible para Mucuna urens 2.5 mg/mL en DMSO 100% y
solucin salina + 3% DMSO a T. A.


Figura 2: A) Dosis/Respuesta al calcio por M
1
al adicionar M. urens disuelta en DMSO 100%.
B) Mismo ensayo de curva dosis/respuesta normalizada. Clulas CHO-M
1
, empleando como
sonda Indo-1; emisiones tomadas a 401 y 475 nm; temperatura regulada a 21 C.
92



Figura 3: Respuesta al calcio con M. urens disuelta en DMSO 100% ms agonistas
muscarnicos o purinrgicos. Clulas CHO-M
1
, empleando como sonda Fluo-4; emisin tomada
a 516 nm y temperatura regulada a 21 C.



Tabla 1: Prueba de Viabilidad Celular con azul de tripn al 0.4% en clulas CHO-M
1
, cargadas
con Fluo-4 y agitadas 6 minutos en el espectrofluormetro bajo condiciones similares a los
ensayos biolgicos in vitro.

Condiciones de
la prueba
% de muerte
celular 1
% de muerte
celular 2
% de muerte
celular 3
Promedio de los
% de muerte
celular

Clulas cargadas
+ DMSO + Azul
de tripn (control)
1.33 7.19 2.02 3.51
Clulas cargadas
+ M. urens en
DMSO 100% +
Azul de tripn
3.15 4.79 2.27 3.40

Mediciones hechas en placas de conteo celular Kova-slide.