Efecto inhibidor in vitro de acetilcolinesterasa del extracto hidroalcoholico de

las raíces de Perezia pinnatífida

Quispe Pomatay Luis Alberto1

1
Laboratorio de Biología Celular y Biotecnología. Facultad de Ciencias
Naturales y Matemática. Universidad Nacional Federico Villarreal.

Luisqp@outlook.com

1. Resumen:

El uso de medicamento que tienen como principio la Inhibicion de la

acetilcolinesterasa posee aplicaciones terapéuticas para la enfermedad de
Alzheimer, demencia senil, miastenia gravis y la enfermedad Parkinson. Ante
las deficiencias de los medicamento sintetizados químicamente surge la
alternativa de buscar nuevos bioactivos en la plantas, que superen dichas
limitaciones. Es por ello que en este trabajo se determino la actividad
inhibitoria de Perezia pinnatífida, una planta muy usada en la medicina
tradicional de nuestro país. Para lo cual primeramente se elaboro un extracto
hidroalcoholico partir de las raíces de esta planta,y que sirvió para hacer todo
los ensayos . se realizo primeramente un estudio fitoquimico para la detección
de los principales grupos de metabolitos secundarios mediante HPTLC.
Posteriormente se evaluó la actividad antioxidante mediante ensayos con el
radical DPPH y la actividad enzimática en base al método potenciometrico de
Michel. Encontrandose la presencia de esteriodes y/o terpenos, flavonoides y
alcaloides. En cuanto a la actividad antioxidante, poseía una capacidad de
capturar radicales libres en un 96.14%, en comparación con el estándar de
Quercetina. Y a una concentración de 0,1 g/mL inhibía la actividad de la
acetilcolinesterasa en un 73%.

2. Palabras claves: acetilcolinesterasa, cinética enzimática, Perezia

pinnatífida, inhibición enzimática , Enfermedad de alzheimer
3. Abstrack

The use of medication which is founded on the inhibition of

acetylcholinesterase has therapeutic applications for Alzheimer's disease ,
senile dementia, myasthenia gravis and Parkinson disease . Given the
shortcomings of chemically synthesized medicine alternative arises in
finding new bioactive plants that exceed these limits. That is why in this
paper we determine the inhibitory activity of Perezia pinnatifid , a plant
widely used in traditional medicine in our country. To which initially was
drawn hydroalcoholic extract from the roots of this plant , which served to all
the tests. was performed first phytochemical study for the detection of the
major groups of secondary metabolites by HPTLC . Subsequently
antioxidant activity was evaluated by testing the DPPH radical and
enzymatic activity based on the potentiometric method of Michel . Finding
the presence of steroid and / or terpenes , flavonoids and alkaloids.
Regarding the antioxidant activity possessed an ability to capture free
radicals by 96.14 % , compared with standard Quercetin . And a
concentration of 0.1 g / mL inhibited the activity of acetylcholinesterase by
73% .

4. Keyword: Acetylcholinesterase, enzyme kinetics, Perezia pinnatifida ,

enzyme inhibition, alzheimer's disease

5. Introducción

La enfermedad de Alzheimer (EA ) , es un trastorno neurodegenerativo,

caracterizado por la pérdida selectiva neuronal, la presencia de fibrillas de β-
amiloide y de un amplio espectro de los mediadores de la inflamación, siendo
dichas alteraciones las causantes de la aparición de problemas en la
memoria, el pensamiento y el comportamiento; lo que trae consigo graves
repercusiones en el trabajo, la sociedad y la vida personal (Brlihlmann et al.
2004)

A través de los años se ha evidenciando un progresivo aumento en el número

de individuos afligidos con esta enfermedad, lo cual a fomentando su
investigación. Es así que mediante los estudios bioquímicos realizados, se
descubrió que en este trastorno la enzima acetilcolinesterasa (AChE) sufre
alteraciones en cuanto a su concentración y estimula la agregación de las
fibrillas de β-amiloide, además que dicho proceso es sensible a ser
bloqueado en los sitios aniónicos periféricos de la enzima Enz, et al. 1993..
Ante este hallazgo se formulo la teoría denominada "hipótesis del déficit
colinérgico ”, la cual sostiene que la inhibición de la actividad AChE
aumentaría la disponibilidad de ACh en las sinapsis colinérgicas, restaurando
así el equilibrio colinérgico y amplificando la actividad colinérgica restante, lo
que mejora el funcionamiento cognitivo general y la reducción de la
producción de importantes citocinas inflamatorias que contribuyen a la
inmunopatología asociada con EA(Siddiqui & Levey, 1999)

La terapia con inhibidores de acetilcolinesterasa (IAchE), puede ser

considerada, por su naturaleza farmacológica, como una simple intervención
sintomática a corto plazo, sin embargo, los datos emergentes de los ensayos,
determinan que a largo plazo el mantenimiento del efecto clínico puede ser
prolongado a por lo menos 1 año y como máximo a 36 meses (Mukherjee et
al. 2007). Los primeros medicamentos usados para el tratamiento de EA con
propiedades IAchE, se introdujeron en 1993,siendo uno de ellos la tacrina
la cual demostró ser relativamente de corta duración y no selectiva entre las
dos enzimas colinesterasas( ChE) y adicionalmente se le a asociado con una
alta incidencia de hepatotoxicidad reversible(Whitehouse , 1993 ). En
contraste , la segunda generación IAChE(como el clorhidrato de donepezilo y
la Galatamine) , se toleraron mejor y se encontró que son útiles en el
tratamiento leve a moderada en pacientes de EA, a pesar de ello también se
ha notificado que poseen un efecto adverso, que incluyen trastornos
gastrointestinales y problemas asociados con la biodisponibilidad ( Schulz ,
2003). Es por ello que ha surgido el interés por encontrar mejores inhibidores
de AChE en los recursos naturales y no tan solo para los fármacos
beneficiosos en el tratamiento de la EA, sino también para otras formas de
demencia (Mukherjee et al. 2007). Esta búsqueda de nuevos medicamentos
partir de bioactivos de plantas ha conducido al aislamiento y la elucidación de
la estructura de una serie de nuevas e interesantes farmacóforos. Dentro de
estos medicamentos podemos encontrar a La fisostigmina ( un alcaloide de la
Haba de Calabar , Physostigma venenosum ; Leguminosae ), el cual es un
excelente inhibidor de la AchE, pero sufre de mala absorción intestinal en los
seres humanos y otro ejemplo es la galantamina , que fue aislado a partir de
plantas de la familia Amaryllidaceae , se encontró ser más selectivo para la
AChE que la butirilcolinesterasa, proporciona una biodisponibilidad oral
completa y es la adición más reciente a los medicamentos utilizados para el
tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y a sido aprobado para su uso en
Austria, Suiza y Suecia (Mukherjee et al. 2007)

Por otra parte se ha comprobado que esta búsqueda es más productiva

cuando se realiza en zonas donde la diversidad biológica es alta , tales como
los ecosistemas tropicales y subtropicales , debido a que estas regiones
presentan características ecológicas únicas, que les permiten generar una
amplia variedad de metabolitos secundarios propios de esas zonas
(Desmarchelier C. 2000).

El Perú al ser parte de estas regiones es un buen candidato para encontrar

estos metabolitos con amplias actividades biológicas. Una de las plantas muy
usadas en su medicina tradicional, es Perezia pinnatífida (Humb. & Bonpl.)
Wedd, comúnmente denominada “valeriana”, que es utilizada como sedantes,
diurético y diaforético. Además estudios realizados con esta planta
encontraron que genera el incremento de los niveles de dopamina en sangre
de ratas normales, presenta capacidad neuroprotectora, alta capacidad
antioxidante y alto contenido de polifenoles y flavonoides (Pérez 2008)

6. Marco teórico

6.1. Perezia pinnatífida (Humb. & Bonpl.) Wedd

Perezia pinnatifida (Asteraceae) es una planta medicinal nativa del Perú.

Denominada comúnmente “Valeriana o Contrahierba” (De la Cruz H. 2005).

Se toma en infusión como estimulante del sistema nervioso central; sedante,

tónico y calmante para el tratamiento de trastornos del corazón, insomnio
nervioso, dolor de cabeza, cansancio, "susto" y la parálisis de Bell. También se
usa como antitusivo (Rehecho S. y Calvo M. 2011).

Entre la composición química de P. pinnatifida se han detectado flavonoides,

cumarinas, terpenos y sesquiterpenos (del tipo ácido valerénico), lo que podría
suponer el punto de partida para establecer la validación científica del uso
tradicional de esta planta(Rehecho S. 2011)

En cuanto a sus actividades biológicas, en el elextracto hidroalcoholico de

Perezia pinnatífida, se encontró que posee la capacidad de incrementar los
niveles de dopamina en sangre de ratas normales.capacidad neuroprotectora al
disminuir la discinecia inducida por haloperidol y frente al estrés oxidativo
inducido en células neuronales PC12 (Pérez, 2008; Rehecho & Calvo, 2009)

6.2. Fraccionamiento con Cromatografía en capa fina de alta resolución

(HPTLC)

Viene a ser uno de los métodos más comúnmente utilizados en los análisis
fitoquímico, debido a su simplicidad, bajos costos y rapidez, debido a que las
muestras requieren una mínima purificación previa, lo cual permite una
reducción en el número de preparación de la muestra

Se caracteriza por poseer dos fases, una fase estacionaria y la otra móvil.
Cargándose una muestra en la fase estacionaria, la cual es separada
gradualmente en bandas o zonas, .por la fase móvil, solo si es que ambas
fases son adecuadamente seleccionados, Dentro de esta técnica sofisticada
sus principales parámetros que influyen en la separación de los constituyentes
dentro de una mezcla son los coeficientes de partición, el factor de retención
(Rf), , la selectividad de la fase móvil y estacionaria a los solutos, y la altura de
la placa que decide la eficiencia de la separación, así como la resolución de
los constituyentes individuales dentro de la muestra. Siendo el Rf, el cociente
entre la distancia de migración de un componentes de una mezcla en relación
con la fase móvil. (Srivastava, 2011)

6.3. Estrés oxidativo

En principio, el estrés oxidativo está relacionado con las variaciones en la

generación de los radicales libres, la eliminación de ellos, o ambos. También
son denominados oxidantes o especies reactivas del oxígeno (ERO´s). .Este
desequilibrio lleva a un daño a nivel de las biomoléculas y las células,
ocasionando un impacto sobre el organismo (Lemaitre et al 1996). ERO´s son
productos de un metabolismo celular normal y juegan un papel vital en la
estimulación de las vías de señalización de las células animales y vegetales en
respuesta a los cambios de las condiciones ambientales (Janeway, 1989).
Siendo muchos de los da problemas ocasionados por ERO´s, la isquemia,
estrés y diversos procesos inflamatorios

Dichos ERO´s son neutralizados por compuestos denominados antioxidantes ,

disminuyendo el daño celular, protegiendo a las biomoléculas de la oxidación
y/o inhibir los procesos apoptóticos generados por ellos (Ferrari, 2004). Dentro
de dichos compuestos, los flavonoides , son uno de los grupos más
importantes, ya que se ha demostrado que es altamente eficaz en la
eliminación de la mayoría de los tipos de moléculas oxidantes y diversos
radicales libres, además son los más comunes y ampliamente distribuidos
grupo de compuestos fenólicos vegetales. (Le Marchand, 2002)

6.4. Neurotransmisor acetilcolina (Ach)

La Ach fue descubierta en 1867 como un compuesto sintético, detectado en el
tejido de las glándulas suprarrenales. Una vez liberada tiene una vida media
muy corta por la presencia de AchE, esta enzima hidroliza la parte éster de la
molécula (Houghton et al. 2006).

La Ach fue el primer neurotransmisor caracterizado tanto en el sistema

nervioso periférico como en el sistema nervioso central de los mamíferos. Este
neurotransmisor participa en la regulación de funciones de activación cortical,
el paso de sueño a vigilia , la atención, el aprendizaje, el control de los
movimientos voluntarios, los procesos de memoria a corto plazo y asociación
Guyton, 2001).

Se sintetiza en la terminal presináptica a partir de la acetil coenzima A y la

colina; reacción que es catalizada por la enzima colina acetiltransferasa. Una
vez formada se transporta en vesículas, las cuales liberan el neurotranmisor en
la hendidura sináptica durante sinapsis neuronal (transmisión de la señal), la
Ach es rápidamente degradada en acetato y colina por la enzima AchE(Guyton,
2001).

6.5. Acetilcolinesterasa(AchE)

La AchE es la enzima encargada de termina la transmisión de los impulsos en

las sinapsis colinérgicas mediante la hidrólisis rápida de ACh a colina (Ch)
(Cuartero et al. 2012). Logrando así que la molécula sea inactivada o
eliminada para evitar su difusión e interacción con los receptores vecinos.
Posee la capacidad de hidrolizar 600 000 moléculas de ACh en un minuto,
teniendo un Km alrededor de 0,05 a 0,1 mM y su kcat a 1.4 x 104 s-1 (Voet &
Voet, 1995)

Por otra parte, la AChE también está implicada en otro tipo de funciones, entre
las que destacan la neuritogénesis, adherencia celular, sinaptogénesis,
ensamblado de fibras de amiloides, activación de receptores dopaminérgicos,
hematopoyesis y trombopoyesis(Hartwell 1982)

Esta enzima presenta una distribución muy amplia, ya que se puede encontrar
tanto en las neuronas colinérgicas (dendritas, pericarión y axones); como en
las uniones neuromusculares. sin embargo, la AchE no es la única
colinesterasa presente en el organismo, teniendo ,otras como la
butirilcolinesterasa (BuChE) que cataliza el rompimiento del enlace éster de la
butirilcolina; y a diferencia de la AChE, la BuChE únicamente se encuentra a
bajas concentraciones en células gliales de Sistema nervioso central y en el
suero, ya que es sintetizada en el hígado. Por tal motivo, la BuChE no juega
un papel importante en las sinapsis neuronales, sino que su función principal es
la desintoxicación de ésteres de colina ingeridos en la dieta (Cáceres 2011)

6.6. Enfermedad de Alzheimer (EA)

La EA fue descrita por primera vez por el psiquiatra y neuropatólogo alemán

Alois Alzheimer en 1906 (Brookmeyer et al. 1998). Es una enfermedad
caracteriza por la pérdida progresiva de la memoria, asociada con la
disminución funcional y perturbaciones en la conducta de los
individuos(Akhondzadeh & Abassi, 2006).

Esta enfermedad afecta hoy a más de 20 millones de personas, tiene enormes

consecuencias sobre la economía de los países y constituye uno de los temas
de investigación más activos en el área de salud (Cacabelos, 2001). Teniendo
como incidencia un rango de aumento anual del 1 al 4%, principalmente en
edades que van de los 65 a los 70 años y cifras que se acercan al 6% para
aquellos sobre la edad de 85 años (Akhondzadeh & Abassi, 2006). En general
se diagnostica en personas mayores de 65 años, aunque de forma menos
frecuente puede presentarse en edades más tempranas (Berchtold & Cotman,
1998).

6.6.1. Manifestaciones Clínicas

La EA se describe por una alteración de la memoria de acontecimientos

recientes, mientras que los recuerdos más antiguos se preservan mejor.
Conforme la enfermedad avanza el deterioro va siendo más severo, al grado de
que el paciente pierde habilidad para efectuar cálculos, ejercicios, destrezas
visuespaciales, manipulación de objetos comunes, así como el olvido de los
nombres de sus familiares. El estado de alerta y el sistema motriz del paciente
no se altera hasta que la enfermedad está muy avanzada. La muerte
sobreviene por complicación de la inmovilidad, como neumonía o embolia
pulmonar. El paciente con EA suele sobrevivir en un lapso de 6 a 12 años.
(Hardman & Limbird , 2006)

6.6.2. Fisiopatología

La EA se caracteriza por la atrofia de la corteza cerebral y pérdida de las

neuronas corticales y subcorticales; es decir, las neuronas que actúan sobre la
memoria, las cuales son las primeras afectadas, seguido de las neuronas
corticales del lenguaje y el razonamiento. Por otra parte, histológicamente se
ha observado en cortes de la corteza cerebral de pacientes afectados,
estructuras anormales que presentan placas seniles y marañas neurofibrilares
formadas por proteínas de doble filamento y por la proteína hiperfosforilada,
debido a una inadecuada regulación de la proteína CAM/KII, lo que provoca
colapso del citoesqueleto y por ende dificultad en la comunicación celular y
muerte neuronal. También se encuentran formaciones esféricas del péptido β-
amiloide, el cual es altamente tóxico debido a que se adhiere a las membranas
neuronales, lo que constituye el inicio de formación de placas seniles. Su
formación radica en la división de la proteína precursora amiloide(Carr et al.
1997).

En la muerte neuronal por la formación de placas seniles y marañas

neurofibrilares disminuye dramáticamente las cantidades normales de
neurotransmisores, especialmente de ACh, ocasionando un déficit de la
molécula, lo que evita la interacción con sus receptores colinérgicos; por lo
tanto, rompe con la vía normal de señalización de la memoria en la corteza
cerebral y el hipocampo. El exceso de AChE contribuye a la muerte neuronal y
a la baja interacción de ACh; estos fenómenos constituyen la denominada
“Hipótesis Colinérgica de la EA”( Guevara 2006)

6.6.3. Tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer

Hoy en día el tratamiento de la EA, se basa en el uso de fármacos para

paliar la enfermedad y retrasar los efectos nocivos de la enfermedad. Los
primeros fármacos seleccionados son los inhibidores de AChE; que evitan la
hidrólisis de la ACh en el espacio sináptico y la toxicidad del exceso de la
enzima (Guevara 2006)

Los medicamentos inicialmente utilizados como la galantamina y fitoestigmina

presentaron tener efecto hepatotoxicos por su uso a largo plazo. Por tanto, hay
una constante búsqueda de nuevas drogas que produzcan con menor toxicidad
y sean más eficaces en el tratamiento (Soreq & Seimand, 2001).
Encontrándose que tratamientos herbarios tienen un potencial para ser
aplicados en el tratamiento de EA a través de propiedades multifuncionales,
como procolinérgicos, antioxidantes, antiamiloide y antiinflamatorias,
particularmente demostrados en ensayos in vitro e in vivo de la inhibición de
formación del péptido β-amiloide y la inhibición de la progresión de la
EA(Anekonda & Reddy, 2005 ).

Hasta el momento, más de 35 alcaloides han sido informó que poseen la

actividad inhibidora de la AChE . Las otras clases principales de compuesto
con tales actividad son los terpenos , glucósidos y cumarinas monoterpenoides,
curcuminas, alcaloides, flavonoides, magnolol, tanshinonas, coptisinas y
palminas(Howes et al., 2003). Dichos metabolitos secundarios con poseer
algún efecto inhibitorio de AchE en plantas que pertenecen a las familias
Acanthaceae , Apocynaceae , Amaryllidaceae , Angelicae, , Araceae ,
Asclepiadaceae , Asteraceae, Berberidaceae , Buxaceae , Combretaceae ,
Compositae , Coníferas , Cyperaceae , Ebenaceae , Ericaceae , Fumariaceae ,
Gentianaceae , Guttiferae , Lamiaceae, Lilliaceae , Lycopodiaceae ,
Malvaceae , Magnoliaceae , Menispermaceae , Molluginaceae , Moraceae ,
musáceas , Nelumbonaceae , Papaveraceae , Piperaceae , Rubiaceae ,
Rutaceae , Sapotaceae y Tamaricaceae (Gupta & Gupta, 1997; Howes et al.,
2003)

6.6.4. Cinética Enzimática

Las enzimas son catalizadores biológicos cuya función es abatir la energía de

activación y por ende, acelerar la reacción del paso de reactivos a productos; o
de sustrato a producto. Su actividad depende de la estructura tridimensional,
sin embargo, en algunas de ellas no sólo depende de esta característica, sino
de otros componentes llamados cofactores. Los cofactores pueden ser uno o
varios iones inorgánicos como Fe2+, Zn2+, Mg2+ o Mn2+; cuando el cofactor
es de naturaleza orgánica u organometálica, se le denomina coenzima.
Cada enzima posee una actividad particular a ciertas condiciones ambientales,
por ejemplo, a un cierto pH, temperatura, concentración de sustrato, cantidad
de enzima, etc.( Guevara 2006)

6.6.5. Catálisis enzimática. Modelo de Michaelis-Menten

Durante una reacción química de transformación de reactivos a productos,

existe un estado en el cual se llevan a cabo el rompimiento y formación de
enlaces, denominado estado de transición o complejo activado, el cual es
imprescindible para cualquier reacción, independientemente del estado
energético de los reactivos y los productos; es decir, si la reacción es
espontánea o requiere energía. Por lo tanto, el complejo activado está asociado
a una alta energía llamada energía de activación (Lehninger et al. 1995)

Por otra parte, en general las reacciones enzimáticas se llevan a cabo bajo el
siguiente esquema:

A principios del siglo XX, Henri, Michaelis y Menten sentaron las bases de la
cinética enzimática actual, donde establecen que los reactivos (E + S) y el
complejo (ES) llegaban al equilibrio rápidamente durante una reacción
enzimática asumiendo que k2 << k-1. Posteriormente, Briggs y Haldane
reconocieron que el modelo de Henri-Michaelis-Menten podría ser descrito de
una forma más general que no requería que k2 << k-1. La forma general que
establecieron la denominaron “Teoría del Estado Estacionario”, que establece
que en un período de tiempo durante una reacción enzimática, la rapidez de
formación del complejo ES es exactamente igual al decaimiento de la enzima
libre y sus productos( Copeland 2000)

A partir de este postulado, se llegó a la ecuación de Michaelis-Menten y la

gráfica de hipérbola rectangular

A mayor concentración de sustrato, la enzima total se asocia al sustrato, por

tanto, la concentración de [ES] es constante debido a la saturación de la
enzima, y en ese momento se alcanza la rapidez máxima.

La determinación de los parámetros cinéticos de una enzima se pueden

determinar a partir de varios métodos, entre los que destacan: El método de la
doble recíproca de Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee, Hanes-Wolff y el Método
de Eisenthal-Cornish-Bowden. El método de Lineweaver-Burk es el más
utilizado para determinar Km y V rmáx de una enzima, y consiste en obtener
una ecuación de línea recta a partir de la transformación inversa de la ecuación
de Michaelis-Menten:

r0 = rmáx [S]/ (Km + [S])

Obteniendo la inversa: (1/r0) = (Km/rmáx)(1/[S]) + 1/rmáx

Donde la pendiente es el cociente entre Km y rmáx y la ordenada al origen es

la inversa de la rapidez máxima (Guevara 2006)

6.6.6. Inhibición enzimática

La inhibición enzimática, se refiere a la unión de una molécula o ligando a la

enzima, cuya afinidad debe ser mayor que con el sustrato natural. El propósito
de un inhibidor es unirse a la proteína y evitar que transforme su sustrato a
producto. Esta unión del ligando con la enzima puede ser de diferente manera,
lo cual sirve para diferenciar entre un tipo de inhibición y otro.

Los tipos de inhibición son inhibición competitiva, no competitiva y

acompetitiva

En una inhibición competitiva, el inhibidor compite junto con el sustrato por el

mismo sitio de la proteína (Sitio activo); por tal motivo, la gráfica de 1/V vs. 1/[S]
presenta un aumento en las pendientes al incrementar la concentración de
inhibidor, porque este desplaza al sustrato en función de su afinidad, lo que da
por resultado un cambio en el valor de Km y la rapidez máxima no se ve
afectada . Con respecto a la inhibición no competitiva, el inhibidor no compite
con el sustrato por el sitio activo, sino la unión del ligando (inhibidor) se da en
un sitio alostérico, lo que permite la formación del complejo ESI a partir, de ES
y EI. En este tipo de inhibición se ve afectada la rapidez máxima, ya que la
enzima no alcanza la saturación con sustrato debido a la interferencia
alostérica del inhibidor (a mayor concentración de inhibidor menor rmáx). En
cuanto a Km, esta no se ve afectada, ya que la afinidad hacia el sustrato sigue
siendo la misma, ya que el inhibidor no ocupa el sitio activo. La inhibición
acompetitiva total reversible, es un caso de inhibición muy peculiar ya que en
este tipo de sistemas, el inhibidor únicamente puede afectar a la enzima
cuando el sustrato se ha unido a ella. Por tanto, la Km y la rmáx se afectan en
igual magnitud, porque la unión del inhibidor en un sitio alostérico, induce un
cambio estructural de la proteína, lo que ocasiona un incremente de la afinidad
de la enzima por su sustrato, por tal motivo la conversión a producto es casi
nula(Copeland 2000)

7. Objetivos

7.1. General

7.1.1. Determinar el efecto inhibidor en la enzima acetilcolinesterasa

por el extractos hidroalcoholicos de las raíces de Perezia
pinnatífida

7.2. Específicos

7.2.1. Determinar la presencia de lso principales grupos de metabolitos

secundarios mediante HPTLC
7.2.2. Evaluar las condiciones optimas para al cinetica enziamtica de
la enzima acetilcolinesterasa
 7.2.3. Determinar la inhibición de la acetilcolinesterasa por las
diferentes concentraciones del extracto hidroalcoholico de de
Perezia pinnatífida

8. Material y procedimiento

8.1. Insumos :

8.1.1. Ratas swiss

8.1.2. Perezia pinnatífida

8.2. Materiales:

8.2.1. Homogenizador de tejidos

8.2.2. Estuche de disección
8.2.3. Luna de reloj
8.2.4. Eppendorff 1,5 mL
8.2.5. Termometro
8.2.6. Cronometro
8.2.7. Micropipetas de 1 mL , 100µL
8.2.8. Tubos Falcon de 20 mL
8.2.9. Placas de Silica Gel 60 F254 Merck de 10 x 10 cm

8.3. Equipos :

8.3.1. Centrifuga
8.3.2. Estufa
8.3.3. Balanza
8.3.4. Potenciometro
8.3.5. cámara Canon Power Shot A2400 IS.
8.3.6. Espectrofotómetro Milton Roy Modelo 20D

8.4. Reactivos:

8.5. Alcohol etílico 96 %

8.6. Solución salina 0.154M , pH: 7,8
8.7. Solución stock de acetilcolina 383 mM
8.8. Hidróxido de sodio al 0,02N
8.9. Cloruro de magnesio a 10 mM
8.10. Diclorometano
8.11. Metanol
9. Métodos

9.1. Preparación del extracto hidroalcoholico

Las muestras fueron secadas a 40ºC por 24 horas, luego fueron pulverizadas
en un mortero, para después ser macerados en etanol al 96% en proporción
1:10(w/v) con el pulverizado por una semana. Pasado este tiempo se
centrifugo 7500RPM por 7 minutos y se conserva el sobrenadante y se
almaceno a 4 C°.

9.2. Estudio fitoquímico.

9.2.1. Separación de metabolitos en cromatografía de capa delgada

Se utilizaron placas HPTLC de Silica Gel 60 F 254 Merck de 10 x 10 cm.

Utilizando de fase móvil: Diclorometano - Metanol en proporción de 9:1. Las
placas fueron activadas a 150 °C por 15 minutos. La saturación de la cámara
cromatografica fue de 20 minutos. Se tomaron fotografías digitales en formato
jpg a luz UV de las placas, luego del procedimiento, con una cámara Canon
Power Shot A2400 IS.

9.2.2. Evaluación de presencia de metabolitos en cromatografía de capa

delgada.

Luego de realizada la cromatografía en placa de los compuestos se procedió a

evaluar la presencia de los diferentes constituyentes químicos en las plantas
con reactivos de coloración específicos para estos grupos de metabolitos. Para
esto, el colorante es aspersado sobre la placa con un atomizador, dependiendo
de las características del colorante se calentara o no la placa y se evaluara a
luz UV o visible. Se tomaron fotografías digitales en formato jpg, con una
cámara Canon Power Shot A2400 IS, las cuales luego fueron procesadas con
el software ImageJ versión 1.47t.

9.2.3. Esteroles, Esteroides y Triterpenicos:

Se utilizó el Reactivo de Libermann – Burchard. Se aspersó y luego se calentó

10 min a 110 °C. Existe presencia de estos metabolitos si observan bandas
fluorescentes a luz UV 254 nm. El reactivo se fundamenta en su poder
emulsificante. Si la coloración en UV varía entre verde y azul fluorescente se
considera una reacción positiva para esteroides; y si la coloración de la banda
es amarilla, anaranjada o pardo amarronado es positiva para triterpenos.

9.2.4. Alcaloides:

Se utilizó el Reactivo de Dragendorff. Se aspersó para observar en luz visible

bandas con una coloración que varía entre rojo vino y marrón claro (Rucker G.
1977), esta coloración indica de la presencia de alcaloides. El reactivo contiene
yoduro de potasio y bismuto. La reacción se fundamenta en la capacidad de las
sales alcaloidales de combinarse con el yodo y metales pesados como el
bismuto, mercurio y tungsteno formando precipitados de sales complejas.

9.2.5. Flavonoides:

Se utilizó el reactivo de Cloruro de antimonio III. Se aspersó para observar

bandas fluorescentes en luz UV254, se evaluó también en luz visible. El reactivo
contiene cloruro de antimonio III al 10% en cloroformo.

9.3. Determinación de actividad antioxidante.

La actividad antioxidante se determinó con el método DPPH (1,1-Diphenyl-2-

picrylhydrazyl). El ensayo se basa en la reducción de DPPH, que es un radical
libre estable. Posee un electrón impar y da una absorción máxima a 517 nm, es
de color violeta. En presencia de un antioxidante el DPPH es reducido porque
le es donado un átomo de hidrógeno (DPPH-H) en consecuencia su
absorbancia disminuye. Lo que genera una coloración amarilla proporcional al
número de electrones capturados. (Patel & Patel, 2011).

9.3.1. Actividad captadora de radicales DPPH en solución.

Se enfrentó los extractos de P. pinnatífida a el reactivo DPPH 0.0868 mg/ml, la

reacción se evaluó mediante espectrofotometría a 515 nm durante un minuto
(Espectrofotómetro Milton Roy Modelo 20D). Se utilizó 20μl de las muestras a
diferentes concentraciones y 980μl de DPPH protegiéndolos de la luz durante
la mescla. Como sustancia estándar se utilizó Quercetina 0.01mM. Con las
absorbancias obtenidas se evaluó la cinetica de la reacción y a partir de los
resultados la capacidad antioxidante de las muestras.

9.3.2. Disección de corteza cerebral de ratones

Los ratones son sacrificados por dislocación cervical. Se les sujeta por el
abdomen firmemente y con un movimiento rápido se corta la cabeza, con un
corte transversal por entremedio de los hombros y el cuello. Se extrae el
cerebro haciendo cortes alrededor del cráneo. Una vez extraído se coloca en
solución salina, se les separa los lóbulos y se extrae las meninges

9.4. Actividad enzimática

9.4.1. Preparación de homogenizado

Los cerebros fueron pesados (húmedo) y se les agrego solución

salina( 0.154M , pH: 7,8) y se homogenizo en frio. Luego se centrifugo a 5 000
RPM por 5 minutos a temperatura ambiente, se recupero el sobrenadante y
descarta el precipitado

9.4.2. Normalización del método

La normalización de la técnica se refiere a estandarizar la metodología al

material y a los reactivos disponibles en el laboratorio, así como ajustar la
concentración de enzima, concentración del sustrato, tiempo, temperatura y pH
óptimos de la actividad de la enzima. En este trabajo únicamente se ajustaron
la concentración de enzima y del sustrato.

El ensayo fue una variación de la metodología propuesta por Michel (1949) en

el cual la mezcla de reacción consistía en cloruro de magnesio a 10 mM, el
sustrato acetilcolina y homogenizado de cerebro. Haciendo las lecturas a una
temperatura de 37ºC por 3 minutos

9.5. Determinación de la concentración óptima de la enzima

Para determinar la concentración óptima de la enzima se siguió el siguiente

modelo en base a 5 concentraciones del homogenizado de hemisferios(Ver
tabla 1)

Tabla. 1. Ensayo para la determinación de la concentración optima d ela

enzima
Homogenizado 50 25 15 10 5
de cerebro(µL)
Cloruro de 850 875 885 880 895
magnesio a 10
mM(µL)
Incubar a 37ºC por 10 minutos y enrazar pH a 8 con NaOH al 0,02N

Acetilcolina0,25 100 100 100 100 100

mM(µL)
Medir la actividad por 3 minutos
 Se les determino la velocidad de la reacción en base a la pendiente de la
ecuación de la recta, tomando un R>0,95.

9.6. Determinación de la concentración óptima del sustrato

La determinación de la concentración optima del sustrato Ach se baso en el

Km experimental para la AchE(0,09mM), tomando en cuenta las
concentraciones para el 30 , 50 , 70 ,72 % de la Velocidad máxima (ver Tabla.
2)

Tabla.2. Ensayo para al determinación de la concentración optima del

sustrato
Concentración de 0,039 0,09 0,21 0,25
Ach(mM)
Homogenizado de 20 20 20 20
cerebro(µL)
Cloruro de 880 880 880 880
magnesio a 10
mM(µL)
Incubar a 37ºC por 10 minutos y enrazar pH a 8 con NaOH al 0,02N
Acetilcolina(µL) 100 100 100 100
Medir la actividad por 3 minutos

De igual forma que con el homogenizado se les calculo la ecuación de la recta

y se tomo la pendiente como la velocidad de la reacción con un R>0,95

9.7. Determinación de la constante de Michaelis-Menten (Km) y la rapidez

máxima (rmáx)

Para Los valores óptimos del sustrato y de la enzima, se realizó el

procedimiento de Lineweaver-Burk para determinar el Km y la velocidad
máxima , mediante el uso de los resultados del ensayo anterior, se aplicó el
método de Lineweaver-Burk, determinando el valor de los mismos por
regresión lineal mediante el Microsoft Excel 2007 para Windows

9.8. Ensayos de inhibición de la AChE por el extracto hidroalcoholico de

Perezia pinnatífida

Se siguió el mismo ensayo de la determinación de la concentración óptima del

sustrato Ach, pero se añadió un volumen igual del extracto con la del
homogenizado. Se uso en las pruebas las concentraciones de 0.1, 0.075,
0.05,0.025 g/mL del extracto

9.9. Las pruebas estadísticas

Todos los experimentos fueron tratados mediante un análisis estadístico de

regresión lineal por mínimos cuadrados, fijando como R>0,95

10. Resultados

10.1. Evaluación de presencia de metabolitos secundarios.

10.1.1. Esteroles, Esteroides y Triterpenicos:

A luz UV se observan bandas fluorescentes de color azul,

en la muestra de raíces , con Rf´s de 0.25 y 0.88 (Fig. 1).
Ambos Rf´s coinciden con bandas observadas a luz UV
antes del revelado.

Fig. 1. Revelado de esteroles, esteroides y triterpenicos

con el reactivo de Libermann – Burchard, en lus UV 254 De
las hojas de Perezia pinnatífida

10.1.2. Alcaloides:
A luz visible se observan bandas de color marrón claro,
en la de muestra de Raíz EtOH, con Rf´s 0.05; 0.08 y
0.26 (Fig.2).

Fig.2. Revelado de alcaloides con el reactivo de

Dragendorff.. Muestra de Raíces EtOH.

10.1.3. Flavonoides:

A luz Visible se observa una banda amarilla

oscura, en la muestra de Raíz EtOH, con Rf 0.29
(Fig.3). A luz UV 254 se observan bandas celestes
fluorescentes con Rf´s 0.05; 0.18; 0.24; 0.28;
0.35; 0.90; 0.94 y 0.96 (Fig.4), las bandas con
Rf ´s 0.24; 0.35; 0.90; 0.94; y 0.96 no se observaron
antes del revelado.

Fig.3. Revelado de flavonoides con el reactivo

de Cloruro de antimonio III, vista a luz visible.
Muestra de Raíces EtOH.
Fig.4. Revelado de flavonoides con el reactivo de Cloruro de antimonio III, vista
a luz UV. Densitograma de intensidad de bandas en ImageJ. Muestra de
Raíces EtOH.

10.2. Ensayo de actividad antioxidante.

10.2.1. Actividad captadora de radicales DPPH en solución.

Los valores de absorbancia usados en el análisis de la cinética de reacción

tanto en el estándar como en los diferentes extractos tuvieron una
correlación mayor al 0.95, lo que da confiabilidad a los resultados. Con
estos datos se determino a partir de la cinética de las reacciones la
capacidad antioxidante en comparación con el estándar de Quercetina,
Enontrandose que las raíces maceradas en alcohol etílico poseen el 96,14
% de la capacidad captadora de radicales libres del estandar.

10.3. Actividad enzimática

10.3.1. Normalización de las concentraciones optimas del sustrato

acetilcolina y del homogenizado de hemisferios cerebrales

Teniendo en cuenta que son varios los factores que pueden modificar la
velocidad de una reacción, como concentración de la enzima, del sustrato,
los cofactores, pH, temperatura, la presencia de activadores y de inhibidores,
sólo puede estudiarse un factor a la vez, y el resto debe permanecer
constante; sin embargo no puede mantenerse constante la concentración del
sustrato ni la del producto, pues su variación es el índice de que la reacción
está ocurriendo, por ello se determino la velocidad inicial (V0) , que viene a
 ser la velocidad de la reacción cuando aún no se ha consumido el 10 % del
sustrato inicial.

Se determino los parámetros cinéticos para las muestras utilizadas

adaptando el método potenciométrico de Michel a estas condiciones de
experimentación, entre ellas la disminución del tiempo de incubación y la
concentración del sustrato acetilcolina.

Mediante los ensayos realizados para la determinación de la cantidad

optima del homogenizado de hemisferios cerebrales, se encontró que a
medida que se iba añadiendo más cantidad del homogenizado, la V0 iba
aumentando de manera lineal hasta la cantidad de 25 µL, pasado dicho
valor las velocidades no aumentaban en igual proporción que con las
cantidades menores y gráficamente se acentuaba la formación de una
asíntota en dichos valores (ver Fig. 5)

0.35

0.3

0.25
Vo( ΔpH/min)

0.2

0.15

0.1

0.05

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
homogenizado (µL)

Fig. 5: Velocidad inicial de reacción en función de la cantidad del

homogenizado de cerebro, sustrato acetilcolina 0,25mM, 37ºC

En el ensayo realizado en base a diferentes concentraciones del sustrato se

puede apreciar, que la concentración de sustrato influye grandemente sobre la
velocidad de la reacción; en la medida que la concentración de sustrato se
incrementa de igual forma lo hace la V0. Esta velocidad será proporcional a la
concentración de sustrato, a concentración constante de la enzima, resultando
una reacción de primer orden, sin embargo, los incrementos en la velocidad no
se mantienen uniformes, sino que cada vez son menores; a partir de 0,3 mM
de Ach, perdiendo proporcionalidad y mostrando un orden intermedio entre
cero y primer orden, o sea mixto de la reacción. Cuando la concentración de
Ach es de 0,2 M, laV0 se acerca asintóticamente a un valor prácticamente
constante, y es totalmente de la concentración de sustrato, representando una
cinética de orden cero, en ese momento la reacción ha alcanzado la velocidad
máxima(Ver Fig. 6)

0.25

0.2
Vo( ΔpH/min)

0.15

0.1

0.05

0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4
Acetilcolina(mM)

Fig. 6: velocidad de la reacción en función de las concentraciones del sustrato

acetilcolina, tiempo de reacción 3 minutos, temperatura de 37ºC
10.3.2. Determinación de los parámetros KM y Vmáx

Para la determinación de las constantes cinéticas KM y Vmáx se aplicaron a los

resultados obtenidos el método de Lineweaver-Burk(Fig. 7).

18
16
14
12
10
1/V

8
6
4
2
0
-15 -10 -5 0 5 10 15 20 25 30
1/(Ach)

Fig. 7: Representación del método de Lineweaver-Burk de laos datos obtenidos

La recta obtenida para el sustrato presenta un coeficiente de regresión R=

0,95. Los parámetros cinéticos KM y Vmáx se determinaron hallando los
puntos de intersección de las rectas, siendo los valores de KM y Vmáx
mediante este método 0,12 mM y 0,233 pH/min, respectivamente.

10.4. Efecto de diferentes concentraciones del extracto hidroalcoholico

de raíces de Perezia pinnatífida
Entre las concentraciones de sustrato y la velocidad de la reacción para cada
una de las concentración del extracto hidroalcoholico de la raíz de P.
pinnatífida, se evidencia una disminución en cuanto a su V0, a medida que se
incrementa la concentración del extracto , pero las variaciones en cuanto al
reducción de la V0 no son muy notorias (Ver Fig. 8)

0.18
0.16
0.14
0.12 Control
Vo( ΔpH/min)

0.1 Polynomial (Control)

0.08 0,1 g/mL Extracto
0.06 Polynomial (0,1 g/mL Extracto)
0.04 0,05 g/mL Extracto
0.02 Polynomial (0,05 g/mL Ex-
0 tracto)
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

Acetilcolina(mM)

Fig. 8: Representación de la velocidad de la reacción en función de las

concentraciones del sustrato Ach, en presencia y ausencia de concentraciones
del extracto hidroalcoholico de Perezia pinnatífida, con un tiempo de reacción
de 3 min y una temperatura de 37 ºC.

Se determinarse la actividad inhibitoria de AchE para cada concentración del

extracto en base al siguiente fórmula:

(V 0 control−V 0 extracto)
%Actividad inhibitoria de AchE: x 100
V 0 control

Donde V0 control= Velocidad inicial del control; V0 extracto = Velocidad inicial del
extracto hidroalcoholico de P. pinnatífida.

Encontrándose que para una concentración de 0,1 g/mL del extracto se da la

inhibición de la actividad enzimática de la AchE en un 73% para las
concentraciones menores esta capacidad fue decreciendo en proporción a su
concentración

11. Discusión
Los estudios bioquímicos realizados para la detección de los principales
grupos de metabolitos secundarios coincidieron con los ya reportados por Lock
(2006) , Chavez (1993) y Piacente S. (1997 ), los cuales describieron la
presencia de flavonoides y alcaloides para esta especie

En cuanto a su capacidad como captadora de radicales libres, esta fue alta

(96.14% de la quercitina), ya que el estándar utilizado se usa mucho como
referencia en estas pruebas, esta capacidad podría deberse a la presencia de
los flavonides encontrados en el estudio fitoquimico.

Los parámetros óptimos ( sustrato= 0,21 mM Ach, Homogenizado = 20 µL,

Temperatura = 37ºC y tiempo de lectura =3 minutos) fueron determinados
debido a las condiciones de los equipos utilizados en la medición asi como
también a su resolución.

En cuanto a la actividad inhibitoria de la enzima AchE se encontró que la

concentración del extracto va directamente proporcional al efecto inhibitorio,
siendo la concentración de 100mg/mL, la que tuvo un mayor efecto(73%)en
comparación con las otras concentraciones probadas . Tomando como
referencia otros estudios, las concentraciones del extracto de las plantas que
utilizan son menores, por ejemplo se uso una dosis de 0.1 mg/mL en dos
especies (Stephania suberosa Forman. y Tabernaemontana divaricata (L.), las
cuales mostraron una inhibición de 65-90% AchE, y otras cuatro (Butea
superba Roxb., Piper interruptum Opiz., Piper nigrum L. y Cassia). Esta
disminución de la concentración del extracto se debe a que los ensayos
realizados en esas pruebas se basaron a un método colorimétrico, en donde
la coloración de la planta influye mucho a la hora de hacer la medición en el
espectrofotómetro, ya que la presencia de una muestra con coloración intensa
opacaría la lectura del complejo que se utiliza en dichas pruebas.

Por otra parte su alta capacidad antioxidante y su alto efecto inhibitorio de

AchEestan relacionados, ya que es sabido que los antioxidantes fitoquímicos
pueden actuar como inhibidores de la AChE ; por ejemplo, flavonoides y otros
fenoles (Kim et al. 2004 ) . Los resultados encontrados hasta ahora en cuanto
a actividad antioxidante y la presencia de flavonoides, importantes para
contrarrestar los procesos inflamatorios (Costa J. 1993)

Además del efecto de los polifenoles en la inhibición de AchE, es sabido que

también los alcaloides poseen esta capacidad , un claro ejemplo de ellos es el
extracto acuosos de la raíz de Catharanthus roseus (L.) G. Don, presento una
la fuerte inhibición de la enzima en un método in vitro, responsabilizándose de
esta actividad a varios alcaloides presentes ene sta planta pero en particular a
la serpentina (CI50: 0.775 μM), así mismo, en otros alcaloides estudiados se
detecto un efecto similar por diferentes mecanismos en la neurotransmisión
colinérgica (Pereira et al., 2010).
12. Conclusiones

El extracto hidroalcoholico de las raíces de P. pinnatífida, presento una

buena actividad antioxidante y ademas dicha capacidad se les puede
atribuir a la presencia de los grupos de metabolitos secundarios detectados
(alcaloide, flavonoides, esteriodes y terpenos),
En cuanto a la actividad enzimática, se determino que la muestra de AchE
con las que se realizo los ensayos, presento Vmax de 0,12 mM y un
Km de 0,233 pH/min al ser evaluados a un temperatura de 37ºC por 3
minutos. En base a esto se determino que el extrato es un buen inhibidor
de la Ache(inhibe en 73% su actividad) a una concentración de 0,1g/mL
del extracto hidroalcoholico de las raíces Perezia, lo que da cabida a
profundizar su estadio en otro modelos para garantizar dicha actividad

13. Referencias bibliográficas

1. Anekonda T.S. & Reddy P.H. 2005. Can herbs provide a new generation
of drugs for treating Alzheimer’s disease? Brain Research Reviews, 50,
361-376.

2. Akhondzadeh, S. & Abassi, S.H. 2006. Herbal medicine in the treatment

of Alzheimer’s disease. American Journal of Alzheimer’s Disease and
Other Dementias, 21, 113-118.

3. Berchtold, N.C. & Cotman, C.W. 1998. Evolution in the conceptualization

of dementia and Alzheimer's disease: Greco-Roman period to the 1960s.
Neurobiology of Aging, 19, 173-189.

4. Brlihlmann, C., Marston, A., Hostettmann, K., Carrupt, P.A., Testa,

B.2004. Screening of non-alkaloidal natural compounds as
acetylcholinesterase inhibitors. Chem. Biodivers. 1, 819–829.
5. Brookmeyer, R., Gray, S. & Kawas C. 1998. Projections of Alzheimer's
disease in the United States and the public health impact of delaying
disease onset. American Journal of Public Health, 88(9), 1337-1342.

6. Cáceres A. Evaluación de la actividad inhibitoria de la

acetilcolinesterasa por diez especies medicinales y aromáticas nativas
como posible fuente para el tratamiento de afecciones de la memoria.
Julio de 2011, Guatemala (Informe Final Proyecto FODECYT 39)

7. Cacabelos, R. 2001. Enfermedad de Alzheimer. Revista Colombiana de

Psiquiatría, 30,323-350.

8. Carr, D.D, Goate, A. Morris, J.C. 1997. Current concepts in the

pathogenesis of Alzheimer’s disease. American Journal of Medicine,
103(3A), 3S-10S.

9. Copeland R. A. 2000. Enzymes: A practical introduction to structure,

mechanism and data analysis. 2nd Edition Edit. John Wiley & Sons. Inc,
U.S.A.; p. 266-281.

10. Cuartero M., Ortuño J.A., García M.S., García-Cánovas F. 2012. Assay
of acetylcholinesterase activity by potentiometric monitoring of
acetylcholine. Analytical Biochemistry 421: 208–212

11. Desmarchelier C., Ciccia G., Coussio J. 2000. Recent advances in the
search for antioxidant activity in south american plantS. Atta-ur-Rahman
(Ed.) Studies in Natural Products Chemistry, 22: 343-36.

12. Eldeen, I.M.S., Elgorashi, E.E., van Staden, J. 2005. Antibacterial,

antiinflammatory,anti-cholinesterase and mutagenic effects of extracts
obtained from some trees used in South African traditional medicine.
Journal of Ethnopharmacology, 102, 457-464.

13. Enz, A., Amstutz, R., Boddeke, H., Gmelin, G., Malanowski, J., 1993.
Brain selective inhibition of acetylcholinesterase: a novel approach to
therapy for Alzheimer’s disease. Prog. Brain Res. 98, 431–438.

14. Ferrari, C.K. 2004. Functional foods, herbs and nutraceuticals: towards
biochemical mechanisms of healthy aging. Biogerontology, 5: 275 – 289.

15. Guevara J.G. Isoimidas monosustituidas como inhibidores de la

Acetilcolinesterasa(Tesis de maestria)(México, D.F.) Instituto Politécnico
Nacional; 2006. 146 p.
16. Gupta, A., Gupta, R. 1997. Survey of plants for presence of
cholinesterase activity. Phytochemistry, 46, 827-31

17. Guyton, A.C. 2001. Tratado de Fisiología Médica. 10 Ed. México: Nueva
Editorial Interamericana, S.A. de C.V.

18. Hardman J. G., Limbird L. E. 2006. Las Bases Farmacológicas de la

Terapéutica; Capítulo 6; “Neurotransmisión”. Edit. McGraw-Hill, México,
D.F. 152

19. Hartwell J. 1982. Plants Used Against Cancer. USA. Primera edición.
Editorial Quarterman Publications Inc.

20. Hernandez, M.F., Falé, L.L.V., Araújo, M.E.M. & Serrlheiro, M.L.M. 2010.
Acetylcholinesterase inhibition and antioxidant activity of Hypericum
species. Food Chemistry, 120, 1076-1082.

21. Houghton, P.J., Ren, Y., Howes, M.J. 2006. Acetylcholinesterase

inhibitors from plants and fungi. Natural Products Reports, 23, 181-199.

22. Howes M.J.R., Perry N.S.L., Houghton P.J. 2003. Plants with
traditional uses and activities relevant to the management of Alzheimer’s
disease and other cognitive disorders. Phytotherapy Research, 17, 1-18.

23. Ingkaninan, K., Temkitthawon, P., Chuenchom, K., Yuyaem, Y. &

Thongnoi, W. 2003. Screening for acetylcholinesterase inhibitory activity
in plants used in Thai traditional rejuvenating and neurotonic remedies.
Journal of Ethnopharmacology, 89,261-264.

24. Janeway, C. A. 1989. Approaching the asymptote Evolution and

revolution in immunology. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol, 54:113

25. Kim, H.K., Kim, M., Kim, S., et al. 2004. Effects of green tea polyphenol
on cognitive and acetylcholinesterase activities. Bioscience
Biotechnology and Biochemistry, 68(9):1977-1979.

26. Lemaitre, B.; Nicolas, E., Michaut, L., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A.
1996. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus
controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell,
86:973–983.
27. Lehninger Albert L., Nelson David L., Cox Michael M. 1995. Principios
de Bioquímica . 2a Edición Edit. Ediciones Omega, S.A.; España,
Barcelona; p.198- 236.

28. Le Marchand, L. 2002. Dossier: Polyphenols: diversity and bioavailability

Cancer preventive effects of flavonoids—a review Biomed
Pharmacother, 56: 296–301

29. Michel HO. 1949. An electrometric method for determination of red

blood cell and plasma cholinesterase activity. J Lab Clin Med;34:1564-8.

30. Mukherjee P., Kumar V., Mal M., Houghton P.J. 2007.
Acetylcholinesterase inhibitors from plants Phytomedicine, vol.
14(4):289-300.

31. Oh, M.H., Houghton, P.J., Whang, W.K. & Cho, J.H. (2004). Screening of
Korean herbal medicines used to improve cognitive function for anti-
cholinesterase activity. Phytomedicine, 11, 544-548.

32. Patel R. M., Patel N, 2011. In vitro antioxidant activity of coumarin

compounds by DPPH, Super oxide and nitric oxide free radical
scavenging methods. Journal of Advanced Pharmacy Education &
Research 1:52-68.

33. Pereira, D.M., Ferreres, F., Oliveira, J.M.A., Gaspar, L., Faria, J.,
Valentão, P. et al. 2010. Pharmacological effects of Catharanthus roseus
alkaloids in acetylcholinesterase inhibition and cholinergic
neutransmission. Phytomedicine, 17,646-652.

34. Rahman, A.U., Choudhary, M.I., 2001. Bioactive natural products as a

potential source of new pharmacophores a theory of memory. Pure Appl.
Chem. 73, 555–560

35. Shahrzad, S., Cadenas, E., Sevanian, A., Packer, L. 2002. Impact of
water-dispersible beadlets as a vehicle for the delivery of carotenoids to
cultured cells. Biofactor, 16: 83–91
36. Schulz, V., 2003. Ginkgo extract or cholinesterase inhibitors in patients
with dementia: what clinical trial and guidelines fail to consider.
Phytomedicine 10, 74–79

37. Siddiqui, M.F., Levey, A.I., 1999. Cholinergic therapies in Alzheimer’s

disease. Drugs of Future 24, 417–444.

38. Soreq, H. & Seidman, S. 2001. Acetylcholinesterase, new roles for an old
actor. Nature Reviews Neuroscience, 2, 294-302

39. Voet D., Voet J. G. 1995. Biochemistry 2th Edition. Edit. John Wiley &
Sons. Inc., U.S.A: 353.

40. Whitehouse, P.J., 1993. Cholinergic therapy in dementia. Acta Neurol.

149, 42–45