1

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE COSTA RICA

Escuela de Biología









Informe del Trabajo Final de Graduación









IMPLEMENTACIÓN DE UN PROTOCOLO POR HPLC PARA LA
CUANTIFICACIÓN DE ACIDO GAMMA-AMINOBUTÍRICO Y GLUTAMATO
EN CEREBRO DE RATA









Andrea A. Monge Acuña









Cartago, 2007






2



















































3
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE COSTA RICA

Escuela de Biología









Informe del Trabajo Final de Graduación









IMPLEMENTACIÓN DE UN PROTOCOLO POR HPLC PARA LA
CUANTIFICACIÓN DE ACIDO GAMMA-AMINOBUTÍRICO Y GLUTAMATO
EN CEREBRO DE RATA









Andrea A. Monge Acuña









Cartago, 2007





4
IMPLEMENTACIÓN DE UN PROTOCOLO POR HPLC PARA LA
CUANTIFICACIÓN DE ACIDO GAMMA-AMINOBUTÍRICO Y GLUTAMATO
EN CEREBRO DE RATA

Andrea A. Monge Acuña
*



RESUMEN


La iniciativa de implementar nuevas herramientas de investigación surge en
respuesta a la necesidad de ampliar el conocimiento relativo a mejores formas de
diagnóstico y tratamiento de afecciones neuropsiquiátricas, como la depresión y la
ansiedad. El presente trabajo, consiste en una contribución al estudio de la
neuroquímica de las emociones y su lado patológico. La labor se enfoca en la
estandarización de un protocolo por Cromatografía Líquida de Alta Resolución de
detección electroquímica (HPLC-EC), para la cuantificación de aminoácidos
transmisores, involucrados en el desarrollo de dichas patologías. Este protocolo se
desarrolló en el Laboratorio de Investigaciones en Neurociencias de la Universidad
de Costa Rica. El principal objetivo es el de evaluar las características químico-
físicas necesarias para la separación efectiva de los aminoácidos GABA y
Glutamato, basándose en el trabajo de Rowley, et al (1995). Para cumplir con dicho
objetivo, se evaluaron los parámetros cromatográficos: intensidad de corriente,
temperatura, pH, índice de flujo y concentración de metanol, en función de la
resolución y la detección de los aminoácidos. Asímismo, se hizo uso de una técnica
para el marcaje químico de analitos de baja detección: la técnica de derivatización.
Adicionalmente, se realizaron pruebas para determinar la repetibilidad, la linealidad
y el efecto que tiene la matriz sobre la detección de los aminoácidos. Con base en
estos ensayos, fue posible desarrollar un protocolo repetible y lineal para la
cuantificación efectiva de GABA y Glutamato. El nuevo protocolo consiste en la
utilización de una fase móvil con metanol:agua al 23% y un pH 5,5; bajo condiciones
de corrida de 0,65ml/min; 850mV; 10:50nA ;un rango de temperatura entre 18-23°C;
y una cantidad de reactivo de derivatización de 22μL (OPA 86mM)/mL de solución
acuosa de aminoácidos.





*
Informe de Trabajo Final de Graduación, Escuela de Biología, Instituto Tecnológico de
Costa Rica,Cartago, Costa Rica. 2005

5
IMPLEMENTATION OF A HPLC PROTOCOL FOR QUANTIFICATION OF
GAMMA-AMINOBUTYRIC ACID AND GLUTAMATE IN RAT BRAIN

Andrea A. Monge Acuña
*



ABSTRACT


In response to the need for better diagnostic measures and treatments for
neuropsychiatric affections such as depression and anxiety a new initiative to expand
knowledge and implement new investigative tools arises. This work represents a
contribution to the research of the neurochemistry of emotions and their pathological
aspects. This document, developed in the Neurosciences Research Laboratory-
University of Costa Rica, focuses on the standardization of a protocol by high
performance liquid chromatography of electrochemical detection (HPLC-EC), for the
quantification of amino acid transmitters, involved in the development of these
pathologies. The main objective is the evaluation of the chemico-physical
characteristics for the effective separation of the amino acids GABA and glutamate,
being based on the work of Rowley (1995). In order to fulfill this objective, the
chromatographic parameters evaluated were: intensity of current, temperature, pH,
flow rate and concentration of methanol based on the resolution and the detection of
amino acids and additionally, a derivatization technique was used for the chemical
labeling of low detection analites. Tests were run to determine the repeatability, the
linearity and the effect of matrix on amino acid detection. Based in these tests, it was
possible to develop a repeatable and linear protocol for the effective quantification of
GABA and glutamate. The new protocol consists of a mobile phase with 23%
methanol; pH 5,5; and chromatographic conditions of 0,65ml/min, flow rate ; 0,85V,
voltage; 10:50nA, current intensity; 18-23°C, temperature range; and an amount of
derivatization reagent of 22μL (OPA 86mM) per mL of amino acids aqueous solution.








*
Informe de Trabajo Final de Graduación, Escuela de Biología, Instituto Tecnológico de Costa Rica,
Cartago, Costa Rica. 2005


6
IMPLEMENTACIÓN DE UN PROTOCOLO POR HPLC PARA LA
CUANTIFICACIÓN DE ACIDO GAMMA-AMINOBUTÍRICO Y
GLUTAMATO EN CEREBRO DE RATA









Informe presentado a la Escuela de Biología del Instituto Tecnológico de
Costa Rica como requisito parcial para optar al título de Bachiller en
Ingeniería en Biotecnología









Miembros del Tribunal






_______________________________
Miguel Rojas Chávez, PhD
Profesor asesor






____________________________ __________________________
Jaime Fornaguera Trías, PhD Silvia Benavides Varela, Bach
Asesor externo Lectora




7
DEDICATORIA















A papi y a mami, por su amor incondicional























8

AGRADECIMIENTOS

La autora desea dejar constancia de su agradecimiento:

A Dios por darme el milagro de la vida, por mostrarme su amor y sencillez a través
de la creación y por enseñarme que las contrariedades no son motivo de
desesperación, sino el inicio de una nueva lección sobre la vida.

A Raúl, mi futuro esposo, por estar siempre a mi lado, por ser mi apoyo en
momentos difíciles y por ser una razón importante de mi vida, de mi amor y de mi
felicidad.

A papi por su amor, su apoyo, su dedicación constante y su enorme deseo de que
nosotros sus hijos, logremos una educación universitaria y una vida plena.

A mami, por su amor, su apoyo, su cuido, sus consejos y por enseñarnos a ser
personas críticas, independientes y de buen corazón.

Al Doctor Miguel Rojas, por estar siempre pendiente de mi formación profesional y
por brindarme tan valiosos consejos en lo personal.

A Silvia Benavides, cuyo desempeño en el laboratorio constituyó en todo momento
un desafío para mi misma y una inspiración, pero sobre todo por ser una amiga tan
especial.

A Liz Vega por su colaboración en el desarrollo de este trabajo, por ser una persona
honesta y servicial, y por su maravillosa amistad.

A la Master Elvira Salas, por su ayuda profesional y su preocupación a lo largo de la
realización de este trabajo.

Al Doctor Jaime Fornaguera, por permitirme disfrutar de tan valiosa oportunidad, por
haber sido en todo momento, un mentor y un amigo, pero muy especialmente, por
haber puesto su confianza en mi persona, porque eso significó un crecimiento
personal y profesional muy grande.

A todo el equipo de neurociencias, por hacerme sentir parte de su familia.
9
ÍNDICE GENERAL

RESUMEN.................................................................................................................. i
DEDICATORIA.............................................................................................................ii
AGRADECIMIENTOS.................................................................................................iii
INDICE GENERAL......................................................................................................iv
INDICE DE CUADROS................................................................................................v
INDICE DE FIGURAS.................................................................................................vi
1.INTRODUCCIÓN....................................................................................................15
1.1 OBJETIVO GENERAL Y ESPECÍFICOS.............................................................18
2. REVISIÓN DE LITERATURA................................................................................20
2.1Fundamentos de la neurotransmisión...................................................................20
2.2 Neurotransmisores...............................................................................................25
2.3Glutamato y GABA................................................................................................27
2.4 Sistema Límbico..................................................................................................36
2.5 Miedo y Estrés.....................................................................................................37
2.6 Depresión y Ansiedad..........................................................................................38
2.7 Cromatografía Líquida de Alta Resolución......................................................... 46
3. METODOLOGÍA....................................................................................................52
3.1 Evaluación del protocolo de referencia para el análisis de aminoácidos
transmisores..............................................................................................................52
3.2 Extracción y Procesamiento de Cerebros de Rata para su
análisis.......................................................................................................................57
3.3 Evaluación de la resolución del método en homogeneizados de cerebro
(protocolo de Rowley, 1995)......................................................................................58
3.4 Optimización del protocolo para el análisis de GABA y
Glutamato..................................................................................................................59
3.5 Pruebas de calidad en el método desarrollado....................................................63
3.6 Calibración de equipos y pruebas de idoneidad al sistema HPLC......................67
3.7 Búsqueda de Hojas de Seguridad (MSDS, por sus siglas en inglés)..................68
3.8 Protocolo de limpieza...........................................................................................68
4.RESULTADOS........................................................................................................70
4.1 Evaluación del protocolo de referencia para el análisis de aminoácidos
transmisores..............................................................................................................70
4.2 Evaluación de la resolución del método en homogeneizados de cerebro
(protocolo de Rowley, 1995)......................................................................................72
4.3 Optimización de protocolo para el análisis de GABA y Glutamato......................73
10
5.DISCUSIÓN............................................................................................................89
6.CONCLUSIONES.................................................................................................103
7.RECOMENDACIONES.........................................................................................105
8.BIBLIOGRAFÍA.....................................................................................................107
9.ANEXOS...............................................................................................................117


11

INDICE DE CUADROS


Núm. Título Pág.
1
Ocho criterios para determinar si un compuesto
neuroregulatorio es un verdadero neurotransmisor
26
2
Categorías de Neurotransmisores y sus estructuras
27
3
Concentraciones de los aminoácidos transmisores e
interferentes (en μmoles/L) para análisis de linealidad
66
4
Tiempos de retención aproximados de cada aminoácido
transmisor por separado en fase móvil (25% metanol, pH
4,5), a una sensibilidad de 20nA, a temperatura ambiente
(25,4 + 0,05°C).
70
5
Valores de R de cada aminoácido e interpretación
obtenidos según la fórmula: R= 2 * [(T
R
)
B
-(T
R
)
A
/ W
A
+ W
B
)
71
6
Tiempos de retención de cada aminoácido según la
composición química de la fase móvil. Temperatura de
análisis 26-27°C.
73
7
Comparación de los tiempos de retención de cada
aminoácido según el pH de la fase móvil.
75
8
Comparación de las tres mejores fases móviles
desarrolladas y del protocolo de referencia. Temperatura
de evaluación: 21,0+ 1°C
78
9
Relación entre la intensidad aplicada y la respuesta en
Mv.s de los transmisores: glutamato, glutamina y GABA.
81
10
Resultados obtenidos de las pruebas de repetibilidad en un
solo día para los distintos aminoácidos en matriz
83
11
Coeficiente de correlación asociado a cada transmisor,
según la concentración de OPA agregada (puntos
inferiores de la curva de linealidad)
86
12
Coeficiente de correlación asociado a cada aminoácido,
según la concentración de OPA agregada (puntos
superiores de la curva de linealidad).

86





12
ÍNDICE DE FIGURAS


Núm. Título Pág.
1 Representación esquemática de una neurona y sus partes 20
2 Representación esquemática de una sinápsis 21
3 Representación esquemática de las uniones espaciosas 22
4 Sinapsis química: liberación de neurotransmisores. 24
5 Flujo de iones a través de un canal abierto en la membrana de
una neurona postsináptica.
24
6 Diagrama de uno de los mecanismos de acción por mensajeros
secundarios mediados por proteína G
39
7 Modelo más complejo de la activación de cascadas celulares por
medio de receptores metabotrópicos.
30
8 Acción del neurotransmisor GABA y sus agonistas (las
benzodiazepinas), en la apertura del canal de Cl
-
de su receptor
GABA
A
.

33
9 Diagrama del ciclo GABA/Glutamato-Glutamina y localización
específica de las enzimas involucradas.
35
10 Modelo del sistema límbico según Papez y Mac Lean. 36
11 Tomografía de emisión de positrones de una persona con
desorden bipolar
39
12 Posibles áreas cerebrales afectadas en episodios depresivos
unipolares y bipolares
41
13 Propuesta del balance bioquímico en personas sanas y en
personas con depresión
42
14 . Probables vías serotonérgicas y regiones blanco en desórdenes
de ansiedad.
45
15 Esquema general de un sistema cromatográfico 47
16 Representación química de un aminoácido derivatizado con OPA 50
17 Representación de la reacción química entre OPA, un grupo
sulfito y un aminoácido.
51
18 Procedimiento de extracción y procesamiento de la muestra 60
19 Sistema de enfriamiento con hielo Gel

61
20 Cromatograma de los cinco aminoácidos evaluados y sus
respectivos tiempos de retención, a una temperatura de 25,4+1°C;
un flujo de 0,65ml/min, un potencial de 850mV; y una intensidad
de 20nA.
70
21 Interferencia entre los picos de GABA (100μM) y OPA (43mM), a
una temperatura de análisis de 26,0 ± 1°C; un flujo de 0,65ml/min,
un potencial de 850mV; y una intensidad de 20nA

71
22 Cromatograma de homogenizados de corteza temporal de
cerebro, bajo las condiciones cromatográficas del protocolo de
Rowley (1995)
71
23 Comparación de las cuatro fases móviles creadas a
concentraciones crecientes de metanol (pH 4,5).
73
24 Cromatogramas representativos de cada concentración de
metanol; a pH 4,5; para cinco aminoácidos (100μM).
73
25 Gráfica comparativa de las fases móviles de igual concentración
de metanol (23%) y diferente pH para cinco aminoácidos
(100μM).
75
26 Cromatogramas representativos de cada pH; en fase móvil al 23% 75
13
de metanol para cinco aminoácidos (100μM).
27 Cromatogramas de las tres mejores fases móviles desarrolladas. 76
28 Cromatograma de una muestra de corteza temporal diluída 1/10.
Condiciones cromatográficas: 23% MEOH; pH 5,5
77
29 Representación gráfica de la relación entre pH y temperatura 78
30 Gráfica del comportamiento de los tiempos de retención de cada
aminoácido frente a variaciones en la temperatura.
79
31 Cromatogramas de la misma fase móvil (23% metanol, pH 5,5)
realizados a diferentes flujos
80
32 Intensidad de corriente óptima para el análisis de Glutamato,
Glutamina y GABA
81
33 Respuesta comparativa porcentual de las áreas de los picos de
los cinco aminoácidos (100μM) por cromatograma, según la
cantidad de μL de solución de derivatización añadida
82
34 La gráfica muestra una comparación entre las áreas relativas de
los aminoácidos por cromatograma, al variar la cantidad de
solución de derivatización añadida (OPA 43mM).
83
35 Curvas de linealidad de las cuatro últimas concentraciones de
Glutamato (A) y Glutamina (B) en matriz, y de las últimas cinco de
GABA (C); derivatizadas con 22 μL de solución de derivatización
(OPA 86mM).
86
36 Producto de la reacción entre OPA, β-ME y una amina primaria. 90
37 Representación de la reacción química entre OPA, un grupo
sulfito y un aminoácido.
91
38 Corridas realizadas bajo los mismos valores de pH evaluados
pero bajo condiciones cromatográficas y de fase móvil distintas
95
39 Cromatograma de una muestra de homogeneizado de corteza
temporal (azul). Fase móvil 23%,pH 5,5; flujo 0,3ml/min,
temperatura: 5-7°C
116
40 Cromatograma obtenido con una fase móvil al 23% pH 5,0 a partir
del análisis de una muestra de corteza temporal.
116
























14
ÍNDICE DE ANEXOS


Núm. Título Pág.

1
Cromatograma logrado tras la optimización de las
condiciones recomendadas en este trabajo para el
análisis de muestras de cerebro

2 Protocolo de referencia


3 Hojas de calibraciones por PROCAME

117
4 Guía de calibración del electrodo


5 Hojas para el registro de datos


6 Protocolo de limpieza del electrodo de trabajo




























15
1. INTRODUCCIÓN

A partir de 1999, el Ministerio de Salud de Costa Rica, ha coordinado
actividades de investigación con el fin de valorar el estado actual de los servicios de
atención de la Caja Costarricense de Seguro Social (CCSS). En dicha investigación,
fue revelada la necesidad de plantear nuevos lineamientos y estrategias de acción
en el área de la salud mental, fundamentalmente por la falta de prioridad concedida
a este tema en el pasado. A pesar de la constante reestructuración que se ha venido
dando en los servicios de la CCSS, aún existen debilidades en el sistema de salud
como la inexistencia de políticas y de un plan de salud mental integrador de
acciones o proyectos intersectoriales de salud mental nacionales. Adicionalmente,
existe una gran necesidad de llevar a cabo investigaciones científicas para llenar
vacíos de conocimiento en esta área de la salud (Ministerio de Salud, 2002;
Ministerio de Salud, 2004).

Según, las últimas encuestas realizadas por la CCSS, en el período 1987-
2002, la proporción de consultas externas psiquiátricas respecto al total de
consultas, presentaba valores de alrededor del 4% (Ministerio de Salud, 2004). No
obstante, los trabajos estadísticos realizados hasta el momento, no incluyen un
sondeo muestral al azar de la población, lo cual constituye una interrogante en
cuanto a la verdadera incidencia de las enfermedades mentales en Costa Rica. Sin
embArgo, aunque en el país no existen estudios epidemiológicos recientes, se
estima que los trastornos mentales se han incrementado en función de las
variaciones ocurridas en el perfil demográfico y los cambios sociales, económicos y
culturales que han tenido impacto en la sociedad costarricense en los últimos
decenios. El impacto negativo de esos factores en la salud mental, se hace evidente
en situaciones que comprometen el funcionamiento social del individuo y la familia,
su equilibrio emocional y el despliegue de sus potencialidades (Ministerio de Salud,
2004).

Adicionalmente, los trastornos mentales y, particularmente, la depresión,
tienen un impacto socioeconómico muy importante, al constituir una de las primeras
causas de discapacidad y de enfermedad en el mundo (Institute of Medicine, 2001).
Los datos generados por un estudio, sobre la carga global impuesta por las
enfermedades somáticas y psicológicas, realizado por la Organización Mundial de la
Salud, el Banco Mundial y la Universidad de Harvard, revelaron que las
enfermedades mentales, incluyendo el suicidio, ocupan el segundo lugar de la cArga
global por enfermedades, en economías mundiales establecidas. Los desórdenes
16
neuropsiquiátricos constituyeron en el 2004, un 13% de la carga global por
enfermedades, una carga mayor que la producida por el Síndrome de
ImMunodeficiencia Humana (SIDA), la tuberculosis y la malaria juntas (11,4%). A
pesar de esto, las enfermedades mentales y sus efectos sobre la salud y la
productividad de un país, tienden a ser subestimados. (Banco Mundial, 2004;
Institute of Medicine, 2001).

En este contexto, le atañe al científico, la implementación de métodos que
permitan el estudio de la enfermedad de forma complementaria a los esfuerzos
realizados por diversas entidades a nivel nacional e internacional, con el objetivo
último de hallar mejores formas de diagnóstico temprano y de tratamiento, y de
contribuir al conocimiento sobre el origen y naturaleza de las enfermedades
mentales.

Las técnicas modernas para investigar el funcionamiento del cerebro, han
hecho una contribución significativa a la biología de las emociones y a la
neurofisiopatología. Dichas técnicas abarcan herramientas para el estudio
psicológico, fisiológico y bioquímico del cerebro. Algunas de las tecnologías
empleadas en mediciones psicofisiológicas son: el electroencefalograma (EEG)
(para detectar la actividad eléctrica del cerebro), potencial cerebral en relación a un
evento (ERP) (que consiste en el registro de fluctuaciones de voltaje asociadas en el
tiempo con un evento físico o mental), electromiograma (EMG, que mide la actividad
del músculo), pupilometría (medida en el cambio del tamaño de la pupila),
electrooculografía (EOG, medida del movimiento del ojo), actividad electrodermal
(EDA, medida del nivel de electricidad en la superficie de la piel), fMRI (sistema de
proyección de imágenes in vivo por resonancia magnética) y tomografía de emisión
de positrones (PET) para estudios funcionales corticales y subcorticales (Andreassi,
2000; Johansson, et al, 1999; Picton; 2000). Por otro lado, algunas de las
herramientas bioquímicas utilizadas en el estudio de compuestos neuroactivos,
actividad neuronal y relaciones espaciales de los sistema neuronales, son: la
histoquímica de hibridización in situ (por medio del uso de sondas oligonucleotídicas
para la localización de sitios de transcripción de neuropéptidos), la
imMunocitoquímica (ICC, para el mapeo celular y subcelular de neurotransmisores
aminoacídicos y neuropéptidos), radioinmunoensayos (RIA) y ensayos
imMunoenzimáticos (ELISA), (complementos de la cuantificación de neuropéptidos),
hibridización in situ cuantitativa (para la cuantificación exacta, específica y
17
reproducible de transcritos de ARNm presentes en secciones de tejido) y la
cromatografía de gases o líquida (Johansson, et al, 1999; Rayne, 1997).

Una variante de esta última técnica, es la cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC, por sus siglas en inglés), que es una herramienta de
cuantificación química de alta sensibilidad y especificidad (Cazes, et al; 2002).

Dado que el comportamiento está gobernado por regiones específicas del
cerebro y por la presencia de neurotransmisores sinápticos particulares, que se
encuentran en baja concentración (ng/ml – pg/ml), la cromatografía líquida de alta
resolución, se perfila como herramienta clave para el estudio de eventos fisiológicos
y fisiopatológicos en regiones específicas del cerebro (Wilbourn, et al; 2003;
Lingeman,H, et al; 1990).

En el país, el Programa de Investigación en Neurociencias (PIN), de la
Universidad de Costa Rica (UCR), posee un interés especial por el estudio de los
fenómenos psicofisiológicos, involucrados en la incidencia específica de la
depresión y la ansiedad. Dichos trastornos figuran en segundo y tercer lugar de
prioridad nacional dentro del conjunto de enfermedades mentales de mayor
trascendencia e interés comunitario, según el informe realizado en el 2002, por el
Ministerio de Salud (Ministerio de Salud, 2002). La fuerte relevancia que tiene el
estudio de estas enfermedades en la sociedad actual, condujo a una coordinaron de
esfuerzos con el PIN para la realización de este trabajo. La labor, se centra
primordialmente en el desarrollo de un protocolo por HPLC para la cuantificación
fiable de dos neurotransmisores, en cerebro de ratas. Eventualmente, el PIN podrá
desarrollar modelos experimentales para el estudio por HPLC, de las
concentraciones de estos dos neurotransmisores, en trastornos mentales de
depresión y ansiedad, entre otros. Algunos de los neurotransmisores, que en niveles
anormales, han sido asociados con la fisiopatología de la depresión y la ansiedad,
son: la dopamina (DA), la noradrenalina (NA), la serotonina (5-HT), el ácido gamma-
aminobutírico (GABA) y el Glutamato (Johansson, et al, 1999; Wilbourn, et al; 2003).
Sin embArgo, el laboratorio ya cuenta con los protocolos necesarios para el análisis
de DA, NA y 5-HT. Adicionalmente, se analizaron los neurotransmisores: GABA y
Glutamato, que también han sido implicados en dichos desórdenes. Sin embArgo, la
información específicamente asociada a la concentración de GABA y Glutamato en
cerebro o regiones específicas del mismo es limitada, y por tanto, es necesario que
18
estos aminoácidos sean estudiados con mayor profundidad en sujetos normales e
individuos con depresión y/o ansiedad.
Para lograr la cuantificación exitosa de estos dos neurotransmisores, es
imprescindible la correcta selección, recolección y procesamiento de la muestra.
Existen diferentes tipos de muestras que podrían ser utilizadas para las
determinaciones cuantitativas de GABA y Glutamato, como por ejemplo: Líquido
Cefalorraquídeo (LCR) obtenido por punción cervical en ratas (Huang, S; 2004;
Wang,1988); líquido extracelular cerebral obtenido por la técnica de microdiálisis,
práctica que consiste en la perfusión de regiones específicas cerebrales, con
soluciones de Ringer y en la difusión y posterior recolección de moléculas (i.e
neurotransmisores) a través de una cánula de diálisis de pequeño diámetro
(<300μm) (Rayne, 1997); y homogeneizados de cerebro, muestra obtenida de la
fragmentación del tejido cerebral total (espacios intra y extracelulares) proveniente
de regiones específicas del cerebro. El personal del PIN cuenta con un protocolo
para la extracción y homogenización de tejido cerebral de rata, por consiguiente, se
utilizaron homogeneizados de cerebro, como tipo de muestra, en esta investigación.

Finalmente, el protocolo implementado para la cuantificación de GABA y
Glutamato, fue seleccionado a partir del análisis de varios trabajos publicados en
revistas científicas calificadas. El procedimiento elegido para el análisis de dichos
neurotransmisores debía cumplir con tres condiciones principalmente: en primer
lugar, ser eficiente en la separación y cuantificación específica de GABA y
Glutamato, principalmente, en segundo lugar, ser económicamente viable y en
tercer lugar, ser compatible con el sistema de cromatografía líquida de detección
electroquímica presente en el PIN.

El protocolo desarrollado en esta investigación, podrá ser utilizado como
método de apoyo en el estudio de la depresión y la ansiedad y al mismo tiempo,
generar conocimientos científicos al respecto en beneficio del área de la salud.

OBJETIVO GENERAL

- Implementar y optimizar un método confiable de cromatografía líquida de alta
resolución con detección electroquímica, para la cuantificación de GABA y
Glutamato.


19


OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Implementar un procedimiento por Cromatografía Líquida para la cuantificación
de los neurotransmisores GABA y Glutamato, que posea los mejores resultados
(buena resolución de picos correspondientes a GABA y Glutamato; menor
tiempo total de análisis, alta sensibilidad) y que sea conveniente para el
laboratorio del Programa de Investigaciones en Neurociencias de la UCR.

- Evaluar aquellas condiciones químicas y físicas necesarias (modificación
química de la fase móvil: porcentaje de metanol y pH; flujo en mL/min,
temperatura en °C, corriente aplicada en mV.s, concentración de o-ftalaldehído y
cantidad de reactivo de derivatización más adecuada para la derivatización de
aminoácidos en un rango de concentración), tomando como base los resultados
obtenidos en estudios anteriores, así como, los fundamentos químico-físicos de
la experimentación.
















20
2. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1 Fundamentos de la Neurotransmisión

- Neuronas y neuroglia

Dentro del sistema nervioso existen dos tipos celulares: las células
neurogliales y las neuronas. Las neuronas son las células responsables de transmitir
el impulso nervioso. Todas las neuronas poseen un cuerpo celular, un axón, botones
terminales y dendritas (figura 1). El cuerpo celular contiene el núcleo, el cual
controla la actividad celular. El axón, se extiende fuera del cuerpo de la neurona y
permite la transmisión de señales a otras neuronas. Las dendritas, que son
extensiones celulares permiten la transmisión del impulso nervioso. (Stirling, 2002;
Andreassi, 2000).



Figura 1. Representación esquemática de una neurona y sus partes
Modificado de: Stirling; 2002

Las células gliales por su parte son las células encArgadas de brindar sostén
al sistema nervioso, aunque más recientemente se les han atribuido otras funciones.
Los tipos de células gliales incluyen: los oligodendrocitos, la microglia, los astrocitos
y las células de Schwann (Stirling, 2002)

- Comunicación interneuronal

La comunicación intercelular existe en los diversos tipos zoológicos y entre
los diferentes tejidos y tipos celulares (Fanjul, et al; 1998). A continuación, se
describen las características propias de las relaciones interneuronales, los subtipos
21
de comunicación existentes entre células nerviosas y los tipos de moléculas que
intervienen en este proceso.

Las células nerviosas están conectadas a través de sinapsis (“contactos”)
(figura 2). El término sinapsis fue introducido por Charles Sherrington a principios del
siglo pasado para describir la zona especializada de contacto, en la cual, una
neurona se comunica con otra. El anatomista, Ramón y Cajal, describió la sinapsis
como un sitio de comunicación interneuronal compuesto de tres elementos: una
terminal nerviosa presináptica, una terminal postsináptica y un espacio sináptico.
Además de las sinapsis que una neurona establece con otra, algunas neuronas
establecen sinapsis con células musculares o con células secretoras (Ruiz; 2005;
Nestler, et al; 2001; Haris, J, et al; 2000).
















Figura 2. Representación esquemática de una sinápsis
Modificado de: Asociación educar, 2006


Existen dos tipos de comunicación interneuronal: una de tipo eléctrica y otra
de tipo química. Las relaciones entre células neuronales en contacto directo, se dan
por medio de impulsos eléctricos. En una sinapsis eléctrica, las membranas
presináptica y post sináptica se tocan y el citoplasma de las células está
estrechamente interconectado por medio de canales iónicos especiales llamados
uniones espaciosas, formados a su vez, por subunidades proteicas llamadas
conexinas (figura 3). Estos canales, permiten el flujo de una corriente eléctrica (flujo
22
de iones), entre una célula y otra. Las uniones espaciosas presentes entre las
células neuronales proveen una vía de baja resistencia (alta conductancia) para el
paso de la corriente entre la membrana presináptica y postsináptica. Dicha corriente
deposita, a su paso, una carga positiva, lo que provoca una depolarización de la
membrana presináptica primero, y la postsináptica después. En consecuencia, el
flujo de iones a través de uniones espaciosas permite la comunicación entre una
célula y la siguiente. Análogamente, a la caída de las piezas de domino colocadas
en fila, el impulso nervioso se expande de una neurona a la siguiente, con la
diferencia de que una vez que ha pasado por ellas, las neuronas vuelven a su
estado de reposo inicial, “a la espera” de un nuevo impulso nervioso (Matthews,G;
2000; Kandel, et al; 2000; Stirling; 2002).
















Figura 3. Representación esquemática de las uniones espaciosas.
Modificado de: Aidley, D,1998

Por otra parte, la sinapsis química, consiste en el paso de información, a
través de pequeñas moléculas que actúan como mensajeros químicos. Dichos
“mensajeros” químicos son llamados neurotransmisores (Fanjul, et al; 1998).

En las sinapsis químicas, la llegada de impulsos (también llamados
potenciales de acción), producen la liberación de transmisores al espacio sináptico,
los cuales, son reconocidos por receptores específicos ubicados en la membrana
postsináptica (Fanjul, et al; 1998).


Conexinas
Canales de iones
23
El orden de eventos ocurridos en una sinapsis química es el siguiente:

a. Ocurre un cambio en el potencial presináptico
b. Se da una depolarización de la terminal sináptica
c. Se liberan los neurotransmisores
d. Los neurotransmisores se unen a receptores especiales en la célula
postsináptica
e. Ocurre un cambio en la permeabilidad iónica de la célula postsináptica
f. Se da un cambio en el potencial de membrana de la célula postsináptica

Los potenciales de acción que llegan a la terminal de una neurona
presináptica, inducen la liberación de neurotransmisores al espacio sináptico (figura
4). El espacio sináptico contiene líquido extracelular, el cual, a su vez, contiene
iones y enzimas disueltos en agua. Los neurotransmisores que serán liberados al
espacio sináptico se encuentran almacenados en pequeñas vesículas llamadas
vesículas sinápticas. Una vez en el espacio extracelular, los neurotransmisores se
dirigen hacia receptores sinápticos particulares en la membrana postsináptica.
Cuando los neurotransmisores alcanzan sus receptores correspondientes en la
membrana postsináptica, se abren canales transmembranales que permiten el flujo
de iones al interior de la célula postsináptica (figura 5), produciendo un efecto
específico: excitatorio o inhibitorio, dependiendo de la selectividad iónica del canal
postsináptico. Finalmente, la acción de un neurotransmisor es detenida por la acción
de las enzimas presentes en el espacio sináptico (por ejemplo: la
monoaminooxidasa) o bien mediante un proceso de recaptación de transmisores por
la célula presináptica (Stirling; 2002; Fanjul, et al; 1998; Ruiz; 2005).

Las sinapsis químicas y eléctricas mantienen diferencias funcionales
importantes, que deben ser consideradas. Por una parte, la sinapsis eléctrica se
utiliza en depolarizaciones simples de la membrana y no para acciones inhibitorias o
cambios de larga durabilidad en terminales postsinápticas. De forma contraria, las
sinapsis químicas pueden transmitir señales de intensidad y tiempo variable, tanto
de tipo excitatorio como inhibitorio y por tanto, pueden producir comportamientos
más complejos. Más aún, parece existir una relación entre el nivel de
neurotransmisores y los estados de concentración, una mejor o peor memoria, la
ansiedad y la depresión, entre otros. Además, se ha demostrado que manipulando
los niveles de neurotransmisores mediante el uso de ciertas drogas pueden
modificarse el humor, las emociones y las facultades cognitivas ( Ruiz; 2005).
24

Figura 4. Sinapsis química: liberación de neurotransmisores.
Modificado de: Stirling, 2002


Figura 5. Flujo de iones a través de un canal abierto en la membrana de una neurona
postsináptica. Modificado de: Matthews; 2003.
25
2.2 Neurotransmisores

“Los neurotransmisores son sustancias químicas que se encuentran
en el sistema nervioso y guían la transmisión de los impulsos entre las neuronas a
través de las sinapsis” (Nemiah, 1996). Se han establecido ocho criterios para
determinar si un compuesto es un verdadero neurotransmisor (Nemiah, 1996).
Dichos criterios se exponen en el cuadro 1.

Cuadro 1. Ocho criterios para determinar si un compuesto neuroregulatorio es
un verdadero neurotransmisor

a. La sustancia debe estar presente en neuronas presinápticas, usualmente
en una distribución desigual a través del cerebro.
b. Los presursores de neurotransmisores y las enzimas sintéticas deben
estar presentes en la neurona, usualmente próximas al sitio de acción.
c. La estimulación de sitios aferentes (terminales presinápticas) deben
provocar la liberación de la sustancia en cantidades fisiológicamente
significativas.
d. Los receptores específicos que interacúan con la sustancia deben
encontrase próximos a las neuronas presinápticas.
e. La interacción de la sustancia con sus receptores debe inducir cambios en
la permeabilidad de la membrana postsináptica provocando un potencial
inhibitorio o excitatorio postsináptico en la célula postsináptica.
f. Deben existir mecanismos específicos de inactivación que detengan la
interacción de la sustancia con su receptor en un rango de tiempo
fisiológico razonable.
g. Las intervenciones de drogas de tipo agonista en sitios postsinápticos
deben imitar la acción de la sustancia y los antagonistas deben bloquear
su efecto.

Fuente: Brown ,R;1994

Existen varias categorías de neurotransmisores que incluyen:
neurotransmisores aminoacídicos como ácido γ-aminobutírico (GABA) y Glutamato;
aminas biogénicas como la dopamina y la norepinefrina; péptidos; gases como el
óxido nítrico y nucleósidos como adenosina (Stirling,2002). Algunos
neurotransmisores promueven un efecto exclusivamente excitatorio como el
Glutamato, o inhibitorio, como el GABA. Otros neurotransmisores, pueden ser
inhibitorios en ciertas sinapsis o excitatorios en otras. La versatilidad con la que un
26
transmisor induce respuestas de carácter opuesto, se basa en que ciertas moléculas
neurotransmisoras pueden unirse a receptores distintos. Por ejemplo, la acetilcolina
(Ach), posee una influencia excitatoria en los receptores llamados Ach nicotínicos y
una influencia inversa en otro tipo de receptores llamados: Ach muscarínicos
(Stirling,2002). En el cuadro 2 se mencionan algunos de los neurotransmisores más
importantes del sistema nervioso, su clasificación y estructura química.

Cuadro 2. Categorías de Neurotransmisores y sus estructuras
Categoría Neurotransmisor Estructura

A.Transmisores
aminoacídicos




- Inhibitorios:
GABA
Glycina
- Excitatorios:
Glutamato
Aspartato
B.Monoaminas
- Catecolaminas:
Norepinefrina

Dopamina

Epinefrina



- Indolaminas

Serotonina

C.Neurotransmisores
colinérgicos
Acetilcolina

D. Neuropéptidos
Sustancia P
Met- encefalina (endorfina)

F. Nucleósidos Adenosina

27
G.Gases Oxido Nítrico
•N=O
Fuente: Arslan, 2001; Nestler, et, al; 2001.
2.3 Glutamato y GABA

- El Glutamato

El Glutamato, es el neurotransmisor excitatorio por excelencia de la corteza
cerebral humana y está involucrado en forma crítica con el aprendizaje y la
memoria, así como con la percepción y el desempeño (Golan, 2004; Kasper, et al;
2003). Nuevas evidencias sugieren que el Glutamato contribuye con la “fijación” de
memorias traumáticas. Por lo tanto, podría estar involucrado con desórdenes de
ansiedad como el estrés post-traumático. Asimismo, éste se ha asociado con el
aprendizaje del comportamiento evasivo presente en ataques de pánico y en
desórdenes de ansiedad social. Una de las teorías de la ansiedad propuestas,
apunta a que en el aprendizaje de la ansiedad, el Glutamato cumple una función
mediadora. Adicionalmente, varios autores sugieren, que el simple aumento de las
concentraciones de Glutamato puede provocar ansiedad (Kasper, et al; 2003).

Por otra parte, el Glutamato cumple junto con la neurotransmisión, otra
funciones biológicas: es un precursor del GABA; es un componente intermediario del
metabolismo; forma parte de proteínas y es además, un substrato enérgético (Bak;
et, al; 2006).

Se ha demostrado, que el Glutamato puede ser neurotóxico bajo ciertas
condiciones de concentración y tiempo de exposición celular. Por ejemplo, si una
vez que el Glutamato ha sido liberado al espacio sináptico, no es recaptado
nuevamente o degradado, y permanece en el espacio extracelular por un tiempo
prolongado, puede resultar neurotóxico (Bak, et, al; 2006).

Se estima que la concentración normal de Glutamato en cerebro es de 10mM
intracelularmente, y de 2-5μm extracelularmente. Más específicamente, se estima
que la concentración de Glutamato en las vesículas sinápticas puede alcanzar un
rango de 60-210mM y en el momento en el que se propaga el impulso nervioso, se
pueden liberar en cada sinapsis, entre 2000 y 5000 moléculas de Glutamato. Con la
activación de la sinapsis, el espacio sináptico puede alcanzar concentraciones de 1-
5 mM de Glutamato. Las moléculas de Glutamato pueden recorrer por difusión, una
28
distancia de 0.5 a 1 μm para poder activar los receptores Glutamatérgicos
correspondientes en la membrana postsináptica (Bak, et, al; 2006).
Los receptores de Glutamato pueden dividirse en dos tipos: ionotrópicos y
metabotrópicos. Los primeros corresponden a canales iónicos específicos para
cationes y según el tipo de molécula que los active (agonista), se clasifican en
receptores MMDA (N-metil-D-aspartato), AMPA (α-amino-3.hidroxi-5-metil-4-
isoxasolpropionato) y kainato. Los receptores AMPA median la actividad excitatoria
rápida y son permeables al ión sodio (Na
+
), principalmente, aunque también
permiten el paso del ión Ca
2+
, dependiendo de las subunidades proteicas que lo
conformen. La actividad de los receptores MMDA es dependiente de la activación de
AMPA, debido a que los receptores MMDA son bloqueados fisiológicamente por el
ion Magnesio (Mg
2+
). Al ser activados los receptores AMPA, el Mg
2+
que bloquea el
poro del receptor MMDA se libera, por depolarización membranal, permitiendo al
Glutamato y a la glicina (otro neurotransmisor), activar al receptor MMDA. Este
mecanismo, finalmente induce la entrada de iones Na
+
y Ca
2+
dentro del receptor
MMDA y por lo tanto, la excitación de la neurona. Por último, los receptores de
kainato no son bien conocidos aún, por lo que su papel fisiológico en la transmisión
sináptica debe ser estudiado (Conn, 1994; García, et al; 2004; Bak, et al; 2006;
Siegel et al; 1994;).

Como fue mencionado anteriormente, otro tipo de receptores de Glutamato,
son los receptores metabotrópicos. Los receptores metabotrópicos se encuentran
acoplados a proteínas G, las cuales, permiten el acoplamiento del receptor a
enzimas citoplásmicas (figura 6). Estos receptores inducen en distintos tipos
celulares el aumento de los niveles de calcio intracelular por medio de la hidrólisis
de moléculas de fosfatidilinositol, lo que implica otro mecanismo de transducción de
señal, en el cual, se desencadenan cascadas metabólicas complejas cuyo resultado
es la activación de la función celular. Para una idea más clara, el mecanismo de
activación de los receptores metabotrópicos y por ende de cascadas metabólicas
intracelulares se genera de la siguiente forma (figura 7): la unión de un agonista al
receptor produce la activación de una fosfodiesterasa (fosfolipasa C o PLC), la cual,
cataliza la hidrólisis de fosfatidilinositoles de membrana. El primer producto de la
reacción es el fosfatidilinositol-4,5 bis fosfato (PIP
2
), el cual también es hidrolizado
enzimáticamente, produciendo inositol 1,4,5 trifosfato (IP
3
) y diacil glicerol (DAG).
Dichos productos actúan como mensajeros secundarios, intracelularmente. Por un
lado, IP
3
libera calcio de almacenes celulares, lo que incrementa los niveles de Ca
2+

intracelular. Los iones de Ca
2+
interactúan a su vez con una gran variedad de
29
blancos celulares (quinasas, fosfatasas, canales iónicos, otros). DAG por su parte,
reduce el requerimiento de calcio de una enzima dependiente de Ca
2+
, llamada
quinasa C (PKC ), lo que consecuentemente aumenta su actividad. La activación de
receptores metabotrópicos resulta también en la activación de otros mensajeros
secundarios como el ácido araquidónico, el cual, influye en la producción de
leucotrienos y prostanglandinas (relacionados con la comunicación celular y
actividad hormonal); y en la activación de guanilil ciclasa y adenilil ciclasa,
importantes en la producción de GMP cíclico y AMP cíclico respectivamente (figura
7). Entre otras cosas, el papel que desempeñan los receptores metabotrópicos, en
el momento en el que se genera el impulso nervioso, es la modulación del
comportamiento eléctrico neuronal. Lo último, se debe a que los canales iónicos,
son uno de los sustratos de los mensajeros intracelulares generados a partir de la
activación de los receptores metabotrópicos (figura 6). Al mismo tiempo, parece que
los receptores metabotrópicos son capaces de influenciar la transmisión sináptica
tanto en el sitio presináptico como en el postsináptico. Existen al menos siete
subtipos de receptores metabotrópicos (mGluR I,II,III,etc), clasificados y agrupados
según su homología de secuencia, farmacología y acoplamiento a mecanismos de
señalización intracelular (Conn, 1994; García, et al; 2004; Bak, et al; 2006; Siegel et
al; 1994;).











Figura 6. Diagrama de uno de los mecanismos de acción por mensajeros secundarios
mediados por proteína G. El neurotransmisor se une a su receptor de membrana generando
la activación de la proteína G, la cual, a su vez produce la activación de enzimas que
generan mensajeros secundarios intracelulares. Estos últimos inducen la apertura de
canales iónicos, cuyo resultado final es el potencial postsináptico.
Modificado de: Nestler, 2001.

30


Figura 7. Modelo más complejo de la activación de cascadas celulares por medio de
receptores metabotrópicos. La vía de la hidrólisis de fosfatidilinositoles de membrana, se
ilustra al lado derecho de la figura. A la izquierda y al centro, se ilustran otras vías de
activación de mensajeros secundarios involucrados en la activación de canales iónicos.
VOCC: canales de calcio operados por voltaje; iGluR: receptores ionotrópicos de Glutamato
(i.e MMDA); CaMKII: proteína quinasa C II, dependiende de calcio/calmodulina; cAMP: AMP
cíclico; AC: Adenilil ciclasa; PKA: proteína quinasa A; PLC: Fosfolipasa C; PI: fosfatidil
inositol; IP3: inositol 1,4,5 trifosfato (IP
3
) DAG: diacil glicerol. La figura muestra otros
procesos involucrados: la transcripción de ADN y la plasticidad neuronal. Fuente: Herman, et
al; 2002.








31
- El ácido gamma aminobutírico (GABA)

El estudio de este neurotransmisor, en el sistema nervioso de crustáceos
permitió el descubrimiento de su naturaleza inhibitoria (Iversen, 2004). Como se
menciona anteriormente, el GABA es usado por la gran mayoría de interneuronas
(conexiones neuronales) del SNC, como neurotransmisor de tipo inhibitorio. Algunos
estudios sugieren que el GABA está involucrado, aproximadamente, en un cuarto de
todas las sinapsis que se dan en el cortex cerebral (Shulman,R; 2004). Otros
autores sugieren que el GABA constituye al menos un 40% de todas las sinapsis
(Tanaka, et al; 1996).

La evidencia definitiva de que el GABA era un neurotransmisor surgió hace
30 años, gracias al trabajo de Krnjevic y colegas (1966), quienes observaron que
esta sustancia formaba parte de la sinapsis inhibitoria en cortex de mamíferos, y
mediaba un aumento de la conductancia de la membrana, al paso de iones Cl
-
(pueden ser también iones HCO
3
-
) (Tanaka, et al; 1996; Alger, et al; 2001).

El paso de iones Cl
-
es un evento importante en la prevención del inicio de un
potencial de acción. Este flujo de iones Cl
-
hacia el interior de la célula constituye
una vía rápida de hiperpolarización de la célula, a lo que también se le llama
“corriente rápida postsináptica inhibitoria”. Lo anterior lleva a la célula a un potencial
lejos del rango de activación sináptica dependiente de corriente, como por ejemplo,
lejos de aquel mediado por receptores Glutamatérgicos MMDA que permiten la
entrada de Na
+
(Alger, et al; 2001).

Adicionalmente, se sugiere que el GABA tiene una acción inhibitoria sobre
otros sistemas de neurotransmisores como dopamina y norepinefrina (Kasper et al;
2003).
Se estima que la concentración normal de GABA en cerebro es de 2-5μmol/g
de tejido fresco. Además, se sugiere, que la concentración de GABA en cierto tipo
de células cerebelares llamadas células de Purkinge, puede alcanzar
concentraciones de 50 a 100mM. Por otro lado, la concentración de GABA en el
líquido intersticial se mantiene a niveles muy bajos (<1μM) (Kasper et al; 2003).

A nivel fisiopatológico, la obtención de datos clínicos y farmacológicos
sugieren que el GABA se encuentra alterado durante desórdenes afectivos como la
depresión y la ansiedad. Varios investigadores han reportado concentraciones
32
considerablemente bajas de GABA en pacientes con depresión a diferencia de
grupos control de pacientes no depresivos (Golan, 2004; Hayward, 2003; Kasper et
al, 2003). Recientemente, se demostró que los niveles de GABA en el lóbulo
occipital de pacientes depresivos presentan un decrecimiento de hasta un 52%.
(Kasper, et al; 2003).

Además, se ha propuesto que los efectos del GABA en la depresión y la
ansiedad podrían no influir en forma directa, sino como resultado de la mediación de
otros sistemas de neurotransmisión serotoninérgicos y noradrenérgicos (Hayward,
2003).

Respecto a los tipos de receptores de GABA, al igual que los receptores
Glutamatérgicos, se subdividen en dos grupos: ionotrópicos (GABA
A
) y
metabotrópicos (GABA
B
). Se ha sugerido una tercera división de receptores
GABAnérgicos: los receptores GABA
C
(Tanaka, et al; 1996).

El tipo de Receptor GABA
A
pertenece a la familia de receptores de canales
iónicos rápidos. El receptor está constituido por una estructura pentamérica, en la
cual, las proteínas se distribuyen alrededor de un poro central, a través del cual, los
iones de Cl
-
fluyen de manera selectiva (figura 8). La composición y disposición
proteica de este tipo de receptor puede variar, por lo que la familia de receptores
GABA
A
, presenta una alta heterogeneidad (Tanaka, 1996).

Por otra parte, los receptores GABA
B,
pertenecen también a una familia de
alta heterogeneidad. Este tipo de receptor se caracteriza por mediar eventos
postsinápticos lentos, caracterizados por un aumento de conductancia de iones
potasio (K
+
) y una supresión de conductancia de iones Ca
2+
en las terminales
nerviosas (Tanaka, 1996).

Los receptores de GABA han sido importantes sitios blanco para la acción de
ciertos medicamentos. En especial, los receptores GABA
A
,

han demostrado tener
sitios afines a medicamentos como las benzodiazepinas (de acción sedante y
músculo-relajante), lo cual, permite manipular la respuesta bioquímica de los
receptores y modificar la respuesta a GABA (Doble, A, et al; 2004).




33



































Figura 8. Acción del neurotransmisor GABA y sus agonistas (las benzodiazepinas), en la
apertura del canal de Cl
-
de su receptor GABA
A
.
Fuente: Rusmidlernes biologi, 2000


34
- Ciclo GABA/Glutamato- Glutamina

Las células neuronales no son capaces de sintetizar GABA o Glutamato de
novo a partir de la Glucosa. Por ello, dependen de células especiales de sostén
llamadas astrocitos. Estas últimas, permiten el mantenimiento de las reservas de
estos dos neurotransmisores en el cerebro. Se ha descrito un mecanismo de
producción y recaptación de GABA y Glutamato llamado ciclo GABA/Glutamato-
Glutamina. Dicho mecanismo, involucra las terminales sinápticas de neuronas
Glutamatérgicas y GABAérgicas y astrocitos circundantes.

Así, en la sinapsis Glutamatérgica, el Glutamato es tomado por los astrocitos
donde es amidado (con amonio libre, NH4
+
), y convertido en Glutamina por la
enzima Glutamina sintetasa. En las neuronas, la enzima Glutaminasa dependiente
de ATP (PAG), genera nuevamente Glutamato a partir de la Glutamina, liberando
amonio (figura 9a) (Bak,L;2006; Schulman,R et al; 2004).

Por otra parte, en la sinapsis GABAérgica, el neurotransmisor GABA es
tomado en la terminal presináptica o bien, captado por los astrocitos circundantes.
En los astrocitos, el GABA es metabolizado en dos pasos a succinato, el cual, es
posteriormente metabolizado en α-ketoGlutarato (α-KG). Este último compuesto, es
a su vez transformado en Glutamato. En la neurona, el GABA es sintetizado de
nuevo, a partir de Glutamato, por medio de la enzima Glutamato descarboxilasa
(GAD). (figura 9b) (Bak,L;2006; Schulman,R et al; 2004).

Adicionalmente, se sugiere que la Glutamina podría ser sintetizada a partir
de succinato vía el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (Bak,L;2006; Schulman,R et al;
2004).










35





Figura 9. Diagrama del ciclo GABA/Glutamato-Glutamina y localización específica de las
enzimas involucradas. En la figura a se muestra el ciclo Glutamato-Glutamina en una
sinapsis Glutamatérgica. La figura b muestra el ciclo GABA-Glutamina en una sinapsis
GABAérgica. Abreviaturas: GAD:Glutamato descarboxilasa; GABA: ácido gamma
aminobutírico; Gln: Glutamina; Glu: Glutamato GS: Glutamina sintetasa; α-KG: α-
cetoGlutarato; PAG: Glutaminasa dependiente de ATP; Suc:succinato; TCA: ciclo de los
ácidos tricarboxílicos.
Fuente: Bak, et al; 2006
36

2.4 Sistema Límbico

En 1937, James Papez introdujo el concepto de sistema límbico definiéndolo
como el circuito que constituía el mecanismo neural de las emociones. Según
Papez, este circuito consistía de cuatro regiones en el cerebro: hipocampo,
hipotálamo, giro cingulado y tálamo anterior. Años más tarde, Mac Lean (1949),
vinculó el circuito de las emociones con el hipocampo, la amígdala, el septum y el
córtex cingulado. Las contribuciones que realizó, Mac Lean diferían del modelo
original del sistema límbico según Papez, en cuanto a una menor relevancia del rol
del giro cingulado y una mayor relevancia del rol que cumplían el hipocampo y la
amígdala. Esto condujo a un renombramiento del modelo: Sistema Límbico de
Papez y Mac Lean (figura 10). Actualmente, el concepto de sistema límbico ha
evolucionado. Hoy en día se sabe que este circuito no solo se relaciona con el
desarrollo de emociones sino también con la percepción, la memoria y algunos tipos
de comportamiento. Livingston, describió el sistema límbico como un continuo que
vincula el cerebro, a la mente y al comportamiento. En términos, del estudio de la
ansiedad y la depresión dicho circuito cobra importancia en el sentido de que las
estructuras mencionadas, conforman blancos potenciales para el estudio de dichas
patologías (Puri, B; 1998).

Figura 10. Modelo del sistema límbico según Papez y Mac Lean.
Fuente: Eysenck, et al; 2004





37

2.5 Miedo y estrés

El miedo consiste en una serie de estados motivacionales y emocionales que
promueven la organización de respuestas específicas ante situaciones de peligro,
permitiendo la resolución de problemas y la adaptación a situaciones amenazantes.
El estrés por su parte, es definido como “una respuesta no específica del cuerpo
ante cualquier demanda”. (Eysenck, 2004).En este sentido, el cerebro es el
“intérprete” de lo que es un estresor y coordina las respuestas fisiológicas y de
comportamiento necesarias previas, durante y posteriores a dicho evento
(Panksepp, 2003; Schulkin; 2004; Shumake,J; 2003).

En estudios psicológicos, bioquímicos y fisiológicos recientes, en humanos y
animales de laboratorio, se señala al miedo y al estrés como detonantes potenciales
desórdenes afectivos tales como la depresión y la ansiedad (Nutt; 2004; Shumake,
et al; 2003).

Existe un concenso en cuanto a que estos desórdenes afectivos, son el
resultado de la interacción entre factores ambientales y genéticos, y que además
podrían estar modulados por factores desencadenantes como el estrés (Wilbourn, et
al; 2003; Miller, et al; 2005; Shumake,2003). Sin embargo, es necesario aclarar que
la condición de estrés per sé, podría no ser suficiente para causar depresión. Por
ejemplo, la mayoría de las personas no desarrollan un cuadro clínico depresivo, por
el solo hecho de padecer estrés crónico (Shumake,J; 2003).

Por otra parte, la interacción ambiente-genética del individuo podría
influenciar la modelación y remodelación de las vías que involucran el
condicionamiento al miedo ante situaciones específicas (Miller, et al; 2005). Se ha
propuesto que los mecanismos subyacentes a la depresión y la ansiedad, podrían
compartir con el miedo condicionado y no condicionado, algunas rutas metabólicas
(Gorman et al, 2004; Rosen; 2004). Por otro lado, se sugiere también que la
depresión y la ansiedad son posiblemente mecanismos sobreexpresados o de
retroalimentación sostenida del miedo (Shulkin; 2004). Es decir, que las personas
que sufren de ansiedad patológica o depresión, podrían responder en forma
inapropiada ante estímulos moderados de amenaza inclusive cuando ésta no es
inminente (Schulkin, 2004).

38
2.6 Depresión y Ansiedad

La depresión y la ansiedad, son trastornos emocionales que pueden
presentarse simultáneamente o no en un individuo. Su etiología se halla en la
incidencia conjunta de factores genéticos, evolutivos, hormonales, físicos y
psicológicos. Por lo tanto, estos trastornos, de índole multifactorial, podrían ser
abordados desde diferentes disciplinas a fin de explicar su ocurrencia. En el
presente trabajo, se hace particular énfasis en los factores físicos y psicológicos
involucrados en estos dos trastornos (Stein, et al; 2002).

- Depresión - Definición y sintomatología

Históricamente, la depresión fue bien caracterizada por pensadores y
filósofos griegos como Hipócrates y Galeno. La persona depresiva fue descrita como
sombría y pesimista, tendiente a esconderse y a padecer de insomnio, irritable y
malhumorada (Gilbert,1992).

Actualmente, la depresión ha sido descrita como un desorden afectivo, en el
cual, ocurre una disminución del estado de ánimo, que inhabilita a la persona a
sentir placer y que crea sentimientos de desesperanza y una pérdida en el interés
por las actividades diarias (Wilbourn, et al; 2003).

Otros síntomas asociados con la depresión son la pérdida de la confianza y
la autoestima, sentimientos injustificados de culpa, ideas de muerte y suicidio,
menor capacidad de concentración y la aparición de trastornos del sueño y la
alimentación. (Ministerio de Salud, 2002). Además, la depresión puede presentar un
traslape con manifestaciones somáticas como dolores de cabeza, de espalda y
problemas genitourinarios (Institute of medicine, 2001).

Esta enfermedad puede aparecer en cualquier momento de la vida aunque la
incidencia es mucho mayor en la madurez. En Costa Rica, la depresión afecta a
más mujeres que hombres. Tiene una incidencia de 3,2% en las mujeres y un 1,9%
en los hombres. La depresión puede ser aguda o crónica, leve, moderada o grave y
es responsable del 4.4% del total de años de vida perdidos, índice que se estima irá
en aumento en los próximos años. Como se cita en el análisis sectorial de salud
presentado por el Ministerio de Salud (2002), expertos a nivel mundial estiman que
39
en menos de 10 años la depresión se convertirá en la principal enfermedad mundial
(Ministerio de Salud, 2002).

- Tipos de depresión

La depresión puede tomar varias formas, dependiendo del tipo de
sintomatología e intensidad. Por una parte, se encuentra la depresión unipolar, que
es aquella en la que el trastorno afectivo se caracteriza por sentimientos de tristeza
o pérdida únicamente. Caso contrario de los desórdenes afectivos bipolares, en
donde la depresión alterna con estados de hiperactividad o de extrema manía (ver
figura 11) (Wilbourn, et al; 2003; Peacock;2000).


Figura 11. Tomografía de emisión de positrones de una persona con desorden bipolar. La
imagen muestra una alternancia entre estados depresivos y de mania, en un curso de 10
días. Los colores azul y verde indican niveles bajos de actividad cerebral, mientras que los
colores rojo, anaranjado y amarillo indican altos niveles de actividad. Fuente: Phelps, sin
fecha.

Durante los episodios de manía, las personas se encuentran llenas de
energía, descansadas y entusiasmadas. Pueden ser inclusive irritables. Durante los
episodios depresivos tienen constantes sentimientos de tristeza y desesperanza
(Peacock; 2000, Wilbourn, et al; 2003).

Otra modalidad de la depresión, es la distimia, que es una enfermedad de
índole depresivo más leve, pero de sintomatología frecuente. En algunos pacientes
40
puede presentarse por períodos de tiempo considerables, inclusive años. Esta
enfermedad es más frecuente en mujeres que en hombres. Pese a la levedad de
sus síntomas, la distimia, puede verse traslapada con episodios depresivos graves
(Wilbourn,et al; 2003).

Otro de los trastornos depresivos descritos, es el desorden afectivo
estacional, el cual parece estar directamente relacionado con la cantidad de luz
percibida durante el año. Un cierto número de personas, en latitudes nórdicas, han
observado que su estado de ánimo es afectado adversamente durante los meses de
invierno, cuando las lArgas horas del día se acompañan con niveles bajos de luz
(Wilbourn, et al; 2003).

- Fisiopatología de la depresión

Áreas cerebrales involucradas:

A nivel físico, la depresión puede generar cambios fisiológicos importantes.
La tomografía de emisión de positrones, es una herramienta que ha permitido a los
neurólogos descubrir los cambios fisiológicos producidos, a nivel cerebral, en
personas con trastornos depresivos. Algunos de estos cambios incluyen una
reducción del flujo sanguíneo y una reducida actividad en la corteza temporal-frontal
y en el núcleo caudado (figura 12) (Wilbourn, et al; 2003).

También se ha sugerido que el hipocampo es una estructura cerebral
importante en la fisiopatología de la depresión porque podría ser mediador en los
déficits cognitivos y en la hipercortisolemia encontrada en este desorden (Fujita, et
al, 2000). Adicionalmente, se ha sugerido que durante episodios de estrés se
reduce la tasa neurogénica en el giro dentado, lo cual, aumenta la probabilidad de
padecer depresión (Jacobs, et al; 2000). Aunado a esto parece haber una
disminución de la unión de serotonina a receptores ubicados en el lóbulo temporal
medial y otras regiones neocorticales (Fujita, et al; 2000). Finalmente, se han
propuesto otras áreas que podrían estar afectadas durante la depresión como: el
cortex cingulado anterior, la amígdala, el cerebelo y los núcleos basales (figura 12)
(Wilbourn, et al; 2003).

41

Figura 12. Posibles áreas cerebrales afectadas en episodios depresivos unipolares y
bipolares. Modificado de: Wilbourn,et al; 2003.

- Aspectos Bioquímicos de la depresión

Los estados de ánimo se encuentran gobernados por neurotransmisores
específicos. Recientes estudios sobre la relación entre neurotransmisores y
depresión permitió a un grupo de científicos proponer la hipótesis sobre aminas
biogénicas. Ésta última, establece como causa de la depresión, el agotamiento de
los neurotransmisores: noradrenalina, dopamina y serotonina en las sinapsis del
sistema nervioso central. Esto es respaldado por investigaciones donde se han
encontrado niveles alterados de noradrenalina, su metabolito 3-metoxi-4-hidroxi-
fenilglicol (MHPG) y dopamina, en orina y líquido cefalorraquídeo (LCR) de
pacientes depresivos. Del mismo modo, se ha encontrado una insuficiencia de ácido
5-hidroxiindolacético (5-HIAA), un metabolito de la serotonina, en el LCR de
pacientes con tendencias suicidas. Aunque la hipótesis de aminas biogénicas
continúa siendo válida, evidencias recientes señalan la influencia de otros
neurotransmisores en los trastornos depresivos. Por ejemplo, algunos pacientes con
episodios graves depresivos han demostrado tener niveles anormales de ácido
gamma amino butírico (GABA). Adicionalmente, nuevas hipótesis sugieren que los
desbalances en el sistema colinérgico, podrían generar episodios depresivos,
especialmente cuando los niveles de acetilcolina se encuentran elevados y fuera de
balance junto con otros neurotransmisores (Wilbourn, et al; 2003) (ver figura 13).
42



Figura 13 . Propuesta del balance bioquímico en personas sanas y en personas con
depresión. Modificado de: Wilbourn, et al; 2003

Adicionalmente, la depresión produce una respuesta de estrés, por lo que las
hormonas de estrés crónico (hormona adrenocorticotrópica y cortisol) tienden a
estar elevadas (Wilbourn, et al; 2003). Igualmente, Meijer, at al (1998), indica que la
depresión es una condición combinada de hipercortisismo (alta producción de
hormonas esteroideas, como el cortisol) y una aparente hipoactividad de la
transmisión serotonérgica, como se indicó anteriormente.
(Meijer,et al; 1998; Stockmeier,1997).

Por otro lado, nuevas evidencias sugieren que la hipersecreción de
Glucocorticoides (como el cortisol) y citoquinas proinflamatorias (moléculas
mediadoras de la comunicación intercelular y el sistema imMunológico) resulta en un
mal funcionamiento de la neurotransmisión noradrenérgica y serotonérgica en el
cerebro de personas con depresión (Leonard,2001).


- Ansiedad

Definición y sintomatología

La ansiedad forma parte de la vida cotidiana. Sin embArgo, la ansiedad, al
igual que la depresión puede ser una emoción normal o un trastorno psiquiátrico.
Mientras que niveles bajos de ansiedad pueden ser positivos, grados moderados o
altos de ansiedad pueden prevalecer en forma de una intensa angustia (Pary,R, et
al, 2003; Emilien, G, et al, 2002).
43

Una cierta cantidad de ansiedad, puede mejorar el desempeño de una
persona en su vida diaria, ayudarla a adaptarse, e inclusive, lidiar con el estrés.
Cuando la ansiedad, se presenta en forma leve, agudiza los sentidos y expande el
campo de percepción, lo que permite adquirir destrezas durante el aprendizaje y en
situaciones que requieren la resolución de problemas. No obstante, existen
personas que experimentan altos niveles de ansiedad más allá de los niveles
normales, ya sea como una reacción anormal a situaciones normales o como
reacción normal a situaciones anormales. Las personas con ansiedad patológica,
pierden la capacidad de funcionar en forma normal, tanto socialmente como
profesionalmente y experimentan un deterioro en su percepción: los sentidos de la
vista, el oído, el tacto, el gusto y el olfato se entorpecen y la capacidad de pensar se
ve afectada. Durante niveles altos de ansiedad, el campo de percepción de una
persona disminuye, limitándose a un solo detalle y el procesamiento de nueva
información se ve comprometido. En casos más severos, como por ejemplo, durante
ataques de pánico, la persona se vuelve incapaz de interpretar estímulos externos
(Pary,R, et al, 2003; Emilien, G, et al, 2002).


Los trastornos de ansiedad están caracterizados por una combinación de
varios síntomas: excesiva ansiedad, desasosiego, tensión, aprensión, preocupación,
evasión y rituales compulsivos. Existen algunos criterios para diferenciar la ansiedad
patológica de la ansiedad normal:

1. Cuando se presenta con mayor intensidad y/o duración de lo esperado
usualmente. Para ello es importante considerar el contexto familiar, social y
cultural, así como su comportamiento y expectativas.
2. Cuando conlleva a una incapacidad en la interacción social, ocupacional o
interpersonal.
3. Cuando las actividades diarias se ven interrumpidas a causa de la evasión
de situaciones u objetos, en un intento por disminuir el nivel de ansiedad.
4. Cuando se presentan síntomas físicos significativos y/o obsesiones,
compulsividad y memorias de traumas. (Estos síntomas son muy comunes
en personas que no padecen de trastornos de ansiedad) (Pary,R, et al, 2003;
Emilien, G, et al, 2002).

44
Las estadísticas mundiales acerca de la incidencia de la ansiedad, varían
ampliamente según los criterios aplicados para su diagnóstico, pero en general la
frecuencia es elevada. En Costa Rica, según estudios de Recursos Humanos de la
CCSS, los trastornos de ansiedad ocuparon el quinto lugar como causa de
incapacidad laboral entre empleados de la institución. Adicionalmente, un estudio
llevado a cabo hace más de diez años, por Adis Castro, en el cantón de
Desamparados, reveló en la población estudiada una prevalencia de 26,7% de
sintomatología ansiosa. Sin embArgo, no existen estudios epidemiológicos actuales
de la incidencia o prevalencia de la ansiedad en la población costarricense
(Ministerio de Salud, 2004).

No obstante, en estudios llevados a cabo dentro de los Estados Unidos, se
estimó que 25% de los adultos, sufrirán en algún punto de sus vidas, una de las seis
formas de ansiedad descritas: desorden de pánico, que consiste en ataques
impredecibles y rápidos de intensa ansiedad; desorden de ansiedad generalizada,
caracterizado por una preocupación excesiva en múltiples áreas; desorden de
ansiedad social, caracterizado por miedo y evasión de situaciones sociales; fobias
específicas, notables por un intenso temor a detonantes específicos; desorden de
estrés postraumático, causado por el recuerdo de memorias traumáticas; y desorden
de obsesividad-compulsividad, caracterizado por comportamientos obsesivos-
compulsivos como un intento de la persona que lo padece por “reducir la ansiedad”.
(Gordon, 2004).

Es importante resaltar que la ansiedad y la depresión son enfermedades que
pueden presentarse simultáneamente. Muy frecuentemente, ambas enfermedades
coexisten, de forma que se da un traslape de síntomas entre ambas condiciones,
que pueden dirigir a confusiones en el diagnóstico. En estudios, realizados en los
Estados Unidos, se estimó que la cormobilidad de dichas enfermedades, se
encuentra por encima de un 50%. Evidencia de ello ha sido el uso de cierto número
de agentes para tratar ambas enfermedades; los mismos neurotransmisores están
involucrados en ambas condiciones; y el estrés puede crear una predisposición a
padecer cualquiera de las dos condiciones o ambas (Nutt; 2004).







45
- Fisiopatología de la ansiedad


Áreas cerebrales involucradas en la ansiedad:


Los estudios de imágenes, así como estudios de lesión y microinyección en
animales, han implicado varias estructuras del cerebro en desórdenes de ansiedad,
incluyendo la amígdala, el hipocampo, el giro cingulado, el hipotálamo y otras
regiones cerebrales (figura 14).



Figura 14. Probables vías serotonérgicas y regiones blanco en desórdenes de ansiedad.
Abreviaturas: GAD: desorden generalizado de ansiedad; SAD: desorden de ansiedad social;
OCD: desorden de obsesividad-compulsividad; PD: desorden de pánico.
Modificado de: Nutt, 2004

- Bioquímica de la ansiedad

El estudio de la acción farmacológica de ciertas sustancias, el análisis
neurobiológico de los desórdenes de ansiedad y el empleo de modelos de ansiedad
en animales, ha permitido la identificación de neurotransmisores y sistemas neurales
involucrados en la incidencia de la ansiedad. Dentro de los medicamentos más
utilizados para el tratamiento de la ansiedad, se encuentran las benzodiazepinas y
los inhibidores de la recaptación selectiva de serotonina (SSRIs, por sus siglas en
inglés), que modulan la neurotransmisión mediada por serotonina y ácido γ-
aminobutírico (GABA), respectivamente. Estos dos neurotransmisores han
demostrado tener un papel importante en desórdenes de ansiedad. Asímismo, en
estudios farmacológicos de la ansiedad, se ha visto implicado el sistema
46
noradrenérgico, especialmente en desórdenes de pánico. Estudios sobre la
fisiología del estrés en animales y humanos ha sugerido un rol preponderante del
sistema adrenocortical (implicado también en depresión) y su regulador
neuropeptídico, la hormona liberadora de corticotropina (CRH), en desórdenes de
ansiedad, como se menciona anteriormente en este trabajo (Gordon, 2004).

2.7 Cromatografía Líquida de Alta Resolución

Fundamentos

La cromatografía es un método de separación física, en la cual, los
componentes a ser separados se distribuyen selectivamente entre dos fases
imMiscibles: una fase móvil fluye a través de una fase estacionaria (Niessen, et al;
1999). Los componentes de una mezcla se separan cromatográficamente al
interaccionar con dichas fases. Aquellos solutos con mayor afinidad por la fase móvil
se moverán más rápidamente que aquellos solutos con mayor afinidad por la fase
estacionaria. Las diferencias en afinidad se deben al tamaño y estructura molecular,
a la distribución de cArgas, a la fuerza de los campos electrostáticos de grupos
cArgados, al grado de hidrofobicidad y a la presencia de puentes de hidrógeno. Por
lo anterior, la distribución de los solutos a través de una columna puede
considerarse como el resultado de diversos tipos de fuerzas moleculares de distinta
naturaleza y magnitud. En términos físico-químicos, cuando el soluto interactúa con
la fase estacionaria, sufre un cambio en su energía libre, que se debe a cambios en
la entalpía representada por fuerzas intermoleculares; y a cambios en la entropía
reflejada en una restricción del movimiento o bien en un impedimento para moverse
en forma aleatoria (Cazes; 2001; Cazes, et al; 2002).

Uno de los métodos cromatográficos más utilizados en la actualidad, es la
Cromatografía Líquida de Alta Resolución o HPLC (por sus siglas en inglés). La
técnica es utilizada en un amplio rango de actividades industriales científicas y
académicas, tales como el análisis de alimentos, drogas y agroquímicos. Asimismo,
esta técnica ha desempeñado un papel importante en la investigación de
desequilibrios moleculares característicos en procesos patológicos. Por ejemplo, el
análisis cuantitativo de neurotransmisores presentes en el líquido cefalorraquídeo,
productos de microdiálisis y homogeneizados del cerebro de mamíferos, ha
permitido la detección de anomalías relacionadas con enfermedades del sistema
nervioso central y periférico, tales como las enfermedades de Alzheimer, Parkinson,
47
Huntington, trastornos depresivos, de ansiedad, epilepsia y esquizofrenia. De la
misma forma, esta técnica ha sido utilizada para estudiar los rangos fisiológicamente
normales, en pacientes sanos (Hyman, et al; 2006).

Sistema cromatográfico

De manera general, un sistema cromatográfico está conformado por las
siguientes partes: inyector, bomba, columna, detector y sistema de registro (ver
figura 10).

Figura 15. Esquema general de un sistema cromatográfico. Modificado de Niessen,
et al; 1999.

El proceso del análisis cromatográfico inicia con la inyección de la muestra a
analizar, en el puerto de inyección. Es entonces cuando la muestra se incorpora al
caudal de la fase móvil, la cual, a su vez es impulsada a través de las tuberías del
sistema por medio de la acción de una bomba de alta presión. La muestra
incorporada al caudal es transportada hasta la columna, donde es separada en
diferentes partes, de acuerdo al tipo de interacción química de cada uno de sus
componentes (Niessen, et al ; 1999).

Se dice que las columnas son el corazón del sistema cromatográfico. Estas
están fabricadas con materiales como acero inoxidable y/o vidrio. Las columnas
están usualmente empacadas con materiales porosos (0,5-2μm), a través de los
cuales se produce una interacción entre los distintos componentes de la muestra, la
fase móvil y la fase estacionaria. El resultado es la separación de componentes o
analitos según su tipo de afinidad química. Finalmente, un detector capta las
señales producidas por cada uno de los elementos de la muestra y traduce la señal
a un ordenador que registra dicho estímulo en forma de pico, con tiempos de salida
(tiempos de retención) distintos, los cuales pueden ser característicos del analito si
48
se mantienen las mismas condiciones de análisis (pH, temperatura, componentes de
la fase móvil, fase estacionaria, voltaje e índice de flujo) (Niessen, et al; 1999).

Tipos de cromatografía líquida

La clasificación de las técnicas cromatográficas, se basa en el tipo de
mecanismo de distribución aplicado durante la separación. En la práctica, la mayoría
de las separaciones son el resultado de mecanismos de separación mixtos
(Niessen, et al; 1999).

Dos de los tipos de separación por cromatografía líquida más conocidos, son
la separación en fase normal y la separación en fase reversa (Niessen, et al; 1999).

La cromatografía de fase normal, consiste en una fase estacionaria
relativamente polar y en una fase móvil relativamente no polar. En este tipo de
separación, los analitos menos polares son los que eluyen de primero (Niessen, et
al; 1999; Bidlingmeyer; 1992).

Por otro lado, la separación en fase reversa consiste en una fase
estacionaria no polar y una fase móvil polar. Es decir, que en el método de
cromatografía en fase reversa, las moléculas se unen hidrofóbicamente a ligandos
no polares en presencia de un solvente polar. Los ligandos más comunes son los
grupos octil (C8) y octadecil (C18). Contrariamente, al tipo de separación en fase
normal, en la cromatografía en fase reversa, los analitos más polares son los que
eluyen de primero (Cazes, 2001; Niessen, et al ; 1999; Bidlingmeyer; 1992).

La técnica de cromatografía en fase reversa es de gran valor para el análisis
de sustancias polares y analitos iónicos, incluyendo el análisis de aminoácidos y
péptidos. En los últimos años, la cromatografía en fase reversa a permitido un gran
avance en el estudio de péptidos y aminoácidos. La resolución y la eficacia del
método, ha permitido el aislamiento de péptidos y aminoácidos, de analitos de
estructura química similar (Cazes, 2001; Niessen, et al ; 1999).

Detección electroquímica

Existen diversos tipos de detectores en cromatografía. Algunos de éstos
incluyen los de detección ultravioleta-visible, refractómetros, de fluorescencia y
49
electroquímicos. Aquí se hace referencia al tipo de detección utilizada en este
protocolo: la detección electroquímica (Niessen, et al; 1999; Parvez; 1987).

Los detectores electroquímicos se basan en la medición de la corriente
eléctrica resultante de la conversión oxidativa o reductiva de un analito en la
supeficie del electrodo (Niessen, et al; 1999; Parvez; 1987).

El mecanismo específico de detección electroquímica consiste en lo
siguiente: un potencial eléctrico de suficiente magnitud es aplicado a un electrodo de
trabajo, usualmente hecho de carbón (puede ser metal), sobre el cual, pasa el
analito a medida que se libera de la columna, lo cual produce una reacción de
oxidación o reducción. El flujo de electrones procedentes del electrodo de trabajo
hacia el analito o viceversa, puede medirse como una corriente cuya magnitud es
proporcional a la concentración del analito que pasa a través del detector.
Generalmente, el potencial (voltaje) del electrodo se escoge de forma que la
velocidad de la reacción (transferencia de cArga) en la superficie del electrodo, sea
más rápida que la transferencia de masa a través de dicha superficie (Parvez;
1987).

Para mejorar la sensibilidad y selectividad del método cromatográfico se han
creado electrodos duales. El primer electrodo, también llamado electrodo de
referencia, funciona como pantalla para el segundo electrodo, removiendo señales
indeseables procedentes de especies que son más fácilmente oxidables que el
analito de interés. El electrodo de trabajo se mantiene dentro de un potencial fijado
por el electrodo de referencia, el cual, limita el potencial bajo el cual, se detecta el
analito de interés. Un electrodo de referencia muy comúmMente utilizado es el
electrodo de Ag/AgCl. Este último, reduce o elimina, la señal producida por la fase
móvil, siempre y cuando ésta mantenga una velocidad y composición constante
(Ahuja, 1989; Parvez, 1987).

Los tipos más comúnes de detección electroquímica son: la detección
amperométrica; colorimétrica, conductimétrica y potenciométrica. En este trabajo, la
detección de tipo amperométrica es el tipo de detección utilizada para el análisis y
cuantificación de GABA y Glutamato. La técnica amperométrica ha probado ser de
gran valor en combinación con la cromatografía de fase reversa, no solo por su gran
sensibilidad, sino también por la selectividad demostrada en algunos casos. Lo
anterior, se debe a que la detección se limita a aquellas sustancias capaces de
50
oxidarse o reducirse en la celda electroquímica, con la aplicación de un potencial
eléctrico (Packer, et al; 2001; Parvez, 1987).

Detección electroquímica de neurotransmisores – Técnica de derivatización
precolumna

Con el objetivo de mejorar la sensibilidad y selectividad del método
cromatográfico con detección electroquímica, se han desarrollado técnicas de
“marcaje químico”. Una de las técnicas actualmente utilizadas, es la técnica de
derivatización (Lingeman; et al; 1990; Giddings, et al; 1987).

La técnica de derivatización, consiste en la transformación bioquímica de
analitos de interés, por adición de un grupo químico en la estructura. El marcaje de
los analitos por medio de esta técnica, ha permitido la detección selectiva y sensitiva
(μM-fM) de analitos biológicos, bioactivos y metales en tejidos, fluídos corporales
(como Líquido Cefalorraquídeo) y contaminantes. La alta sensibilidad del método, se
debe a que los productos de la derivatización se oxidan más fácilmente en su paso a
través del detector electroquímico (Arslan, O; 2001; Webster; 2001; Jacobs, 1987).

El progreso en las técnicas de derivatización, ha hecho posible el marcaje
selectivo de grupos funcionales de moléculas orgánicas de bajo peso molecular y la
diferenciación entre estos grupos funcionales y otros del mismo tipo, presentes en
moléculas más grandes (Giddings, et al; 1987). Se ha demostrado que la técnica de
derivatización en HPLC-EC puede utilizarse en el marcaje de péptidos de pequeño
tamaño, alquilaminas y aminoácidos. Los grupos funcionales marcados en este tipo
de moléculas, son las aminas primarias (Cazes, et al; 2001; Phyllis, et al; 1995).

Algunos de los reactivos utilizados para el marcaje químico de aminoácidos
transmisores son el oftaldehído (OPA) (figura16), el 4-Fluoro-7-nitrobenzofurazan
(NBD-F) y el Cloruro de 5-Dimetilaminonaftaleno-1-sulfonilo (DNS-Cl)(Cazes, et al;
2001).




Figura 16. Representación química de un aminoácido derivatizado con OPA. En turquesa:
anillo de OPA; en rojo: el aminoácido; en morado: β-mercaptoetanol. Fuente: Cazes, et al;
2001.
51

El marcaje de aminoácidos ha sido comúnmente llevado a cabo con OPA en
presencia de grupos tiol (figura 16), como el β-mercaptoetanol y el tert-butil tiol (que
contienen un grupo mercapto:-SH ) o en presencia de grupo sulfito (i.e Na
2
SO
3
)
(figura 17). Se ha observado que la sustitución del grupo tiol por el grupo sulfito
produce una mayor estabilidad del producto de la reacción (N-alquilo-1-isoindol
sulfonato) (Cazes et al; 2001; Rowley et al, 1995). La reacción de derivatización
entre aminoácidos, OPA y grupos tiol o sulfito, debe hacerse a un pH alcalino, tal
como lo indica la figura 17 (Packer et al; 2001; Jacobs, 1986).


Fig 17. Representación de la reacción química entre OPA, un grupo sulfito y un aminoácido.
La molécula final corresponde a un grupo N-alquilo-1-isoindol sulfonato
Fuente: Jacobs, 1986.


Adicionalmente, el proceso de derivatización puede realizarse de dos formas:
postcolumna o precolumna. En la derivatización postcolumna la derivatización tiene
lugar entre la columna y el detector, mientras que la derivatización precolumna se
lleva a cabo previo a su inyección en el aparato. La separación de aminoácidos
marcados se lleva a cabo generalmente mediante la técnica de separación
precolumna, ya que ofrece ventajas sobre la derivatización poscolumna como: una
necesidad limitada de instrumentos para el proceso de derivatización; y una mejor
sensibilidad, resolución y selectividad. Por ejemplo, aún cuando la técnica permite el
marcaje de aminas primarias, no es posible utilizarla para el marcaje de aminas
secundarias, tal es el caso del iminoácido prolina (Cazes, et al; 2001; Lingeman, et
al; 1990).









52
3. METODOLOGÍA

3.1 Evaluación del protocolo de referencia para el análisis de aminoácidos
transmisores

- Descripción de la metodología de estandarización:

Se evaluó el protocolo descrito por Rowley, et al; 1995, para la cuantificación
de GABA y Glutamato; con algunas modificaciones (ver condiciones cromatográficas
iniciales).

- Preparación de la Fase Móvil

En un balón aforado de 250 ml, se agregaron 0,1M de fosfato monosódico y
0,5mM de EDTA. Después, se aforó con 25% metanol/agua (v/v). El pH se ajustó a
4,5 con ácido fosfórico (1M). La fase móvil fue filtrada dos veces a través de filtros
hidrofílicos de membrana de polipropileno (GH Polypro) con porosidad 0,20μm y
diámetro de 47mm, marca Pall. Posteriormente, fue desgasificada durante 15 min en
un baño ultrasónico Steri-cleaner de Sturdy Industrial co; LTD; a temperatura
ambiente. Las fases móviles fueron almacenadas en erlemMeyers de 250 mL,
cubiertos con papel aluminio y rotulados apropiadamente.

- Preparación del Material de Referencia:

Soluciones madre de aminoácidos:

Se prepararon cinco soluciones madre (alta concentración) de cada uno de
los aminoácidos: ácido γ-amino butírico (GABA), glutamato (Glu), glutamina (Gln),
taurina (Tau) y arginina (Arg); a una concentración de 0,02M. Los aminoácidos
(marca Sigma®) se pesaron uno a uno, en una balanza analítica marca Explorer de
la corporación OHAUS®, modelo E12140 (máx 210g). Para la preparación de las
soluciones madre, se pesaron cantidades equimolares de cada aminoácido que
fueron posteriormente diluídas en 3ml de agua desionizada. Así, de Glutamato, se
pesó una cantidad aproximada de 8,9mg; de GABA, 6,2mg; de Glutamina, 8,9mg;
de Taurina 7,6mg y de Arginina-HCL 12,9mg. Para el cálculo de la molaridad fue
tomado en cuenta el grado de pureza del reactivo y la molaridad del compuesto
presente en el envase. Adicionalmente, se calculó la molaridad real de cada
53
aminoácido, según la cantidad real pesada en balanza analítica. Las soluciones
madre de cada aminoácido fueron preparadas semanalmente y almacenadas a -
20°C, en viales de 10mL de polietileno para evitar la adherencia que presentan los
aminoácidos cuando son puestos en contenedores de vidrio.

Soluciones de trabajo de los aminoácidos:

Las soluciones de trabajo son soluciones de concentración intermedia,
preparadas a partir de las soluciones madre. Las soluciones de trabajo, se preparan
con el fin de facilitar la elaboración de soluciones más diluídas (soluciones acuosas),
y para reducir la exposición de la solución madre a la degradación por efecto de la
temperatura ambiental, a lo lArgo del día de trabajo.

Se prepararon cinco soluciones de trabajo a partir de las soluciones madre
(0,02M) de cada aminoácido. Para efectuar la dilución correspondiente de cada
solución madre, fue tomada en cuenta la cantidad real (en mg), de aminoácido
pesado en balanza analítica, como se expuso anteriormente. Cada cantidad (mg)
real pesada y diluida, posee también una molaridad real. Por esto, a partir de esta
cantidad real pesada (mg), se efectuaron los cálculos estequiométricos respectivos,
para obtener la cantidad de μL necesarios que permitieran posteriormente conseguir
por diluciones seriales, soluciones acuosas de cada aminoácido solo o en conjunto,
a concentraciones exactas de 100μM, 10 μM y 1 μM. Por ejemplo, si la
concentración real final de Glutamina correspondía a una molaridad de 0,021211M,
la cantidad de μL de aminoácido tomada para preparar la solución de trabajo de
este aminoácido, sería aproximadamente de 47μL, a la cual, se agregan 953μL de
agua desionizada. Esta metodología de preparación de soluciones de trabajo,
facilitó la elaboración de soluciones acuosas, descritas a continuación.

Soluciones acuosas de los aminoácidos:

Las soluciones acuosas de aminoácidos fueron preparadas a partir de las
soluciones de trabajo, por medio de diluciones seriales. El rango de diluciones
efectuadas giró entorno a las concentraciones de GABA y Glutamato evaluadas en
el artículo original. Se realizaron diluciones de cada solución de trabajo tomando
100μL de la solución de trabajo y diluyéndola en 900μL de agua para preparar una
dilución 1 en 10. La siguiente dilución se preparó tomando 100μL de la dilución 1:10
y agregando 900 μL de agua. La última dilución se preparó de la misma forma que
54
las anteriores, a partir de la dilución 1:100, para obtener una concentración de
1:1000 equivalente a 1 μmol/L de cada aminoácido.

- Preparación de la solución de derivatización

Fueron pesados y disueltos 11,0 + 0,005mg de OPA en 0,5ml de etanol
absoluto al cual, fueron añadidos 0,5ml de sulfito de sodio (1M) y 0,9 ml de buffer
tetraborato de sodio (0,1M) ajustado a pH 10,4 con Hidróxido de Sodio (5M). El
reactivo se preparó diariamente y se verificó que permaneciera estable a través del
día de trabajo. Dicha solución de derivatización se conservó a baja temperatura
(3°C), en beakers de 10mL forrados con aluminio y rotulados debidamente. La
concentración final del reactivo OPA en la preparación anterior es de 43mM.

Condiciones cromatográficas iniciales:

Software de análisis cromatografico: CSW32 Chromatography Station
Detector electroquímico: Waters 464 pulsed
Bomba: Waters 515 HPLC
Columna de separación: *Spherisorb® ODS1 C18, fase reversa (5μm, 250* 4,6
mm)
Fase móvil: 0,5mM EDTA; 0,1M Buffer Fosfato monobásico; 25% metanol, llevada
a pH 4,5 con Ac. Fosfórico (5M).
Flujo: 0,65ml/min
Volumen del Lazo de inyección: 50μL
Volumen inyectado: 100 μL (en dos inyecciones)
Temperatura: ambiental
Potencial aplicado: 850mV
Intensidad de corriente del electrodo de trabajo: 20nA.
Tipo de circulación de la fase móvil: circuito cerrado

* la marca de la columna de separación sugerida es Rainin Dynamax (no se
encuentra en el mercado), sin embArgo, las propiedades básicas de la columna
seleccionada, son las mismas.

Las modificaciones al protocolo original se realizaron con el fin de adaptarlo a
los recursos del laboratorio. Las modificaciones realizadas incluyen la filtración de la
fase móvil a través de filtros de 0,22μm y no de 0,45 μm, como lo establece el
55
protocolo original. Distinto tipo de circulación de la fase móvil, la cual, difiere de la
metodología establecida por Rowley, et al (1995); en que ésta es de tipo abierto y no
cerrado, con el fin de economizar el uso de reactivos. Por otra parte, para aumentar
la cantidad de muestra disponible para análisis, se utilizó un lazo de inyección de 50
μL y no de 20 μL, como se sugería. Por último, el tipo de solvente utilizado fue agua
desmineralizada y no doblemente desmineralizada. El agua desmineralizada fue
suministrada por el Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM)
y por el Laboratorio de Química Analítica de la UCR.

- Pruebas Analíticas preliminares:

Estandarización de la sensibilidad del método durante pruebas preliminares

Con el fin de definir una sensibilidad adecuada durante las pruebas de
resolución del método, la concentración propuesta fue evaluada a sensibilidades de
100nA, 50 nA y 20nA. La concentración de OPA utilizada fue de 43mM y se
utilizaron 2 μL de solución de derivatización por mL de solución acuosa (1μM). La
reacción fue llevada a cabo en viales de polietileno de 1,5mL, durante 10 minutos
previa inyección en el sistema cromatográfico. Los criterior de selección de la
sensibilidad más adecuada fueron: calidad de la detección de los picos y limpieza de
la línea base.

Identificación de los tiempos de retención asociados a aminoácidos
transmisores y evaluación de la resolución del método

Las primeras evaluaciones fueron de carácter cualitativo y consistieron en la
inyección de una concentración media (1μM) tomada del estudio de linealidad
descrito en el protocolo de referencia, con la finalidad de identificar los tiempos de
retención correspondientes a cada aminoácido. Para dichos análisis se agregaron
0,8 uL de OPA (43mM), por mL de solución acuosa de aminoácidos (1μM). Cada
uno de los aminoácidos fue inyectado individualmente a los 10 minutos de haber
sido puestos en reacción con la solución de derivatización, en forma aislada.
Adicionalmente, se inyectaron blancos de solución estándar (agua desmineralizada),
y blancos con OPA, con el objetivo de identificar picos diferentes de los aminoácidos
de interés y sus tiempos de retención.

56
Por otra parte, se prepararon soluciones acuosas de los aminoácidos de
interés (GABA y glutamato), y de otros aminoácidos potencialmente interferentes:
glutamina, taurina y arginina. Dichas soluciones fueron preparadas a una
concentración de 1μM y derivatizadas con 2 uL de solución de derivatización (OPA
43mM), durante 10 minutos, previa inyección en el sistema cromatográfico. Se
verificó que este volumen de derivatización no produjera contaminación de la línea
base (formación de picos fantasma) y que marcara a los aminoácidos en solución.
Se realizaron tres corridas de las soluciones de aminoácidos en matriz.

En este ensayo, se evaluó la calidad de la resolución de los picos de interés.
La resolución provee una medida cuantitativa de la habilidad para separar dos
componentes en una mezcla. Para una mezcla de dos compuestos A & B, la
resolución puede ser definida mediante la siguiente ecuación:

R= 2 * [(T
R
)
B
-(T
R
)
A
/ W
A
+ W
B
)

(T
R
)
B
= tiempo de retención de un componente B que es más fuertemente retenido.
(T
R
)
A
= tiempo de retención de un componente A que es menos fuertemente
retenido.
W
B
= ancho del pico para un componente B en la línea base
W
A
= ancho del pico para el componente A en la línea base

Si R es menor que 1, los componentes se están sobrelapando
Si R es igual que o mayor que 1, esto indica una buena separación

Los criterios anteriores fueron utilizados para evaluar cuantitativamente la resolución
del método.

3.2 Extracción y Procesamiento de Cerebros de Rata para su análisis

Los cerebros de rata fueron extraídos de ratas Wistar macho, jóvenes (peso
desconocido), sin tratamiento previo. La muerte de las ratas fue realizada por
decapitación con guillotina. La extracción de los cerebros fue realizada
cuidadosamente dejando un poco de la médula. Rápidamente, el cerebro extraído
se colocó en un beaker con solución salina fría al 0,9%. Posteriormente, se
disectaron sobre hielo las cortezas temporales derecha e izquierda. En total se
extrajeron ocho regiones cerebrales de cuatro ratas.
57

A continuación, las regiones cerebrales extraídas fueron colocadas, en viales
de polietileno de 1,5mL con agua doblemente desionizada. Seguidamente, éstas se
homogenizaron y almacenaron a -20°C, con el fin de disminuir la acción de enzimas
proteolíticas y la degradación de la muestra.

Las muestras fueron desalmacenadas, una vez establecido y optimizado el
protocolo, para valorar la utilidad del mismo. Cada muestra fue centrifugada por 20
minutos a 10 000 rpm, a 3°C y a continuación, fue filtrada a través de filtros de
membrana de nitrato de celulosa (RC58) de porosidad 0,20 μm y diámetro 9mm,
marca Schleicher & Schuell, Micro Science. Por último, las muestras que serían
analizadas, se diluyeron, derivatizaron e inyectaron en el sistema HPLC. El resto de
las muestras, que no serían utilizadas el día del análisis fueron almacenadas
nuevamente a -20°C.

El procedimiento utilizado para la extracción y pretratamiento de la muestra
fue implementado por la Msc. Elvira Salas, investigadora del Programa de
Neurociencias. Dicho protocolo se ilustra en la figura 18 con algunas modificaciones.


3.3 Evaluación de la resolución del método en homogeneizados de cerebro
(protocolo de Rowley, 1995)

Se evaluó la resolución de los picos en homogeneizados de cerebro
provenientes de corteza temporal, con el fin de valorar la efectividad del método en
cuanto a la resolución de los aminoácidos de interés, frente a otro tipo de
interferencias presentes en la matriz biológica (homogeneizados de cerebro de rata).
Se utilizaron las condiciones iniciales cromatográficas, mencionadas anteriormente:
temperatura ambiente, 0,65ml/min, 20nA de sensibilidad y 850mV. Además, se
realizaron diluciones 1/10 de las muestras con el objetivo de detectar cada pico en
forma completa. Por otra parte, las muestras fueron derivatizadas con 2 μL de
reactivo de derivatización (OPA 43mM) durante 10 minutos.

58


Figura 18. Procedimiento de extracción y procesamiento de la muestra.


3.4 Optimización de protocolo para el análisis de GABA y Glutamato

La optimización del protocolo consistió, básicamente, en la eliminación de
picos interferentes y picos fantasma del cromatograma y la optimización de la
resolución de los picos correspondientes a los aminoácidos de interés en matriz
blanca (aminoácidos estándar en agua desionizada) y en matriz biológica
59
(homogeneizados de cerebro). Esto último con el fin de facilitar la cuantificación de
aminoácidos, descrita más adelante.

Efecto de la concentración de metanol sobre la resolución de los picos

Se evaluaron cuatro concentraciones de metanol cercanas al 25%
(concentración del protocolo original). Para esto, se prepararon fases móviles de
igual pH (4,5), con concentraciones crecientes de metanol : 22-23%-25%-27%. Las
concentraciones de soluciones acuosas evaluadas fueron de 100μM. Estas se
inyectaron a los 10 minutos del tiempo de derivatización con 2μL de OPA (43mM), a
una sensibilidad de 20nA, a un potencial 850mV y a un índice de flujo de
0,65mL/min. La evaluación de cada concentración de metanol requirió la inyección
por triplicado de las soluciones acuosas y la inyección de los cinco aminoácidos en
forma única, con el fin de identificar sus respectivos tiempos de retención.

Efecto del pH sobre la resolución de los picos

Una vez realizadas estas pruebas fue seleccionada aquella fase móvil con
mejor resolución de picos y menor tiempo de corrida A esta fase móvil, se le varió el
pH a: 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 y 6,0. Para medir el pH, se utilizó un pHmetro marca
CORNING, modelo Pinnacle 530, que fue calibrado, una vez al día, cada vez que
fuera a ser utilizado, obteniéndose curvas de calibración cercanas al 100% (+2%).
Cada fase móvil fue evaluada en días consecutivos, después de dejarse en
circulación cerrada al menos 12 horas, durante la noche, para que el sistema
cromatográfico se estabilizara. Para esta prueba, se utilizaron las mismas
condiciones cromatográficas que para la prueba anterior. Del mismo modo, se
realizaron inyecciones de soluciones acuosas de aminoácidos por triplicado e
inyecciones de aminoácidos únicos con el fin de identificar sus respectivos tiempos
de retención.

Selección de la mejor fase móvil

La elección de la mejor fase móvil fue realizada con base en los siguientes
criterios: calidad de la resolución de los picos correspondientes a GABA y glutamato;
menor tiempo total de corrida y tiempo de retención de picos contaminantes propios
de la solución de derivatización (no debían ser interferentes). No obstante, en este
punto se le dio prioridad a la separación del aminoácido glutamina. Después de que
60
las mejores fases móviles fueron sometidas a evaluación, fueron realizadas otras
pruebas de estandarización y optimización del protocolo.

Pruebas preliminares en cerebro de rata (nuevo protocolo)

Las pruebas preliminares en homogeneizados de cerebro de rata, se llevaron
a cabo con el objetivo de medir la efectividad del método seleccionado, en la
separación de GABA y glutamato. Para tal efecto, se utilizó un flujo de 0,65ml/min, y
se determinó la temperatura más adecuada de separación, mediante la inyección de
una muestra a temperatura ambiental y a una temperatura baja (8,1°C).
Posteriormente, fueron realizados otros ensayos de optimización del protocolo.

Efecto de la temperatura sobre el pH de la fase móvil

Durante el proceso de elaboración de una nueva fase móvil fue necesario,
evaluar el efecto de la temperatura sobre el pH. Para tal efecto, se midió el pH de
una fase móvil al 23% de metanol, enfriada hasta 10 °C, la cual, fue calentándose
paulatinamente hasta una temperatura de 16°C. Con este fin, se realizaron treinta
mediciones en forma consecutiva. Para la medición de pH y temperatura se empleó
el pHímetro marca CORNING modelo Pinnacle 530.

Esta evaluación permitió valorar la robustez del método, en cuanto al efecto
que podrían tener las variaciones de la temperatura, en el pH de la fase móvil y por
ende en los tiempos de retención de los analitos. Asimismo, se estableció una
relación cuantitativa entre temperatura y pH.

Efecto de la temperatura sobre los tiempos de retención

Se evaluaron temperaturas comprendidas entre 10-16°C, con el fin de
evaluar el efecto que tiene la temperatura sobre los tiempos de retención de los
aminoácidos de interés. En esta prueba se utilizaron soluciones acuosas 100μM
derivatizadas con 20μL de solución de derivatización 43mM. Para lograr
temperaturas bajas cercanas a los 10°C, se implementó un sistema de enfriamiento
(figura 19), con una caja de estereofón perforada en ambos extremos para sostén
de la columna. En el fondo de la caja se colocó hielo gel, y envolviendo la columna
se colocó una bolsa de agua fría para conservar la temperatura temporalmente
61
estable. El índice de flujo utilizado fue el mismo que para el artículo de referencia, es
decir, 0,65ml/min. La siguiente figura ilustra el sistema de enfriamiento creado.


Figura 19. Sistema de enfriamiento con hielo Gel

Efecto del índice de flujo sobre los tiempos de retención

Se determinó el efecto que tiene el índice de flujo sobre los tiempos de
retención y la resolución de aminoácidos. Para cumplir con este objetivo, fue
utilizada aquella fase móvil de resultados cromatográficos óptimos (23%metanol, pH
5,5). Los índices de flujo evaluados fueron: 0,45; 0,5; 0,55; 0,60 y 0,65 ml/min. Se
procuró una misma temperatura (a 17,0 + 0,5°C), a lo largo del análisis.


Efecto de la concentración de OPA sobre la detección química de aminoácidos
transmisores (100μM) para análisis de repetibilidad

Con el fin de evaluar el efecto que tiene el marcaje químico con OPA sobre la
detección de aminoácidos transmisores y sobre las áreas relativas de los
aminoácidos en matriz, se realizó un ensayo en el cual se añadieron cantidades
crecientes de solución de derivatización (OPA 43mM), por mL de solución acuosa
de concentración constante (100μM). El objetivo primordial de este ensayo, fue
determinar la concentración de OPA óptima necesaria para derivatizar los
aminoácidos glutamato, glutamina, GABA, arginina y taurina en solución acuosa
100μM; destinados a análisis de repetibilidad. Este ensayo se llevó a cabo a una
sensibilidad de 20nA, a un potencial de 850mV y a un flujo de 0,5ml/min. Además,
se procuró realizar cada corrida en un rango de temperatura entre los 18-23°C.



62
Reajuste de la concentración de OPA para análisis de linealidad

Se realizó un ensayo similar al descrito anteriormente para la determinación
de la concentración de OPA óptima durante la derivatización de aminoácidos
100μM. Esta vez, se estableció una cantidad de OPA adecuada para la
derivatización de la concentraciones correpondientes al rango superior de la curva
de linealidad es decir: 1500 μM de GABA; 437,5 μM de glutamato; 437,5 μM
glutamina; 350 μM de taurina y 350 μM de arginina. Para la derivatización de estas
concentraciones de aminoácidos, se realizaron adiciones crecientes de solución de
derivatización (concentración de OPA 43mM), de 20μL a 44μL por mL de solución
acuosa de aminoácido.


Reajuste de la intensidad de corriente aplicada en la detección para análisis de
linealidad

El nuevo protocolo desarrollado requirió un reajuste de la intensidad utilizada
sobre todo para la elaboración de una curva de calibración a concentraciones
proporcionalmente decrecientes. Para esto, se evaluaron las siguientes
intensidades: 10, 10/20, 20/50 y 10/50nA. Los tres últimos ensayos fueron
realizados en forma mixta alternando una primera intensidad con una segunda
intensidad, de forma que a los 12-13 minutos de corrida se cambiaba a una
intensidad mayor, hasta lograr un mejor ajuste en la detección de aminoácidos
transmisores de menor y mayor área (respuesta en mV*s). La concentración de
aminoácidos utilizada para este análisis corresponde a la mayor concentración del
rango de linealidad, expuesta anteriormente.

3.5 Pruebas de calidad en el método desarrollado

Para estimar la aplicabilidad del nuevo método desarrollado en la determinación
cuantitativa de los aminoácidos GABA, glutamato y glutamina, se realizaron algunas
pruebas de calidad, recomendadas por la IUPAC (Unión Internacional de química
pura y aplicada) y AOAC International. Las pruebas realizadas definen la veracidad
(repetibilidad), linealidad y el efecto de la matriz general. Asímismo, a lo largo de
este trabajo, se realizaron pequeños cambios en el procedimiento para valorar, otro
parámetro de calidad: la robustez del método. Este último, se define como la
resistencia al cambio en los resultados obtenidos por un método analítico. Las
63
condiciones evaluadas incluyen: porcentaje de metanol, pH, temperatura de
preparación, temperatura de corrida y efecto de la matriz. La evaluación de la
robustez se hizo con base en los cambios observados en la resolución de los
aminoácidos de interés.

Prueba de veracidad (repetibilidad)

Se realizó un análisis de repetibilidad por medio de la inyección sucesiva de
quince patrones (material de referencia no certificado) de igual concentración, en un
mismo día. El análisis de repetibilidad se llevó a cabo por medio de la preparación
de una solución de aminoácidos cercana a 100μM (0,015μg/μL de cada
aminoácido), en balones aforados de plástico de 100mL. Para esto, se preparó una
solución madre de todos los aminoácidos a una concentración de 0,1μg/μL. A
continuación se tomó una alícuota de 15mL, que a su vez, fue disuelta en 100mL de
agua desionizada.

Las calibraciones de los patrones se hicieron por el método de estándar
externo, por comparación de las áreas de los picos. Se analizaron los datos
obtenidos después de quince inyecciones de solución patrón y se obtuvo el
promedio, el porcentaje de variación, la desviación estándar y la desviación estándar
relativa.

Para el análisis de los datos obtenidos para el ensayo de repetibilidad, se
siguieron los criterios establecidos por la revista de Cromatografía B (Journal of
Chromatography B) ( De Bièvre, et al ; 2005); en donde el máximo porcentaje de
desviación estándar relativa aceptada es de un 10%. Sin embargo, se han aceptado
porcentajes de hasta un 20% para materiales de referencia de menor calidad ( De
Bièvre, et al ; 2005).

Pruebas de Linealidad

El ensayo de linealidad consistió en la inyección de seis concentraciones
diferentes de los aminoácidos: GABA, glutamato, glutamina, taurina y arginina
preparados en matriz blanca (ensayo de los calibradores en forma conjunta). Los
rangos de linealidad fueron seleccionados con base en las concentraciones
normales de GABA, glutamato, glutamina, arginina y taurina encontradas en cerebro
de rata; y con base en las sugerencias hechas en la guía de Recomendaciones
64
Armonizadas para la Validación de Métodos de Análisis de un solo Laboratorio
(Resolución OENO 8/2005) (Castelucci; 2005). En dicho informe, se sugiere la
utilización de rangos de linealidad entre 0-150% o entre 50-150% de la
concentración susceptible a ser hallada. Con base en esto, se analizó un rango que
abarca aproximadamente del 6 al 174% (14-435μM) de la concentración esperada
en cerebro (250μM), en el caso de Glutamato (Lasley, 1984) y del 9 al 301% (45-
1455 μM) de la concentración promedio esperada de GABA (276-690 μM; o bien 2-
5μM/g tejido) (Kasper et al; 2003; Lasley, 1984). También se tomó en cuenta un
rango del 6 al 175% (14-438 μM) de la concentración de glutamina (250 μM),
susceptible de ser hallada en cerebro de rata (Lasley, 1984). Del mismo modo, las
distintas concentraciones de taurina y arginina, fueron determinadas con base en la
concentración aproximada de cada una de ellas, en cerebro de rata (250μM)
(Lasley, 1984). El rango de estos dos aminoácidos abarca aproximadamente de un
4 a un 130% de la concentración esperada.

La preparación de las distintas concentraciones de aminoácidos (cuadro 4),
fue realizada de forma serial ½ (es decir, que las diluciones seriales realizadas son
cada una la mitad de la concentración anterior), para los cinco aminoácidos en
matriz.

Los estudios de linealidad fueron llevados a cabo dos veces en días
consecutivos, utilizando concentraciones de OPA de 43mM el primer día y de
86mM, el segundo día de análisis, manteniendo la misma concentración de los
demás componentes en la solución de derivatización (etanol, sulfito de sodio y
tetraborato de sodio).

Las calibraciones en el estudio de linealidad se hicieron por el método de
estándar externo. Al final del estudio, se determinó el coeficiente de correlación de
los aminoácidos GABA, glutamato y glutamina en matriz; y se analizaron los datos
de la siguiente forma:

1. Determinación del coeficiente de correlación incluyendo en el cálculo (ver cuadro
3):

a) Las seis concentraciones de los aminoácidos en matriz.
b) Las cinco concentraciones menores de los aminoácidos en matriz
c) Las cuatro concentraciones menores de los aminoácidos en matriz
65
d) Las cinco concentraciones mayores de los aminoácidos en matriz
e) Las cuatro concentraciones mayores de los aminoácidos en matriz

2. Comparación de los coeficientes de correlación obtenidos en los cinco casos
anteriores(a–e).

3. Comparación entre los coeficientes de correlación obtenidos a 43mM y 86mM

Lo anterior, se realizó con el fin de determinar la linealidad del método y el
efecto de la concentración de OPA sobre la linealidad obtenida a diversas
concentraciones.

Las concentraciones de los calibradores preparados se exponen en el cuadro3.

Cuadro 3. Concentraciones de los aminoácidos transmisores e interferentes
(en μmoles/L) para análisis de linealidad
Concentración (μmoles/L)

Calibrador

GABA

Glutamato

Glutamina

Arginina

Taurina
1
2
3
4
5
6
1455
727
363
182
91
45
435
217
109
54
27
14
438
219
109
55
27
14

320
159
80
40
20
10


332
166
83
42
21
10


Efecto de la matriz general

Para estudiar un posible desemparejamiento general de la matriz sobre la
cuantificación de transmisores aminoacídicos, se realizaron curvas de calibración
para cada uno de los calibradores de interés (GABA, glutamato y glutamina). La
prueba se realizó de manera que ofrece la misma dilución final que la diseñada para
el análisis en matriz blanca y abarca el mismo rango que la curva de calibrado
expuesta en el cuadro 3. Para saber si existe un efecto de matriz considerable, se
compara la curva de calibración de los aminoácidos en matriz contra la pendiente
66
resultante de las adiciones sucesivas del analito en forma única. (Castellucci, 2005).
La división de las pendientes debe ser cercana a 1. Finalmente, se realiza un
estudio de significancia. Para todos los análisis de linealidad de aminoácidos
transmisores únicos, se empleó una concentración 86mM de OPA.

3.6 Calibración de equipos y pruebas de idoneidad al sistema HPLC

Balanza analítica y micropipetas:

La balanza analítica marca Explorer OHAUS®, modelo E12140 (máx 210g) y
las dos micropipetas marca y modelo Eppendorf Research (10-100μL) y Eppendorf
Reference (100-1000 μL) respectivamente, fueron calibradas por medio de
PROCAME (UNA) (acreditados con el ISO 17025) (en anexos, certificados de
calibración respectivos).

pHMetro:

El pHímetro marca CORNING modelo Pinnacle 530 con electrodo CORNING
(“3 in 1” Combo w/RJ); se calibró cada día de trabajo, haciendo uso de soluciones
buffer para calibración pH 4 y pH 7, obteniendo una pendiente de calibración
siempre cercana al 100% ( +2% ).

Sistema HPLC:

Bomba (Waters 515 HPLC):

Se verificó el flujo programado con la recolección de fase móvil en una
probeta clase A de 10 mL. Se programó un índice de flujo de 1ml/min durante 10
minutos y se verificó la recolección exacta de 10 mL. Posteriormente, se evaluó la
continuidad del bombeo desconectando la manguera de salida de la precolumna y
columna. Se incrementó la velocidad de bombeo a 5ml/min y se observó la
continuidad del flujo (el cual no debía cortarse).

Detector (Waters 464 pulsed):

Fue calibrado de acuerdo con la guía de calibración propia del detector
electroquímico Waters (ver anexo). Adicionalmente, la solución de Cloruro de plata
67
(AgCl) del electrodo de referencia fue sustituida por el técnico de la Corporación
Waters, C.R. Además, se lavó y pulió el electrodo de trabajo, según el protocolo
diseñado en cada caso (ver Protocolos de Limpieza y Pulido del Electrodo de
Trabajo, en anexos).

3.7 Búsqueda de Hojas de Seguridad (MSDS, Material Safety Data Sheets)

Para garantizar la seguridad del laboratorio y sus trabajadores, se creó un
archivo con información de seguridad de todas las sustancias químicas, que serían
empleadas para el desarrollo de este protocolo. La información disponible incluye la
naturaleza química y física de los reactivos; el manejo, almacenamiento y
disposición de los mismos y medidas de precaución y de primeros auxilios en caso
de inhalación, ingestión o contacto con la piel. Las hojas de seguridad fueron
obtenidas de los archivos disponibles en la red para la marca Sigma-Aldrich y de la
décima edición del manual Merck.

3.5 Protocolo de limpieza

- Lavado de cristalería:

Todo recipiente de vidrio o pyrex fue lavado de la siguiente forma:

Se lavó con jabón Liquinox ( 1 parte de jabón por cada 9 partes de agua), toda la
cristalería haciedo uso de hisopos dispuestos para tal fin. Cada recipiente se
enjuagó diez veces con agua de cañería. Se verificó visualmente ausencia de
partículas o jabón. Por último se enjuagó dos veces con un volúmen pequeño de
agua destilada.

- Lavado de puntas para micropipetas y viales de polietileno:

Las puntas y viales de polietileno fueron colocadas imMediatamente después
de su uso, en agua destilada y se dejaron en ésta, hasta el proceso de lavado.
Cuando llegó el momento de lavar, se colocaron en agua con jabón (1/10), y se
colocaron en agitación magnética durante media hora. Pasado este tiempo, fueron
colocadas en el baño ultrasónico por 15 min, a 30°C. Después, se enjuagaron todas
las puntas y tubos con agua del tubo haciendo uso de un colador grande.
68
Finalmente, se hizo un último enjuague con agua destilada en agitación durante 15
minutos y ultrasonificación por 15 minutos a 30°C.

- Secado de cristalería:

La cristalería se secó en un horno Digisystems hasta sequedad a 50,0 +
0,05°C.

- Secado de puntas y viales de polietileno:

Las puntas y tubos, se secaron en Horno Digisystems a 40°C + 0,05°C. Cada
5 minutos se vigilaban las puntas y se sacudían para evitar deformaciones en el
material.






















69
4. RESULTADOS

4.1 Evaluación del protocolo de referencia para el análisis de aminoácidos
transmisores

Estandarización de la sensibilidad del método durante pruebas preliminares

Al evaluar las intensidades de 100 y 50nA (datos no mostrados), se observó
una detección deficiente de los aminoácidos transmisores en solución acuosa
(1μM). Mientras que la intensidad de 20nA produjo una señal adecuada para los
derivatizados, tanto desde el punto de vista de detección de los picos, como de
limpieza de la línea base. Más adelante, se muestran los cromatogramas obtenidos
a esta sensibilidad.

Identificación de los tiempos de retención asociados a aminoácidos
transmisores y evaluación de la resolución del método

Las primeras evaluaciones resultantes (cuadro 4) de la inyección de
aminoácidos en solución acuosa (1μM) mostraron los siguientes tiempos de
retención para cada aminoácido:

Cuadro 4. Tiempos de retención aproximados de cada aminoácido transmisor por
separado en fase móvil (25% metanol, pH 4,5), a una sensibilidad de 20nA, a
temperatura ambiente (25,4 + 0,05°C).

Aminoácido transmisor Tiempo de retención (minutos)
Glutamina 7,9
Taurina 7,9
Glutamato 10,6
Arginina 11,7
GABA 20,8

Como se puede apreciar en el cuadro 4 y la figura 20, bajo las condiciones
cromatográficas del protocolo de referencia, ocurre un traslape entre los
aminoácidos taurina y glutamina. Sin embargo, GABA y glutamato no presentan
traslapes aparentes con el resto de los aminoácidos.

70

Figura 20. Cromatograma de los cinco aminoácidos evaluados y sus respectivos tiempos de
retención, a una temperatura de 25,4+1°C; un flujo de 0,65ml/min, un potencial de 850mV; y
una intensidad de 20nA. De izquierda a derecha, se observan los picos traslapados de la
Glutamina y la Taurina; y los picos únicos, del Glutamato, la Taurina y el GABA.

Al aplicar las fórmulas (indicadas en la sección metodológica), para
determinar la resolución de cada aminoácido, se obtiene que el factor de resolución
(R) es mayor a 1 en la mayoría de los casos exceptuando para Taurina y Glutamina
(cuadro 5).

Cuadro 5. Valores de R de cada aminoácido e interpretación obtenidos según la
fórmula: R= 2 * [(T
R
)
B
-(T
R
)
A
/ W
A
+ W
B
)
Aminoácidos Valor de R Interpretación
Tau-Gln 0 Se traslapan
Tau/Gln-Glu 3,64 No hay traslape
Glu-Arg 1,56 No hay traslape
Arg-GABA 11,01 No hay traslape

No obstante, al realizar inyecciones de blancos (agua desionizada sin
aminoácidos) con reactivo de derivatización (0,8μL de solución de derivatización;
con OPA 43mM /mL) se observó un tiempo de retención para este reactivo de 20
minutos, a una temperatura de 26,0 ± 1°C. Posteriormente, al realizar inyecciones
de soluciones acuosas de aminoácidos (1-100μM) se observó el mismo tiempo de
retención para GABA (derivatizado con 0,8μL de solución de derivatización; con
OPA 43mM /mL), a una temperatura de 26,1°C (figura 21). Lo anterior, indica que el
valor de R para GABA respecto a OPA es de 0.

71

Figura 21. Interferencia entre los picos de GABA (100μM) y OPA (43mM), a una temperatura
de análisis de 26,0 ± 1°C; un flujo de 0,65ml/min, un potencial de 850mV; y una intensidad
de 20nA

4.2 Evaluación de la resolución del método en homogeneizados de cerebro

La evaluación del protocolo en homogeneizados de corteza temporal de
cerebro, demuestra el pico poco resuelto en el tiempo de retención correspondiente
al glutamato. La baja selectividad de este método en cuanto a este neurotransmisor
aminoacídico, impide su cuantificación. En la figura 22, se muestra el cromatograma
obtenido del análisis de homogeneizados de corteza temporal de cerebro.










Figura 22. Cromatograma de homogenizados de corteza temporal de cerebro de rata, bajo
las condiciones cromatográficas del protocolo de Rowley (1995). En azul, se muestra el
cromatograma resultante de la evaluación del método en homogeneizados de cerebro de
rata. En rosado, se presenta el patrón contra el cual, se compararon los tiempos de retención
de los picos incógnita del homogeneizado. La temperatura de análisis fue de 27,0 + 0,5°C; el
Tau-Gln
Glu
Arg
GABA/OPA
GABA
OPA
Muestra
Patrón
72
flujo de 0,65ml/min, el potencial de 850mV; y la intensidad de 20nA. Composición de la fase
móvil: 25% metanol; pH: 4,5.

Debido a la baja resolución encontrada y a la potencial dificultad para
cuantificar los aminoácidos transmisores de interés, se plantearon modificaciones al
protocolo inicial y nuevas estrategias metodológicas, a fin de desarrollar un
protocolo que permitiera la cuantificación efectiva de GABA y glutamato. Los
resultados obtenidos en esta segunda fase de experimentación, se describen en
detalle a continuación.

4.3 Optimización del protocolo para el análisis de GABA y glutamato

-Análisis cualitativos:

Efecto de la concentración de metanol sobre la resolución de picos

Las cuatro concentraciones de metanol evaluadas, mostraron amplias
variaciones en los tiempos de retención de los aminoácidos y en el tiempo total de
corrida. Si se comparan los resultados obtenidos a concentraciones de metanol
entre 22 y 27%, se observa una tendencia clara en la disminución de los tiempos de
retención (ver figura 23). No obstante, dicha tendencia es variable en puntos
intermedios. El cuadro 6, resume los tiempos de retención obtenidos a temperatura
ambiental y el orden en el que aparecen los aminoácidos.

Cuadro 6. Tiempos de retención de cada aminoácido según la composición química
de la fase móvil. Temperatura de análisis 26-27°C.
Concentración
de MEOH
Tiempo de retención de cada aminoácido (minutos)
GLN GLU TAU ARG GABA
22% 7,4 8,9 7,9 10,9 19,6
23% 7,2 7,8 8,6 10,6 18,8
25% 7,8 10,23 7,8 11,24 19,7
27% 6,6 7,3 7,8 8,93 14,6

73
0
5
10
15
20
25
22% 23% 25% 27%
[%MEOH]
T
i
e
m
p
o

d
e

r
e
t
e
n
c
i
ó
n

(
m
i
n
)Glutamina
Glutamato
Taurina
Arginina
GABA

Figura 23. Comparación de las cuatro fases móviles creadas a concentraciones crecientes
de metanol (pH 4,5). La temperatura de evaluación fue de 26-27°C; el flujo de 0,65ml/min,
potencial de 850mV; e intensidad de 20nA. Abreviaturas: min: minutos; MEOH: metanol.

En las figuras 23 y 24, se observa que a una concentración de 23% metanol,
se obtiene la mejor separación y detección de todos los aminoácidos estudiados. Sin
embargo, a esta concentración de metanol, aun se da un leve traslape entre los
primeros tres aminoácidos: glutamina, glutamato y taurina (R<1).

Q T E R G


Q E T R G

Q/T E R G


QET R G



Figura 24. Cromatogramas representativos de cada concentración de metanol; a pH 4,5;
para cinco aminoácidos (100μM). Condiciones cromatográficas: temperatura: 26-27°C; flujo:
0,65ml/min; potencial: 850mV; intensidad: 20nA. Abreviaturas: Arginina: R; Glutamato: E;
Glutamina: Q; GABA: G; Taurina: T.



74
Efecto del pH sobre la resolución de los picos

Al analizar el efecto que tiene el aumento de los valores de pH en la fase
móvil seleccionada (23% metanol), se observa una tendencia decreciente de los
tiempos de retención de la mayoría de los aminoácidos, los cuales, se acercan a la
línea de frente (figura 25 y cuadro 7).

Cuadro 7. Comparación de los tiempos de retención de cada aminoácido según el
pH de la fase móvil.
pH Tiempo de retención de cada aminoácido (minutos)
GLU GLN TAU ARG GABA
4,0 11,0 8,3 7,9 11,9 20,8
4,5 8,6 7,2 7,8 10,6 18,8
5,0 7,7 7,2 8,2 11,0 17,3
5,5 5,9 6,6 7,9 10,5 11,7

El comportamiento descrito, puede apreciarse en el aminoácido GABA, el
cual, reduce 9 minutos su tiempo de retención, con el aumento del pH desde 4 a 5,5.
Del mismo modo, los tiempos de retención del glutamato y la glutamina, se acortan.
Sin embargo, este tipo de tendencia en la “migración” de los aminoácidos, no
pareciera aplicarse a la taurina. Este aminoácido, no parece tener una tendencia
clara en sus tiempos de retención, conforme se varía el pH. La taurina mantiene un
tiempo de retención cercano a los 7,9 ± 0,3 minutos, a lo largo del rango de pH
evaluado.

En general, el porcentaje de variación en los tiempos de retención de cada
aminoácido, al pasar de pH 4,0 a pH 5,5 es para Glu: 46.36%; Gln:20.48%; Tau:0%;
Arg: 11,76% y GABA:43.75%. En este sentido, las mayores variaciones en los
tiempos de retención con el cambio del pH, se observan en los aminoácidos
glutamato y GABA.

Otra consecuencia observada del cambio del pH de la fase móvil, es el
cambio en el orden, con el que aparecen los aminoácidos (figura 26). Así, se
observa que la taurina tiene el menor tiempo de retención a pH 4; la glutamina
posee el menor tiempo de retención a pH 4,5 y 5; y cuando se alcanza un pH de 5,5,
el aminoácido con menor tiempo de retención es el glutamato. Este último además,
migra desde una tercera posición a pH 4, a una segunda a pH 5. Finalmente, el
glutamato migra hasta una primera posición a pH 5,5, como se mencionó
anteriormente.
75

Los resultados obtenidos a pH 6 (temperatura >24°C), mostraron traslapes
significativos entre la Glutamina y el Glutamato y entre la Arginina y el GABA
(resultados no mostrados).

0
5
10
15
20
25
4 4,5 5 5,5
pH
T
i
e
m
p
o

d
e

r
e
t
e
n
c
i
ó
n
Glutamina
Glutamato
Taurina
Arginina
GABA

Figura 25. Gráfica comparativa de las fases móviles de igual concentración de metanol
(23%) y diferente pH para cinco aminoácidos (100μM). Temperatura: 24,5-26,°C; flujo:
0,65ml/min; potencial: 850mV; intensidad: 20nA.

En la figura 26, se puede observar el efecto que tiene el pH sobre los tiempos de
retención de los aminoácidos. Asímismo, se puede observar un cambio en la
detección de los mismos a una misma intensidad de corriente (20nA).



T Q E R G
Q T E R G
Q E T R G
E Q T R G

Figura 26. Cromatogramas representativos de cada pH; en fase móvil al 23% de metanol
para cinco aminoácidos (100μM). Condiciones cromatográficas: temperatura: 26-27°C; flujo:
0,65ml/min; potencial: 850mV; intensidad: 20nA. Abreviaturas: Arginina: R; Glutamato: E;
Glutamina: Q; GABA: G; Taurina: T.

76
Selección de la mejor fase móvil

En esta segunda fase de experimentación, se logró el desarrollo de tres
fases móviles potenciales para la cuantificación de aminoácidos transmisores. Los
tres mejores métodos incluyen la utilización de las siguientes fases móviles: 23%
Metanol, pH 5,0; 23% Metanol, pH 5,5; y 27% metanol, pH 4,5. La concentración de
sales utilizada en la preparación de las tres soluciones, es la misma descrita en el
protocolo de referencia. Como se mencionó en la sección metodológica, los criterios
para la elección de la mejor fase móvil fueron: resolución de los picos,
correspondientes a GABA y Glu (concediéndole también cierta prioridad al
aminoácido Gln); tiempo total de corrida, tiempo de retención de los picos
contaminantes de la solución de derivatización (los cuales no debían ser
interferentes) y mejor resolución en homogeneizados de cerebro de rata. Con base
en los criterios de selección, a continuación se muestran los cromatogramas
correspondientes a las tres mejores fases móviles desarrolladas, a temperaturas
óptimas de corrida.




Q E T R G
E Q T R G

Q E T R G



Figura 27. Cromatogramas de las tres mejores fases móviles desarrolladas. En azul: fase
móvil al 23%MEOH;pH 5,5; temperatura 18,1°C. En café: fase móvil al 23%MEOH, pH 5,0;
temperatura 16,7°C. En rosado: fase móvil al 27%, pH 4,5; temperatura 21,2°C. Condiciones
cromatográficas generales: Flujo: 0,65ml/min; potencial: 850mV; intensidad: 20nA
Abreviaturas: Arginina: R; Glutamato: E; Glutamina: Q; GABA: G; Taurina: T.

El orden de los aminoácidos, con el cambio del pH o la concentración de
metanol cambia más frecuentemente en los primeros tres aminoácidos. Por otro
lado, el orden de los aminoácidos en las fases móviles a distinto pH y porcentaje de
metanol, puede ser el mismo, tal y como sucede con las fases móviles: 27%
MEOH,pH: 4,5 y 23%, pH 5,0.
77

Cuadro 8. Comparación de las tres mejores fases móviles desarrolladas y del
protocolo de referencia. Temperatura de evaluación: 21,0+ 1°C.
Protocolo

Tiempo total
de corrida
(minutos)
Valor general
de la
Resolución(R)
Traslapes
entre
aminoácidos
Interferencias
por OPA
23% MEOH; pH 5,5 17,0 >1 no no
23% MEOH pH 5,0 24,5 <1 si no
27% MEOH; pH 4,5 23,0 ≥1 no no
25%MEOH,pH 4,5 20,0 <1 si Si, en GABA

En el cuadro 8, se observa que la fase móvil de mejores características es
aquélla que tiene una composición de 23% de metanol y pH 5,5. Esta fase móvil
exhibió el mejor tiempo de corrida y la mejor resolución, de los aminoácidos sin
interferencias por OPA, a una temperatura de 21,0 ± 1°C.

Pruebas preliminares en cerebro de rata

Los resultados obtenidos al realizar corridas de muestras en
homogeneizados de corteza temporal de rata, utilizando la fase móvil de mejores
características (23%MEOH, pH 5,5), muestra un pico de GABA con un leve traslape.
Los picos de Glu y Gln se ven interferidos por un componente desconocido. Estos
picos, pueden apreciarse en tiempos de retención de 8,9 y 9,9 minutos
respectivamente. El GABA por su parte, tiene un tiempo de retención de 20,6
minutos (figura 28).

Figura 28. Cromatograma de una muestra de corteza temporal diluída 1/10. Condiciones
cromatográficas: 23% MEOH; pH 5,5; flujo 0,65ml/min; temperatura:8,1°C, potencial:850Mv.
La temperatura de corrida del patrón fue de 9°C.
GABA
Glu
Gln
Muestra
Patrón
78
Efecto de la temperatura sobre el pH de una fase móvil

Las evaluaciones consecutivas de temperatura y pH permitieron evaluar el
efecto que tiene el incremento de la temperatura sobre el pH de la fase móvil,
durante su preparación. Aún cuando la relación pH vrs temperatura fue variable, las
mediciones realizadas indican que el pH puede disminuir 0,01 puntos por el
aumento mínimo de 0,1°C. Sin embargo, ciertos puntos de pH se mantuvieron
estables inclusive cuando el incremento era de 0,6°C en la temperatura. El pH y la
temperatura se comportan de forma inversa. Es decir, que cuando aumenta la
temperatura, disminuye el pH y viceversa (figura 29).

5,45
5,5
5,55
5,6
5,65
5,7
5,75
0 5 10 15 20
Temperatura
p
H

Figura 29. Representación gráfica de la relación entre pH y temperatura. La figura muestra
como disminuye el pH conforme aumenta la temperatura. Las mediciones fueron hechas con
una fase móvil con metanol al 23%.

Efecto del cambio en la temperatura sobre los tiempos de retención

Como se muestra en la figura 30, el tiempo de retención de los aminoácidos
estudiados disminuye al aumentar la temperatura. Es decir, que la temperatura y los
tiempos de retención, se comportan de manera inversa. Adicionalmente, los tiempos
de retención tienden a variar más con el cambio de la temperatura, conforme más
alejados están de la líne de frente, tal y como sucede con los picos de los
aminoácidos arginina y GABA.


79

0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 5 10 15 20
Tiempo de retención (min)
T
e
m
p
e
r
a
t
u
r
a

(
°
C
)
Glutamato
Glutamina
Taurina
Arginina
GABA

Figura 30. Gráfica del comportamiento de los tiempos de retención de cada aminoácido
frente a variaciones en la temperatura.

En estudios posteriores, se observó que cuando la temperatura ascendía por
arriba de 26°C, se originaban traslapes entre glutamato y glutamina. Se observó
además, una adecuada separación de los picos correspondientes a los aminoácidos
de interés, en un rango de 17°C-23°C.


Efecto del índice de flujo sobre los tiempos de retención

Como se esperaba, la disminución en los índices de flujo (figura 31) provoca
un aumento en el tiempo de análisis, pero mejora la definición de los picos y permite
resolver un poco más los dos primeros aminoácidos (Glutamato y Glutamina) entre
sí y de la línea de frente. La mejor definición se obtuvo a un flujo de 0,45ml/min, a
una temperatura de 17 ± 0,5°C. con un tiempo de análisis de 20 minutos
aproximadamente.



80
Figura 31. Cromatogramas de la misma fase móvil (23% metanol, pH 5,5) realizados a
diferentes flujos (en mL/min) para los cinco aminoácidos (100mM); intensidad de
corriente:20nA; potencial 850mV.

Reajuste de la intensidad de corriente aplicada en la detección

Utilizando una sensibilidad mixta 10-50nA, cada uno de los picos de los seis
aminoácidos, pudieron ser analizados en una misma corrida como se observa en la
figura 32. El cuadro 9, resume los resultados obtenidos a las distintas sensibilidades.

Cuadro 9. Relación entre la intensidad aplicada y la respuesta en Mv.s de los
transmisores: glutamato, glutamina y GABA.
Aminoácido
Transmisor
Respuesta (mV.s) a distintas intensidades aplicadas
10nA 10/20nA 20/50nA 10/50nA
GLU
(435 μmol/L)
20,279 20,888 11,341 20,280
GLN
(438 μmol/L)
47,493 46,380 20,388 49,412
GABA
(1455μmol/L)
f.r f.r 180,136 217,512
f.r: fuera de rango








81
10nA 50nA



Tau

GABA
Gln
Glu Arg



Figura 32. Intensidad de corriente óptima para el análisis de Glutamato, Glutamina y GABA
(En el cromatograma: primero, segundo y último pico respectivamente). Los primeros 12
minutos se realizaron a una intensidad de 10nA y el resto del tiempo a una intensidad de
50nA.

- Análisis Cuantitativos:

Efecto de la concentración de OPA sobre la detección química de aminoácidos

Al comparar las áreas relativas de los aminoácidos acuosos (100μM) en
matriz, marcados con concentraciones crecientes de OPA, se observa una variación
mínima de las áreas relativas correspondientes a cada aminoácido,
aproximadamente a partir de los 14μL/mL (figura 33). Las áreas relativas de los
aminoácidos en matriz, presentaron fluctuaciones más notorias, cuando fueron
derivatizados con una cantidad de solución de derivatización menor que 14μL/mL.
Las variaciones de las áreas relativas se observaron también entre inyecciones
sucesivas de aminoácidos (100μM), derivatizados con exactamente la misma
cantidad de solución de derivatización (datos no mostrados).
82
0
10
20
30
40
50
60
70
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
μL de solución de derivatización (OPA 43mM)
por ml de patrón
%

Á
r
e
a

R
e
l
a
t
i
v
a
GLU
GLN
TAU
ARG
GABA

Figura 33. Respuesta comparativa porcentual de las áreas de los picos de los cinco
aminoácidos (100μM) por cromatograma, según la cantidad de μL de solución de
derivatización añadida. Sensibilidad: 20nA, potencial: 850mV ; flujo: 0,5ml/min; rango de
temperatura 17-23°C; composición de la fase móvil:23% MEOH; pH: 5,5.


Prueba de Veracidad (repetibilidad)

Las medidas estadísticas aplicadas en el análisis de los resultados obtenidos
tras inyecciones sucesivas de patrones acuosos aminoacídicos, de igual
concentración, se muestran en el cuadro 10.

Cuadro 10. Resultados obtenidos de las pruebas de repetibilidad en un solo día para
los distintos aminoácidos en matriz

Transmisor Promedio Porcentaje de
Variación
Desviación
Estándar
Desviación
Estándar
Relativa
Glutamato 0,014714 1,9 0,000469 3,19
Glutamina 0,014765 1,6
0,000599
4,06
GABA 0,014557 2,9
0,000516
3,54




83

Reajuste de la concentración de OPA para análisis de linealidad

El análisis de adiciones de reactivo de derivatización, no mostró variaciones
importantes, como aquéllas encontradas anteriormente en las áreas relativas de los
aminoácidos en matriz a menor concentración. La figura 34 muestra los resultados
obtenidos.

0
10
20
30
40
50
60
70
20ul 24ul 28ul 32ul 38ul 44ul
μL de solución de derivatización (OPA 43mM)
por ml de patrón
%

Á
r
e
a

R
e
l
a
t
i
v
a
GLU
GLN
TAU
ARG
GABA

Figura 34. La gráfica muestra una comparación entre las áreas relativas de los aminoácidos
por cromatograma, al variar la cantidad de solución de derivatización añadida (OPA 43mM).
Intensidad: 20nA, potencial: 850mV; flujo: 0,5ml/min; rango de temperatura 17-23°C;
composición de la fase móvil:23% MEOH; pH: 5,5.

Prueba de Linealidad

Tras la elaboración de curvas de calibración, se obtuvo una respuesta lineal
en todos los aminoácidos, entre la tercera y la sexta concentración (ver en
metodología, el cuadro 3) que corresponden a una concentración entre 363 y 45 μM
para GABA y entre 109 y 14 μM para Gln y Glu . El rango más amplio de linealidad,
con coeficiente de correlación satisfactorio, fue el de GABA, a partir de la segunda
(727 μM) y sexta (45 μM) concentración (cuadro 11 y figura 35).

En este sentido, si se comparan los coeficientes de correlación obtenidos en
los extremos superior e inferior del rango de concentración evaluado (cuadro 11 y
12), se observan diferencias notables. Al evaluar las cuatro concentraciones
mayores (1-4) y menores (3-6) del rango, se observa en general, un coeficiente de
84
correlación significativamente mayor en el extremo inferior del rango. El mismo
fenómeno se observa al comparar el coeficiente de correlación de cinco
concentraciones que forman parte de los extremos superior (concentraciones: 1-5) e
inferior (concentraciones: 2-6) del rango.

En síntesis, los coeficientees de correlación aumentan conforme se
disminuye la concentración del analito.

Además, se observa una coincidencia entre el aumento de la concentración
de OPA y el incremento en el valor del coeficiente de correlación de los aminoácidos
(cuadro 11).

Si se comparan los coeficientes de correlación, de las curvas de linealidad
que incluyen desde la cuarta a la sexta concentración de aminoácidos, obtenidas a
concentraciones de OPA distintas (43-86mM), se observa en general, un coeficiente
de correlación más alto a 86mM de OPA.

Por otro lado, si se comparan los coeficientes de correlación obtenidos a
diferentes concentraciones de OPA, del cuadro 12, se observa que GABA posee los
coeficientes de correlación más altos y que estos aumentan a concentraciones de
OPA de 86mM. Asimismo, el coeficiente de correlación de Glu se incrementa, con el
aumento de la concentración de OPA, al evaluar las cinco concentraciones mayores
del analito.

No obstante, el coeficiente de correlación de Glu disminuye, al evaluar las
cuatro concentraciones mayores. Del mismo modo, los coeficientes de correlación
de Gln disminuyen tanto en las evaluaciones de cuatro como de cinco
concentraciones mayores del analito.









85
Cuadro 11. Coeficiente de correlación asociado a cada transmisor, según la
concentración de OPA agregada (puntos inferiores de la curva de linealidad)

Aminoácido
Transmisor
Coeficiente de Correlación μL de solución
de
derivatización
/concentración
OPA
A cuatro
concentraciones
menores de
analito
A cinco
concentraciones
menores
de analito
A seis
concentraciones
de analito
Glutamato 0,9987197 0,7409657 0,3462974 22 μL/43mM
Glutamina 0,9998062 0,8840145 0,644877 22 μL/43mM
GABA 0,996997 0,9994006 0,932202 22 μL/43mM
Glutamato 0,9983952 0,9563667 0,456044 22 μL/86mM
Glutamina 0,9984961 0,9769898 0,6102978 22 μL/86mM
GABA 0,9985169 0,9997001 0,9664556 22 μL/86mM

Cuadro 12. Coeficiente de correlación asociado a cada aminoácido, según la
concentración de OPA agregada (puntos superiores de la curva de linealidad).

Aminoácido
Transmisor
Coeficiente de Correlación μL de solución
de
derivatización
/concentración
OPA
A cuatro
concentraciones
mayores de
analito
A cinco
concentraciones
mayores
de analito
A seis
concentraciones
de analito
Glutamato 0,1271719 0,1701739 0,3462974 22 μL/43mM
Glutamina 0,4053104 0,5661935 0,644877 22 μL/43mM
GABA 0,9051195 0,9219868 0,932202 22 μL/43mM
Glutamato 0,1133958 0,331529 0,456044 22 μL/86mM
Glutamina 0,3571781 0,5227769 0,6102978 22 μL/86mM
GABA 0,9548216 0,962167 0,9664556 22 μL/86mM







86
A.

B.

C.


Figura 35. Curvas de linealidad de las cuatro últimas concentraciones de Glutamato (A) y
Glutamina (B) en matriz, y de las últimas cinco de GABA (C); derivatizadas con 22 μL de
solución de derivatización (OPA 86mM).

87
Efecto de la matriz general

Al realizar las derivatizaciones de cada aminoácido individual, para
determinar la curva de linealidad de cada uno de ellos; y al utilizar la misma
concentración de OPA y condiciones cromatográficas, que las utilizadas para el
estudio de linealidad en matriz de aminoácidos, se encontró una respuesta (en
mV.s) incrementada de los analitos derivatizados. Lo último, provocó que todas las
concentraciones evaluadas se salieran del rango, con excepción de las dos últimas
de Glutamato.



Condiciones cromatográficas óptimas recomendadas:

Detector electroquímico: Waters 464 pulsed
Bomba: Waters 515 HPLC
Columna de separación: Spherisorb® ODS1 C18, fase reversa (5μm, 250 * 4,6
mm)
Fase móvil: 0,5mM EDTA; 0,1M Buffer Fosfato monobásico; 23% metanol, llevada
a pH 5,5 con Ac. Fosfórico (5M).
Flujo: 0,45ml/min
Volumen del loop: 50μL
Volumen inyectado: 100 μL.
Temperatura: 18-23°C, con sistema de enfriamiento
Potencial aplicado: 850mV
Intensidad de corriente del electrodo de trabajo: 10nA (durante primeros 12 min)
a 50nA (hasta el final de la corrida).
Tipo de circulación de la fase móvil: circuito cerrado
Integración: por estándar externo
Determinación de la respuesta: por área del pico






88
5. DISCUSIÓN

Las primeras pruebas realizadas para este trabajo fueron diseñadas de tal
forma que permitieran una familiarización con el método. Sin embargo, la falta de
indicaciones en el artículo de referencia tales como el valor de la intensidad de
corriente utilizada, la temperatura bajo la cual se preparó la fase móvil y la tasa de
concentración del analito por concentración de OPA, creó ciertas dificultades al
inicio de la estandarización del protocolo.

La dificultad más clara fue la definición de la concentración del reactivo de
derivatización por concentración de aminoácido y grupo de aminoácidos. La
cantidad de OPA sugerido por Rowley, et al (1995) es de 20μL (OPA 86mM), para
un estándar de aminoácidos. Utilizando esta cantidad de reactivo, al inicio de la
primera fase experimental (evaluación del protocolo); se observaron una gran
cantidad de picos que no correspondían a los de cada aminoácido analizado. Este
tipo de contaminante aparecía en corridas de hasta 95 minutos (datos no
mostrados).

Sabiendo que el OPA podría ser el causante de la presencia de picos
fantasma en el cromatograma (Rowley et al, 1995), se varió la cantidad del reactivo
de derivatización de 20 a 0,4 μL de reactivo de derivatización por mL. Esta cantidad
era sugerida en el protocolo de referencia (Rowley et al; 1995), para el marcaje de
microdializados. Dado que la cantidad de OPA que sería pesada por día
correspondía a la mitad de la sugerida en el protocolo (con el fin de evitar
desperdicios), se utilizó el equivalente de dicha cantidad, es decir, 0,8μL de reactivo
de derivatización por mL de aminoácido único.

Por otra parte, los aminoácidos en matriz fueron sometidos a
derivatizaciones cercanas a los 0,8μL solución de derivatización (OPA 43μM) / mL
de solución estándar (cantidades evaluadas: 2,0 y 5,0uL/mL). A partir de estos
análisis, se observó que la cantidad más adecuada era de 2μL por mL de solución
acuosa de aminoácidos, ya que no producía contaminaciones aparentes en el
cromatograma y permitía el marcaje de los aminoácidos y, eventualmente, permitiría
la evaluación de la resolución del método.

89
Una estrategia utilizada para definir la cantidad de microlitros de reactivo de
derivatización utilizados, fue la inyección de blancos con solución de derivatización.
Esto se hizo con el fin de identificar los posibles tiempos de retención del reactivo.

Además, se buscó que la cantidad de reactivo utilizada no produjera
contaminación de la línea base y que, además marcara químicamente al analito o
grupo de ellos, dejando para más tarde el problema de si la concentración de OPA
era adecuada para la cuantificación de cada aminoácido.

Asímismo, al inicio del trabajo práctico, se contempló la posibilidad de
realizar corridas sin derivatizaciones previas. Sin embargo, los resultados obtenidos,
a concentraciones 1μM de aminoácido, señalaban la necesidad de utilizar
intensidades de corriente menores a 10nA. A este nivel de sensibilidad, la calidad de
la línea base empezaba a disminuir y los picos logrados no eran todavía lo
suficientemente notables o visibles, para ser analizados con precisión.

Tal y como se expone en la revisión de literatura, la alta calidad de detección
observada con el uso del reactivo de derivatización, se debe a la facilidad con la
cual se oxidan los aminoácidos marcados en su paso por el electrodo de carbón
(Arslan, O; 2001; Webster; 2001; Jacobs, 1987). Por ende, la derivatización de
aminoácidos permitió obtener respuestas de alta calidad de detección, con picos
bien definidos (semejantes a triángulos) y una línea base con poco o ningún ruido
(debida a la aplicación de intensidades mayores: 10-20-50nA).

Con el objetivo de lograr respuestas cromatográficas de alta calidad y una
mayor estabilidad de los productos derivatizados, los investigadores han realizado
derivatizaciones con moléculas que poseen grupos mercapto (-SH) en su estructura,
tales como los tioles: β-mercaptoetanol (β-ME) y el tert butil tiol (Rowley et al, 1995).
Estos grupos actúan como cofactores de la reacción (ya que son agentes
reductores), incorporándose a la estructura del derivatizado en conjunto con el OPA
(figura 36) (Schalkhammer, 2002; Giddings, 1984).






90








Fig 36. Producto de la reacción entre OPA, β-ME y una amina primaria.
Modificado de: Schalkhammer; 2002.

Sin embargo, el tipo de interacción lograda entre OPA y un aminoácido, en
presencia de un grupo sulfito, descrito por Rowley (1995), ofrece una ventaja sobre
las derivatizaciones realizadas en presencia de grupos tiol. Por un lado, las
derivatizaciones en presencia de β-mercaptoetanol producen derivatizados
inestables en el tiempo, lo que limita la aplicabilidad del método (Acworth, 1997).
Para mejorar la precisión y exactitud de la cuantificación de aminoácidos en
presencia de este tiol, debe vigilarse cuidadosamente el tiempo de reacción, que es
de aproximadamente 1-3 minutos (Acworth, 1997; Boulton, 1985; Giddings, 1984).
Por otra parte, los tioles, son sustancias muy volátiles con olores penetrantes que
podrían ser molestos durante las labores cotidianas. En este sentido, el uso de OPA
en presencia de sulfito, produce compuestos derivatizados de mayor estabilidad en
ausencia de olores penetrantes que resulten incómodos durante el trabajo (Acworth,
1997).

La figura 37, muestra la reacción entre un grupo sulfito, OPA y un
aminoácido. Al igual que los tioles, el grupo sulfito se incorpora al producto principal
de la reacción, liberando un grupo hidroxilo (-OH), de uno de los dos grupos
carboaldehído (-CHO) de la molécula de OPA. A continuación, la amina primaria del
aminoácido forma un enlace covalente con el carbono expuesto de OPA. El
hidrógeno expuesto de la amina primaria, reacciona con el grupo carboaldehído
(-CHO) de OPA, liberándose una molécula de agua. La molécula resultante es un
isoindol (Rowley et al 1995; Jacobs, 1986).





91







Fig 37. Representación de la reacción química entre OPA, un grupo sulfito y un aminoácido.
La molécula final corresponde a un grupo N-alquilo-1-isoindol sulfonatoFuente: Jacobs,
1986.

La estabilidad descrita para los derivatizados de OPA en presencia de un
grupo sulfito, constituye otra de las razones principales, por las cuales, se eligió el
protocolo de Rowley et al (1995) como protocolo base para este trabajo.

Por otra parte, la magnitud de la reacción no depende solamente de la
estabilidad de los derivatizados sino también del pH alcalino (pH 8-11) (Phyllis,
1997). Otro factor importante en el desarrollo de la reacción es la concentración de
OPA. En los análisis de estabilización de las áreas relativas (figura 34) se observa
una mayor afinidad entre el aminoácido GABA el OPA. De hecho, los primeros
puntos de la curva demuestran como el área relativa de GABA es comparativamente
mayor a la del resto de los aminoácidos. También se observa que conforme se
aumenta la cantidad de μL de OPA, las áreas relativas de GABA decrecen
paulatinamente hasta estabilizarse. El fenómeno contrario se observa con las áreas
de glutamato y glutamina, es decir, un crecimiento comparativo de las áreas seguido
de una estabilización posterior.

La lógica del ensayo del porcentaje de áreas relativas según la concentración
de solución de derivatización agregada, reside en el rendimiento de la reacción. Es
decir, que si las áreas de los analitos se estabilizan probablemente se deba a que la
reacción entre este reactivo y los aminoácidos llegó a su punto máximo, a medida
que se aumenta la concentración de OPA.

El uso de representaciones gráficas con estabilización de áreas, a pesar de
ser un dato cualitativamente útil, no tiene valor estadístico. En la figura 34, se puede
observar, una respuesta relativamente uniforme en las áreas relativas de cada
aminoácido al comparar, la cantidad de 44μL con aproximadamente la mitad de la
cantidad agregada (20μL/mL). La concentración final de OPA obtenida (1,9mM) al
agregar 44μL de solución de derivatización (OPA 43mM) en un mililitro de solución
92
de aminoácido, corresponde a una concentración de OPA cercana a la propuesta en
el artículo (1,72mM). Por otro lado, la concentración final de OPA, obtenida al
agregar 20μL de solución de derivatización (OPA 43mM) en un mililitro de solución
acuosa de aminoácidos, corresponde exactamente a la mitad de la concentración
propuesta por Rowley (0,86mM).

Basados en los resultados obtenidos, se construyeron curvas de linealidad
en ambos extremos de concentración de OPA, lo que permitió corroborar finalmente,
que existe una diferencia en el marcaje de analitos a concentraciones distintas.

Los coeficientes de correlación que fueron mayores con OPA 86mM (cuadro
11) sugieren que esta concentración es la mejor para obtener una mayor linealidad
para cada aminoácido. Esto probablemente se deba a un mayor marcaje de
aminoácidos a las concentraciones más altas del rango.

Como es de esperar, para un análisis de linealidad, hay una correspondencia
entre la concentración del aminoácido analizado y el área del pico correspondiente:
en este caso particular, a medida que aumenta la concentración aumenta el área del
pico. Los coeficientes de correlación muestran que la mejor linealidad se obtiene con
una concentración de OPA de 86mM (cuadro 11). Al disminuir la concentración del
aminoácido, aumenta el OPA disponible para la reacción y por lo tanto aumenta
también el marcaje de los aminoácidos a analizar.

Debido a que los demás componentes del reactivo de derivatización se
mantuvieron constantes, al variar la concentración de OPA, se puede asegurar que
el efecto observado en la detección de los aminoácidos, se debe exclusivamente a
los cambios en la concentración de OPA y no a cambios de alcalinidad.

Por otro lado, el aumento de la concentración de OPA y de la cantidad de
buffer tetraborato, deben ser manejados con cuidado, porque podrían ocasionar
daños estructurales en la columna, cuyo rango de trabajo se encuentra a un pH
entre 2,5-8. Una alcalinidad mayor puede causar la disolución de la sílica, que
compone la columna de separación (Nollet; 2004).

Las primeras evaluaciones del protocolo de referencia en homogeneizados
de cerebro (figura 24), comparadas con las que fueron realizadas en matriz blanca
de aminoácidos no fueron satisfatorias debido a que no se observó una buena
93
separación de los analitos de interés de otros componentes desconocidos de la
muestra. Para tratar de solventar este problema, podrían variarse ciertas
condiciones de análisis entre otras: la composición química de la fase móvil (i.e.
quelante, proporción agua/metanol, pH), el flujo de corrida (reducción); la
temperatura (disminución).

La fase móvil está compuesta por diversas sustancias, cada una de las
cuales, con una función muy específica: quelantes de iones (en este caso EDTA);
buffer (fosfato monosódico) y metanol.

Los quelantes limitan la formación de complejos entre iones metálicos
electroactivos, que pueden estar presentes en el eluente, en el sistema HPLC o en
el empaque de la columna y causar contaminación del cromatograma. Por lo tanto,
el uso de EDTA, cuando se cuenta con un sistema de detección electroquímica,
favorece la calidad de la línea base (Ganguly, 1991).

El otro componente de la fase móvil, el buffer fosfato, evita variaciones
significativas en el pH de la fase móvil tras la inyección de soluciones de
aminoácidos de mayor o menor pH.

Por otra parte, el uso de diferentes proporciones de agua/metanol permite
variar gradualmente la polaridad de la fase móvil. Por ejemplo, el índice de polaridad
del agua es de 10,2; mientras que el índice de polaridad del metanol es de 5,1 (Fung
Ho et al; 2000). Este índice, da una idea de la capacidad de un solvente de eluir un
componente en la columna. En la técnica de cromatografía en fase reversa, la
retención de los compuestos se basa en una atracción primaria entre la fase
estacionaria y la región no polar del analito. El orden de elución de los componentes
irá de más hidrofílico a más hidrofóbico. Por ello, para aumentar la retención de un
compuesto se debe aumentar la polaridad de la fase móvil (figura 25).

Otro elemento que altera las características químicas de la fase móvil es el
pH. Como se observa en la figura 27 el aumento en el valor de pH, produce una
disminución de los tiempos de retención de los aminoácidos analizados.

Según, Blackburn (1987), este efecto es mayor en aquellos aminoácidos que
presentan un grupo carboxílico en su cadena lateral. Por ejemplo, el rango de pH
bajo el cual se observan estos efectos, es consistente con la disociación ácida del
94
grupo carboxilo de la cadena lateral del Glutamato (pk
R
=4.25). El hecho que el
glutamato sea el primer aminoácido en eluir de la columna con el aumento del pH a
5,5, significa que tiene una mayor afinidad por la fase móvil, a este pH . Debido a
que el glutamato posee dos cargas negativas y una positiva en este punto de pH, es
decir, una carga neta de -1. Esta carga, podría favorecer el tipo de interacciones que
pueden darse entre el glutamato, el agua y el metanol, tal como la formación de
puentes de hidrógeno. Aunado a esto, la desprotonación del grupo carboxilo delta
podría ser la causa del debilitamiento de las interacciones con la fase estacionaria
C18, al aumentar los valores de pH. En resumen, como consecuencia de las fuerzas
descritas, el glutamato presenta un tiempo de retencion corto.

Siguiendo el orden de elución, el segundo aminoácido detectado es la
glutamina. La glutamina es un aminoácido polar con cadena lateral neutra, que
posee una carga positiva (pKαNH3
+
=9,13) y otra negativa (pKαCOOH=2,17), a pH
5,5; lo que le confiere una carga neta de 0 (Stenesh, 1998). La semejanza
estructural entre la glutamina y el glutamato y la ausencia de una carga neta a un pH
de 5,5 podría explicar el hecho de que esta molécula ocupe el segundo lugar de
aparición dentro del grupo de aminoácidos evaluados.

Los últimos analitos en eluir son en su orden: la taurina, la arginina y el
GABA.
Por un lado, la taurina (tercer analito); es un ácido orgánico, porque posee un
grupo sulfonato (Timothy, et al; 1998). A pH 5,5 el grupo amino de la taurina se
encuentra protonado, pero como no posee un grupo alfa carboxilo, como los otros
aminoácidos, sino un grupo sulfonato, esto podría permitirle cierta interacción con la
fase móvil, por medio de la formación de puentes de hidrógeno.

La arginina, por su lado, es un aminoácido de naturaleza polar, posee dos
cargas positivas a un pH de 5,5, correspondientes a los dos grupos amino
(pKαCOOH=2,17 ; pKαNH3
+

= 9,04; grupo guanidino, pK
R
= 12,48) (Stenesh, 1998).
Dichas cargas positivas, podrían fortalecer la interacción con la fase estacionaria de
la columna, causando una retención comparativamente mayor, con glutamato,
glutamina y taurina.

Por último, el quinto aminoácido en eluir, el GABA, tiene una carga neta de 0
a pH 5,5; se caracteriza por ser la molécula más pequeña de las anteriormente
mencionadas y por tener un pKαNH3
+
= 10,5. Además, carece del grupo alfa
95
carboxilo. El tiempo de retención del GABA podría deberse a la polaridad reducida
que le confiere su estructura química, la cual, consiste en un grupo amino y un
grupo carboxilo distribuidos en extremos opuestos del esqueleto de carbono
(Williams, 2003).

Con base en los argumentos expuestos, la migración diferencial de los
aminoácidos, a un pH de 5,5; utilizando una fase estacionaria de sílica y una
concentración constante de metanol al 23%, podría atribuirse a dos factores
principalmente: a los valores de la carga neta del aminoácido, asociado a la
capacidad de cada molécula para donar o aceptar protones a pH 5,5; y al grado de
polaridad de cada aminoácido, que le confiere una mayor o menor interacción con la
fase C18 estacionaria y/o una mayor o menor solubilidad en la fase móvil metanol
(23%):agua.

Según, Blackburn (1989); bajo características similares de pH (5,7); fase
móvil (agua: metanol) fase estacionaria (C8), y condiciones isocráticas, el orden de
elución de aminoácidos es el siguiente: 1) aminoácidos ácidos, 2) básicos, 3)
aminoácidos con cadena lateral de grupo alquilo y 4) aminoácidos hidrófobos. Esto
concuerda, con los resultados obtenidos en este trabajo.

En la figura 38, se muestra un estudio realizado (Rea, et al; 2005); bajo una
escala de pH similar a la estudiada en este trabajo. Nótese el acortamiento en los
tiempos de retención de GABA y glutamato, bajo condiciones de fase móvil distintas
(70 mM de fosfato disódico; 400 μM EDTA, 0.15% (v/v) tetrahidrofurano y 30%
metanol). La taurina también presenta un comportamiento similar al obtenido bajo el
protocolo descrito en este trabajo.









Figura 38. Corridas realizadas bajo los mismos valores de pH evaluados pero bajo
condiciones cromatográficas y de fase móvil distintas. Fuente: Rea, et al; 2005.
96

El protocolo desarrollado en este trabajo, posee diversas ventajas sobre
otros protocolos publicados (Rea, Rowley,).

La mayoría de los protocolos revisados (Zhang et al, 2005; Bianchi et al,
1999), no recirculan la fase móvil con el fin de evitar la contaminación de la misma,
lo que podría afectar el cromatograma resultante. Con el protocolo desarrollado en
este trabajo, se obtienen datos replicables, lineales, a pesar de que la fase móvil se
recirculó. Esto es de gran importancia, no solamente porque reduce e gasto en
reactivos, sino también, porque disminuye el tiempo de preparación de fase móvil
nueva. La vida útil, para una fase móvil de 250mL, alrededor de dos semanas, lo
que corresponde aproximadamente a 196 muestras.

Por otro lado, la elución de los aminoácidos es comparativamente más
rápida que la registrada en otros protocolos (Lasley et al; 1984; Zhang; 2005) (20
minutos a 0,45mL/min), obteniéndose tiempos de corrida menores de un 63% y
hasta un 75%.

Como consecuencia directa de esto se pueden inyectar un número mayor de
muestras por día.

Asimismo, el protocolo permite la cuantificación de tres neurotransmisores: el
GABA, el glutamato y la glutamina, en una sola corrida, utilizando una bomba
isocrática. En otros trabajos, en los que se logra la resolución de estos tres
aminoácidos, se logra utilizando gradientes de solvente, para lo cual se necesita de
una bomba binaria (Zhang et al, 2005; Bianchi et al, 1999). Este logro, demuestra
que el protocolo desarrollado es concordante con el equipo con el que se cuenta en
el programa de neurociencias.

En algunos trabajos, se ha visto la necesidad de llevar a cabo un lavado de
la columna (Lasley,et al; 1984), utilizando diferentes solventes, después de cada
inyección, para evitar interferencia de algunos aminoácidos con tiempos de
retención superiores que podrían quedar atrapados dentro de la columna.
Posteriormente, esta columna debe ser reequilibrada para retomar las condiciones
iniciales para la siguiente inyección. El protocolo implementado en este trabajo, es
tal que no se requirió ni el lavado ni el reequilibrio de la columna durante los análisis.
97
Esto redunda en una disminución del tiempo requerido para el análisis de cada una
de las muestras.

Durante el desarrollo del protocolo resultante de este trabajo, se probaron
diferentes condiciones para el análisis de homogeneizados de cerebro de rata, como
se describió en la sección de resultados. Bajo esas condiciones experimentales, se
presentaron varios inconvenientes, que impidieron la obtención de resultados
adecuados para los analitos de interés.

Bajo las condiciones cromatográficas establecidas por Rowley (1995), se
observa una resolución deficiente de los picos correspondientes a glutamina y
glutamato, lo que impidió una cuantificación exitosa de los mismos. La causa de
este problema radicó posiblemente en la presencia de otros aminoácidos o
compuestos presentes en el tejido cerebral que no fueron tomados en cuenta,
inicialmente.

Ya en otros estudios (Cazes, 2001), se sugiere la adición de inhibidores de
proteasas a la solución en la que se introduce el tejido cerebral. Ésto podría
solucionar parcialmente este problema, impidiendo la proteólisis de proteínas
celulares y de esa manera, disminuiría la cantidad de aminoácidos libres que
podrían reaccionar con el OPA, produciendo interferencias.

Posteriormente utilizando algunos de los parámetros establecidos por
Rowley (flujo: 0,65ml/min; potencial: 850mV; intensidad: 20nA) y variando la
concentración de metanol de 25 a 23% y el pH de 4,5 a 5,5, se observó una leve
mejoría en la resolución de los cromatogramas, sin ser totalmente satisfactoria.
Datos posteriores no sistematizados (ver figura 39 en anexos), sugieren que se
deberían modificar algunas de las condiciones propuestas en los dos métodos
anteriormente mencionados, para optimizar los resultados. Por un lado,
disminuyendo la temperatura (5-7°C) a la cual se lleva a cabo la corrida y
reduciendo el flujo a 0,3ml/min.

Por otra parte, el método desarrollado no es muy robusto debido a que los
cambios en parámetros de temperatura, pH, metanol e índice de flujo, provocan
cambios en los tiempos de retención de los aminoácidos. Por esta razón, es
conveniente el seguimiento fiel de los parámetros establecidos como: la preparación
98
de la fase móvil y de la solución de derivatización y la aplicación de las condiciones
cromatográficas establecidas.

Es importante mencionar que la temperatura tiene un efecto sobre el tiempo
de corrida de los cromatogramas, a mayor temperatura menor tiempo. Al mismo
tiempo cabe notar que los neurotransmisores se ven afectados de manera
diferencial, por dichos cambios en la temperatura en cuanto a sus tiempos de
retención. Aquellos aminoácidos que se encuentran cerca de la línea de frente se
afectan en menor grado por los cambios de temperatura (glutamina glutamato y
taurina), que aquéllos que están más alejados de la línea de frente (GABA y
arginina). En este trabajo se estudiaron temperaturas desde los 10 a 26°C,
demostrándose que las temperaturas comprendidas entre 17 y 23 °C, proporcionan
una mayor confiabilidad en cuanto a la resolución de los picos y además, reducen el
tiempo de corrida.

Como se mencionó anteriormente, durante el proceso de preparación de la
fase móvil, fue necesario registrar la temperatura asociada al valor de pH de
resultados cromatográficos óptimos, con el fin de permitir la reproducibilidad del
método.

En este estudio se demostró que el pH óptimo para una buena separación de
los picos es de 5,5. Al mismo tiempo, se observó que leves cambios de temperatura
alteran el pH de esa fase móvil. Por esa razón, es que la preparación de la misma,
debe ser controlada la temperatura de manera exhaustiva, para obtener resultados
óptimos. Por lo tanto, se recomienda una temperatura de preparación aproximada
de 22,4°C. Es importante mencionar también que la temperatura no solamente
afecta el pH sino también el tiempo de corrida de manera inversa, es decir, a medida
que aumenta la temperatura disminuye el tiempo de corrida. Aunque esto puede ser
ventajoso para el análisis en corta duración de los aminoácidos, puede también
ocasionar el traslape entre ellos y además un acercamiento a la línea de frente del
cromatograma.

Por otra parte, para evitar la formación de precipitados que afectarían el
análisis cromatográfico posterior, la solución de derivatización debe prepararse
agregando los reactivos en el siguiente orden 1) OPA, 2) etanol, 3) sulfito de sodio,
y 4) tetraborato de sodio.

99
Otro punto que hay que tomar en cuenta para el buen funcionamiento del
reactivo de derivatización, es la refrigeración. Este reactivo va perdiendo su
actividad con el tiempo, si se mantienen en rangos de temperatura que oscilan entre
los 25 y 30°C aproximadamente. El mantener dicho reactivo en refrigeración permite
que la actividad del mismo se mantenga hasta tres días despues de su preparación.

Adicionalmente, parece ser indispensable el uso de agua desionizada para la
preparación de las soluciones de aminoácidos. Esto posiblemente, reduce la
formación de interacciones entre iones y aminoácidos, o bien entre iones y el
reactivo de derivatización, lo que en consecuencia promueve una línea base mucho
más estable y sin interferencias. Es recomendable además, la limpieza del inyector
con agua desionizada entre cada una de las inyecciones, para evitar la aparición de
picos fantasma en el cromatograma. Estos picos podrían ser el resultado de la
acumulación de solución de derivatización en el inyector; presencia de iones
electroactivos presentes en el mismo; y/o a la acumulación de otro tipo de
sustancias oxidables.

En las diferentes fases del experimento (estudios de repetibilidad y
linealidad) es muy importante realizar un procedimiento de limpieza sistemático,
también para viales de polietileno y puntas de micropipetas, para evitar variaciones
significativas en los resultados.

Para mejorar la repetibilidad del estudio, las soluciones que incluyeron los
cinco aminoácidos fueron realizadas únicamente en dos pasos: con una primera
dilución en un balón de 100mL y una dilución final en otro balón del mismo volumen,
con el fin de alcanzar la concentración deseada de 0,015μg/μL, lo que corresponde
a una concentración cercana a 100μM para cada uno de los aminoácidos.

Por otra parte, los rangos de concentración de cada aminoácido, utilizados
en las pruebas de linealidad, tomaron en cuenta los valores citados en la literatura
para cerebro de rata: 300-450 μM para GABA y 250 μM para glutamato y para
glutamina (Kasper, et al; 2003; Lasley, et al; 1985). Para GABA, se obtuvo un alto
coeficiente de correlación (r
2
= 0,999) dentro de un rango de concentración (45-
727μM) que incluye los valores citados en la literatura. Sin embargo, para glutamato
(14 a 435 μM) y glutamina (14-435 μM), el rango de concentración al cual se obtuvo
un coeficiente de correlación alto (r
2
=0,998) no incluye los valores citados en la
literatura. Por esta razón, es que se sugiere que a la hora de hacer el estudio de los
100
homogeneizados de cerebro, deben realizarse diluciones para que la concentración
de estos dos aminoácidos se encuentre dentro del rango de linealidad establecido
en este protocolo.

Con el fin de determinar si existe una diferencia en la detección de
aminoácidos individuales o en conjunto, en los estudios de linealidad se utilizó una
concentración de OPA 86mM. Se observó que para los aminoácidos individuales se
da una respuesta que excede, en la mayoría de los casos, el rango de detección
establecido (10-50nA), (exceptuando para glutamato a 14 y 27μM) pero para la
mezcla de aminoácidos, todos los picos se encontraban dentro de este rango de
detección. Demostrándose de esta manera, un efecto de matriz que debe ser
tomado en cuenta para futuros análisis. Sin embargo, dicho efecto no pudo ser
cuantificado mediante un estudio de significancia.

Para los estudios de linealidad también se realizaron pruebas, a diferentes
intensidades de corriente con el fin de poder detectar en una sola corrida, todos los
picos (fig 32). La intensidad de corriente óptima fue de 10nA durante los primeros
12 minutos en los que se detectan los aminoácidos glutamato y glutamina y
posteriormente, fue de 50nA para la detección de GABA.

En este trabajo se tomó como referencia el trabajo de Rowley ya que muchas
de las condiciones cromatográficas establecidas en él, se asemejan a las presentes
en el laboratorio del PIN. Por ejemplo, análisis isocrático y no en gradiente como en
otros artículos (Zhang et al, 2005; Bianchi et al, 1999), detección electroquímica de
los analitos; tipo de columna utilizada y el tipo de derivatización precolumna, que no
requiere la automatización del sistema (Cazes, et al; 2001; Lingeman, et al; 1990).
Además, presentaba algunas ventajas como tiempos de corrida cortos (20 minutos);
análisis de los aminoácidos de interés en una sola corrida; y la obtención de
derivatizados más estables. A pesar de lo mencionado anteriormente, para
desarrollar el protocolo final de este trabajo, se tuvieron que hacer algunas
modificaciones al propuesto por Rowley, todo esto con el fin de lograr una mejor
resolución de los picos correspondientes a cada aminoácido.

Las modificaciones que se tuvieron que realizar, muy posiblemente se
debieron al hecho de que el protocolo de Rowley fue desarrollado para el análisis de
aminoácidos en microdializados, una matriz con características diferentes a las de
los homogeneizados de cerebro, utilizados en este trabajo. Por un lado, en los
101
microdializados se obtienen concentraciones menores de los aminoácidos y además
la matriz se encuentra menos contaminada, dado que la sonda de microdiálsis
funciona como un filtro para sustancias no deseadas. En los homogeneizados, por el
contrario, debido a que son el resultado del tratamiento del tejido cerebral total (de
zonas específicas), pueden encontrarse otras sustancias, incluso otros aminoácidos
que contaminen la muestra y dificulten su análisis.

En el presente trabajo se cumplieron los objetivos planteados desde el inicio
en cuanto a la implementación y optimización de Cromatografía Líquida de Alta
Resolución con detección electroquímica (HPLC-EC) para el análisis de GABA y
glutamato. Esto se logró modificando el protocolo propuesto por Rowley (1995), en
cuanto algunos parámetros tales como la concentración de metanol y el pH de la
fase móvil; la velocidad de flujo de la bomba de inyección; y la concentración de
OPA en el reactivo de derivatización. Además, se establecieron condiciones óptimas
en cuanto a la temperatura para lograr que las modificaciones establecidas
produjeran resultados repetibles (con una RSD menor al 10%) y lineales (r
2
≥0,997).

Los alcances de este trabajo, sobrepasaron lo esperado puesto que además
de los dos neurotransmisores GABA y glutamato se pudo detectar en la misma
corrida y sin interferencias aparentes, el neurotransmisor glutamina.

Este neurotransmisor se ha asociado también con los procesos
responsables de la regeneración y degeneración del sistema nervioso central
(Aschner et al; 2005). Ya que GABA y glutamato, como se indicó en la revisión de
literatura, están relacionados de alguna manera con desórdenes psicoafectivos
como lo son la depresión y la ansiedad, y que estos a su vez han sido asociados
con procesos degenerativos, el análisis de la glutamina en las mismas muestras de
tejido, podría aportar información suplementaria sobre los mecanismos que
subyacen a los desórdenes supracitados.






102
6. CONCLUSIONES

De acuerdo con los ensayos realizados y las condiciones de experimentación
empleadas se conluye lo siguiente:

1. El protocolo según Rowley(1995), para la cuantificación de GABA, Glutamato y
Glutamina, ya que fue desarrollado para microdializados no cumple con los
requerimientos necesarios para la determinación y cuantificación de los
neurotransmisores mencionados en muestras provenientes de homogeneizados de
cerebro.

2. El aumento en la concentración de metanol produce, de manera general, un
aumento en los tiempos de retención de los aminoácidos.

3. El aumento en los valores de pH, produce de forma general, una disminución en
los tiempos de retención de los aminoácidos.

4. La temperatura modifica el pH de una fase móvil a razón de 0,01 puntos con el
aumento de 0,1-0,6°C.

5. El potencial de corriente más adecuado para el análisis de aminoácidos es de
10nA para Glutamato y Glutamina y de 50nA para GABA.

6. Las corridas realizadas entre 17-23°C resultan adecuadas para la separación de
los aminoácidos en un tiempo corto de corrida (20 minutos).

7. Después de las modificaciones implementadas, el protocolo resultante de este
trabajo tiene las siguientes características: fase móvil al 23% de metanol; 0,1M de
fosfato monosódico; 0,5mM de EDTA y pH 5,5 a un flujo de 0,45ml/min; y un
potencial de 850mV. Además, es esencial el mantenimiento de un rango de
temperatura entre18-23°C para asegurar resultados óptimos.

8. El OPA es una sustancia eléctricamente activa que produce contaminación del
cromatograma, por lo tanto hay que controlar la concentración del reactivo para
evitar este efecto. En este estudio, la concentración de OPA utilizada fue de 86mM.
Esta debe emplearse a razón de 20μL por mL de solución acuosa de aminoácido.

103
9. Bajo refrigeración (3°C), el reactivo de derivatización presenta actividad hasta por
tres días.

10. La cantidad de solución de derivatización establecida para el marcaje químico de
1mL de aminoácidos en matriz con una concentración máxima de 375μM para
GABA y 109 μM para Glutamato y Glutamina, es de 22μL de solución de
derivatización con una concentración de OPA de 86mM.

11. El método desarrollado en este estudio resulta repetible a concentraciones
aproximadas de 100μM y lineal bajo dentro de rangos de concentración de 47μM-
727μM para GABA y de 14 -109 μM para Glutamato y Glutamina.

12. Las pruebas de linealidad en aminoácidos individuales sugieren un efecto de la
matriz (análsis de todos los aminoácidos en conjunto).

13. Los aminoácidos Arginina y Taurina, no producen interferencias con los
aminoácidos de interés en el protocolo desarrollado.

14. La robustez del método es baja en términos de variaciones de temperatura, pH,
% de metanol e índice de flujo.
















104
7. RECOMENDACIONES

1. Para asegurar un funcionamiento óptimo del protocolo desarrollado se
recomienda la preparación de la fase móvil a pH 5,5 ; en un rango aproximado de
temperatura entre los 21,9°C y 22,4°C.

2. Para evitar la aparición de picos fantasma en el cromatograma se debe lavar el
inyector entre inyecciones de estándares o de muestras, con 100μL de agua
desionizada.

3. Para asegurar el buen funcionamiento de la solución de derivatización es
recomendable la refrigeración del reactivo, durante el día de trabajo.

4. Para evitar la formación de precipitados en el reactivo de derivatización y
garantizar una concentración adecuada de OPA, es imprescindible la preparación
del mismo en el siguiente orden: 1) OPA, 2) etanol, 3) sulfito de sodio, 4) tetraborato
de sodio.

5. Por seguridad, es necesario el uso de guantes, mascarilla y GABAcha durante la
manipulación de reactivos; y la búsqueda de MSDS (hojas de seguridad), de todos
los reactivos que serán empleados.

6. Para asegurar una temperatura de análisis adecuada (18-23°C), se recomienda
colocar la cámara de enfriamierto media hora antes del ensayo. Para tal efecto,
podrían utilizarse también refrigeradores para columnas disponibles en el mercado.

7. La filtración doble de la fase móvil y la desgasificación por al menos 15 minutos,
es una práctica cromatográfica que permite lograr resultados óptimos de análisis.
Además, se recomienda cubrir los recipientes que contienen los reactivos y la
revisión periódica de los mismos para detectar precipitados u otro tipo de anomalías.

8. De ser necesario, para lograr una mayor separación entre los picos de
aminoácidos, se puede cambiar la fase móvil, manteniendo las mismas
características establecidas en este protocolo pero con una concentración de
metanol mayor.

105
9. Puede ser necesario agregar inhibidores de proteasas a los homogeneizados de
cerebro, con el fin de obtener los aminoácidos con función de neurotransmisor y no
los que son producto de la proteólisis del tejido que contaminarían la muestra.

10. Adicionalmente, en caso de obtener concentraciones fuera del rango de
linealidad establecido, se recomienda, la dilución de la muestra a concentraciones
de 1/10; 1/100; 1/1000; 1/10000, etc; hasta obtener una concentración cercana al
punto medio de la curva de linealidad.

12. Debido a que los aminoácidos pueden quedar adheridos a superficies de vidrio,
afectando su posterior cuantificación, se hace necesaria la utilización de recipientes
de polietileno.
























106
8. BIBLIOGRAFÍA

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116
9. ANEXOS


Cromatograma logrado tras la optimización de las condiciones recomendadas
en este trabajo para el análisis de muestras de cerebro

La figura 39, muestra el resultado final de la optimización del protocolo
creado en este trabajo. El cromatograma es el resultado del análisis de una muestra
proveniente de corteza temporal.


Figura 39. Cromatograma de una muestra de homogeneizado de corteza temporal (azul).
Fase móvil 23%,pH 5,5; flujo 0,3ml/min, temperatura: 5-7°C. De izquierda a derecha, se
muestran los picos marcados de Glu,Gln y GABA.


























117

PROTOCOLOS DE LIMPIEZA Y PULIDO DEL ELECTRODO DE TRABAJO

Elaborado por Silvia Benavides V., para el Programa de Neurociencias, UCR.


Problema: La línea base presenta picos angostos en intervalos de tiempo regulares

Revise lo siguiente:

1) Si la fase móvil ha sido cambiada recientemente, es posible que los picos
que aparecen sean causados por burbujas de aire que vienen con la nueva
fase móvil. Espere al menos dos horas, si el patrón de la línea base ha
cambiado (aunque no se haya estabilizado todavía), espere al menos 3
horas más hasta que termine de estabilizarse, si el patrón del
comportamiento continúa igual realice la limpieza de los electrodos.
2) Si el patrón aparece repentinamente y la fase móvil ha sido cambiada
hace más de 24 horas, proceda a la limpieza de los electrodos.

Limpieza de los electrodos

Limpieza del electrodo de trabajo (celda)

Debe realizarse regularmente (una vez cada 15 días) sobre todo cuando los buffers
utilizados en las fases móviles contienen muchas sales.
También debe limpiarse:
 Cuando la respuesta (altura o área de los picos) se ve disminuida
comparada con la respuesta obtenida en la misma solución (solución patrón,
por ejemplo) en ocasiones anteriores.
 Cuando la línea base se ve muy sucia sin un comportamiento regular
aparente.

Para limpiar la celda superficialmente siga las siguientes instrucciones:
 Apague la celda y detenga el flujo.
 Baje el tornillo que sostiene la celda muy lentamente, mientras sostiene a la
vez la celda para evitar que esta se desprenda abruptamente.
 Desprenda con cuidado el electrodo y el empaque que lo adhiere al
detector. (NUNCA TOQUE DIRECTAMENTE EL ELECTRODO, ya que este
puede rayarse y entorpecer con eso la detección). Lave con agua destilada
el electrodo, utilizando para ello la pizeta (aplique el flujo de agua directo por
118
2 minutos). Posteriormente seque la celda con papel para lentes. Nunca
frote el papel sobre la celda y evite siempre el contacto con el electrodo,
solamente coloque el papel en la superficie y permita que el agua sea
absorbida por capilaridad.
 Lave también el empaque con agua. Cámbielo si ha notado fugas o si el
material está muy desgastado. Antes de colocarlo séquelo también
utilizando papel para lentes.
 Antes de colocarlo asegúrese que la dirección de los agujeros que tiene el
empaque coincidan con el electrodo en la celda.
 Limpie los restos de líquido que tendrá el detector y a continuación coloque
el empaque y la celda. Presione ambos con el tornillo, la presión no debe
ser excesiva, procure ¼ de vuelta adicional, después de que ha sentido la
presión en el tornillo.

Si la celda requiere una limpieza más profunda, siga las siguientes instrucciones:
 Apague la celda y detenga el flujo.
 Baje el tornillo que sostiene la celda muy lentamente, mientras sostiene a la
vez la celda para evitar que esta se desprenda abruptamente.
 Desprenda con cuidado el electrodo y el empaque que lo adhiere al
detector. (NUNCA TOQUE DIRECTAMENTE EL ELECTRODO, ya que este
puede rayarse y entorpecer con eso la detección).
 Introduzca la celda en un beaker con metanol y colóquela en el baño
ultrasónico durante 5 minutos. A continuación introduzca la celda en agua
destilada filtrada y colóquela nuevamente en el baño ultrasónico durante 5
minutos.
 Seque la celda con papel para lentes. Nunca frote el papel sobre la celda y
evite siempre el contacto con el electrodo, solamente coloque el papel en la
superficie y permita que el agua sea absorbida por capilaridad.
 Limpie los restos de líquido que tendrá el detector y a continuación coloque
el empaque y la celda en el lugar respectivo. Presione ambos con el tornillo
(la presión no debe ser excesiva, procure ¼ de vuelta adicional después de
que ha sentido la presión en el tornillo).

Pulido del electrodo de trabajo

Si a pesar de realizar la limpieza del electrodo de trabajo la detección no mejora,
utilice el kit de pulido del electrodo de la siguiente manera:
119
 Retire la franela que está en el vidrio y reemplácela por una nueva.
 Use la franela oscura (microcloth) para pulir el electrodo con micropolish
alumina 0.05M, o en su defecto utilice la franela clara (texmet) si el pulido se
realizará con “1 micron” o pulido de diamante (jeringa con pasta celeste).
 Micropolish alúmina se usa para un pulido superficial, se aplica una gota de
la pasta sobre la franela adherida al vidrio


Cromatograma logrado tras la optimización de las condiciones recomendadas
en este trabajo para el análisis de muestras de cerebro
Guía de calibración del electrodo
Hojas para el registro de datos
Protocolo de referencia
Hojas de calibraciones por PROCAME

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