Qu es una levadura?

Organismo eucariote unicelular Pertenecea los hongos (Phylum Ascomycetes) Para nuestros objetivos levadura = Saccharomyces cerevisiae S. cerevisiae se divide por gemacin = levaduras = levadura de la cerveza = levadura del pan

Otros hongos de importancia

Schizosaccharomyces pombe, la levadura de fisin; modelos importantes en biologa celular y molecular, usados para ciertas fermentaciones Kluyveromyces lactis, la levadura de la leche; organismo modelo con importancia biotec por fermentacin de lactosa Candida albicans, patgeno humano, no es un buen modelo porque carece de ciclo sexual S. carlsbergensis y S. bayanus son especies relacionadas con S. cerevisiae; industria de cerveza y vino Pichia stipidis, Hansenula polymorpha, Yarrovia lipolytica de menos importancia en estudios genticos, huspedes para roduccin de proteinas Hongos filamentosos, un grupo grande de organismos modelo genticos en gnros como Cryptococcus, Aspergillus, Neurospora...., de importancia biotecnolgica, incluye patgenos humanos

Porqu se discute acerca de levaduras en este curso?

1. Es el mejor organismo para estudiar aspectos bsicos de biologa celular en eucariotes 2. Se necesita entender experimentos realizados en todas las especies 3. Las tcnicas usadas en levaduras son usadas para estudiar genes de otros organismos (tecnologa knockout, el sistema two-hybrid, herramientas genmicas, etc.

Ventajas de las levaduras

1. Pequeo tamao 2. Rpido crecimiento 3. Genoma pequeo 4. Gentica sofisticada
(debido al ciclo celular, alta frecuencia de recombinacin, facilidad de transformacin, anlisis por tetradas)

5. Susceptible de ser estudiado por bioqumica aunque es todava un eucariote tpico

Porqu estudiar gentica de levaduras

Puede pensarse en las levaduras no como bacterias grandes, sino como pequeos seres humanos

Las levaduras pueden hacer casi todo lo que hace un ser humano, excepto

El genoma de levaduras en pastilla

(antes de E. coli) 7 bp (16 cromosomas,72% regiones codificantes) 1.2 x 10 (humanos =1%)

Primer eucariote completamente secuenciado (4/24/96)

~5700 genes ~1/3 tienen homlogos en otros organismos ~1/3 se tienen pistas acerca de su secuencia ~1/3 ninguna pista de nada 4% tienen intrones (263 con uno, 10 con dos) Gen promedio = 1922 bp (1450 ORF + 472 intergnico) Han impulsado nuevas tecnologas/estrategias Nos permite concentrarnos en estudiar la funcin gnica

El genoma de levaduras con relacin a otros organismos

Gentica de levaduras: nomenclatura

 Genes: TPS1, RHO1, CDC28  utaciones recesivas: tps1, rho1, cdc28  Alelos mutantes: tps1-1, RHO1-23, cdc28-2  Deleciones: tps1(::HIS3  Proteina: Tps1, Rho1p, Cdc28p (la p es opcional)  Fenotipo: Tps -, Rho+, Cdc

Muchos genes han sido encontrados nicamente por secuenciacin sistemtica y tienen solamente un nombre sistemtico: YDR518C, YML016W..., donde
Y para yeast La segunda letra representa el cromosoma(D=IV, M=XIII....) L o R para brazo del cromosoma izquierdo o derecho El nmero de 3 dgitos para ORF contado desde el centrmero en el brazo del cromosoma C o W para Crick or Watson, i.e. indica la hebra de direccin del ORF

Algunos genes no siguen esta nomenclatura: HO, MATa, MATE

El ciclo de vida de las levaduras

Existen 3 versiones de levaduras (en el lab) haploides del tipo de cruce a haploides del tipo de cruce E a/E diploides Cada uno es mitticamente estable El fenotipo de los haploides refleja el genotipo. Las principales diferencias:

haploides
Producen feromonas de cruce Responden a feromonas Arresto en G1 ante ayuno

diploides
No producen o responden a feromonas Realizan meiosis y esporulacin ante ayuno

Clulas a vs Eversin simplificada

El ciclo de vida de las levaduras

1. Haploides se dividen mitticamente para producir una colonia haploide estable 2. Haploides de tipo de cruce opuesto pueden cruzarse para formar un diploide 3. Diploides se dividen mitticamente para producir una colonia diploide estable 4. Diploides ingresan a meiois y esporulan produciendo 4 haploides de progenie (tetrada) 5. En el lab, las tetradas pueden ser disecadas o la progenie haploide separada

Qu aspecto tienen?
A = crecimiento mittico
n n n
shmoo

n 2n

B, C, y D = un par de cruce

2n 2n n n n n

2n

E = sporulacin de diploides

Fusin celular y nuclear

Un par de haploides antes de cruzarse
Fusin celular

Fusin nuclear

Algunas ideas acerca de una estrategia para aislamiento de mutantes

Apreciar la naturaleza conceptual de la gentica clsica. Los mutantes puden ser aislados sin previo conocimiento de su funcin especfica El objetivo es aislar todos los genes que afectan un determinado proceso

Estrategias para la caza de mutantes (cont )

La identificacin de mltiples mutantes es:: 1) necesaria a veces y 2) extremadamente valiosa

Estrategia de seleccin
Apreciar la naturaleza conceptual de la gentica: los mutantes pueden ser aislados sin conocimiento de su funcin especfica El objetivo es aislar todos los genes que afectan un proceso Una caza general o especfica? Mutantes con vs. defectos de cruce (mating-defective mutants) Mating-defective mutants que: No producen feromonas No modifican feromonas No secretan feromonas No responden a feromonas No sufren arresto en G1 Son defectuosos para fusin celular Son defectuosos para fusin nuclear

Ideas acerca de la estrategia de seleccin Buscar diferentes clases de mutantes Mutaciones que bloquean un proceso

Mutaciones que aceleran o desregulan ese proceso Aceleracin/ Bloqueo Desregulacin

No muestra ciclo Transcripcin del gen GAL: No transcribe
Va de sealamiento: Accin de drogas: Ciclo celular:

Divisin rpida Trans. constitutiva Seal constitutiva Hipersensitiva

No sealamiento Resistente

Ambos tipos son importantes!

Ideas acerca de la estrategia de seleccin

Buscar diferentes clases de mutantes Mutaciones que bloquean un proceso Mutations que aceleran o desregulan un proceso Dominante vs. recesiva Cis-acting Condicional Fenotipo de hiperexpresin Otros (suppresores, letales sintticos, dominantes negativos, no complementarios no ligados, etc.)

Y si no obtenemos mutantes??
Porqu?? Genes esenciales Genes redundantes Fenotipos pleiotrpicos Ajustar astringencia

Tenemos mutantes!!. Y ahora qu???

Buscando levaduras resistentes a criptonicina

-UV

+UV

Test de dominancia
Porqu??
Solamente recesivos pueden ser usados en tests de complementacin Las estrategias de clonacin difieren para dominantes y recesivos Ayuda en la interpretacin de la funcin gnica WT

Cmo??

Ts- / Ts+

Si el heterocigoto tiene el fenotipo WT, la mutacin es RECESIVA para el wild type Si el diploide tiene el fenotipo mutante, la mutacin es DOMINANTE

Test de dominancia (cont )

Interpretaciones
Las mutaciones recesivas son interpretadas sencillamente como debidas a una prdida de funcin

La interpretacin de las mutaciones dominantes es ms compleja. Varios mecanismos: Ganancia de funcin normal

Test de dominancia (haploinsuficiencia)

Haploinsuficiencia: Una reduccin en la cantidad de producto WT en el diploide causa un fenotipo mutante
Si ms del 50% de actividad es necsaria para el fenotipo WT en el diploide, en este ejemplo el diploide tendr un fenotipo mutante debido a haploinsuficiencia Se afecta por: Cunto de la funcin se pierde Cunto de la funcin se necesita Existe regulacin por feedback?

Test de dominancia (cont )

Negativos dominantes: cuado una proteina tiene ms de una funcin, pierde una de sus funciones por una mutacin y la proteina mutante compite con la wild type en el heterozigoto diploide

Ganancia de funcin Proteinas de fusin anormal: Especificidad alterada (e.g. sustrato) Proteina mal localizada

Gentica de Levaduras y Biologa Molecular: 2

Parte 2: Tcnicas genticas bsicas

Dominancia Complementacin Linkage analysis (tetradas)

Si no obtenemos ningn mutante??

Porqu?? Gen esencial (solamente raras mutaciones) Genes redundantes Fenotipos pleiotrficos La seleccin es demasiado exigente Qu hacer?? Mutagenizar/diferent mutageno / ms celulas Intentar seleccin fenotpica (opuesta?) Sensibilizar la va (supresores/aumentadores) Seleccionar en lugar de tamizar

Seleccin vs tamizaje (screening)

Bien, tenemos mutantes, ahora qu hacemos?

Test de dominancia
Porqu??
Solamente recesivos pueden ser usados en tests de complementacin. Las estrategias de clonacin difieren para dominantes y recesivos Ayuda a interpretar funcin gnica en WT

Ts- / Ts+

Si el heterocigote tiene fenotipo WT, la mutacin es RECESIVA para el WT

Si el diploide tiene el fenotipo mutante, es DOMINANTE

Test de dominancia (cont )

Interpretaciones Las mutaciones recesivas se interpretan ms sencillamente como debidas a prdida de funcin

Las mutaciones dominantes se interpretan ms difcilmente. Pueden ser causadas por diferentes mecanismos: Ganancia de funcin normal

Test de dominancia (haploinsuficiencia)

Haploinsuficiencia: Una reduccin en la dosis del gen WT en el diploide causa un fenotipo mutante
Si ms del 50% de la actividad es necesaria para el fenotipo WT en el diploide, en este ejemplo el diploide tendr fenotipo mutante debido a haploinsuficiencia Qu determina si una prdida de funcin es recesiva o dominante debido a haploinsuficiencia? Cunto de la funcin se pierde Cunto de funcin se requiere para el fenotipo WT del diploide Regulacin por feedback

Test de dominancia (cont )

Dominantes negativos: Cuando una proteina tiene ms de una funci, pierde una de esas funciones debido a mutacin y la proteina mutante compite cpn aquella WT en el diploide heterocigote

Ganancia de funcin anormal:

Proteinas de fusin Especificidad alterada Proteina errneamente localizada

Diferenciando los mecanismos de mutaciones dominantes Ganancia de funcin normal Dominante negativo (hipermorfo) (antimorfo)

Dosis-sensitivo: fenotipo ms severo que nulo en relacin a WT. Overexpresin puede exacerbar el fenotipo.

Haploinsuficiencia
Un alelo nulo sobre el WT debera causar el mismo fenotipo dominante

Ganancia de funcin anormal

(neomorfo)

El alelo nulo se espera que cause fenotipos no relacionados

Test de complementacin
Porqu?? Empezar a analizar cuntos genes fueron identificados mediante la cacera de mutantes Cmo?? Cruzar dos cepas con el mismo fenotipo mutante, examinar el fenotipo del diploide

De la teora a la realidad:

Cunto podemos aprender de este plato?

Examinando complementacin en levaduras

Cuidado con las excepciones! (parte 1)

Complementacin intragnica
Cuando mutaciones recesivas en el mismo gen se complementan

Se interpretan usualmente como debidas a mutaciones en una proteina multimerica o multifuncional

Cuidado con las excepciones! (part 2)

No complementacin no-ligada (extragnica) Cuando mutaciones recesivas en dos diferentes genes no se complementan

Los modelos de porqu esto ocurre invocan un complejo multiproteinico

Un test de complementacin por s solo no identifica con total certeza cuntos genes estn involucrados

Sugerencia: buscar fenotipos adicionales

Porqu? 1. Arroja datos acerca de funciones insospechadas de los genes encontrados en la bsqueda de mutaciones 2. Provee potencialmente estrategias de clonacin ms simples 3. Provee un medio lgico para decidir qu mutantes estudiar primero 4. Provee datos para el agrupamiento de genes

El valor de examinar fenotipos no seleccionados

Anlisis linkage (anlisis de tetradas) 1 2 3 4 5 6 7 8

a b c d

Uses de anlisis de relacin ( linkage analysis):

Mapeo de genes relativos uno a otro o al centrmero Un fenotipo se debe a una mutacin de un solo gen? Crear combinaciones mutantes dobles (construccin de cepas) Probar si el gen correcto ha sido clonado Examinar revertantes (revertants) Examinar si dos fenotipos se deben a la misma mutacin

Segregacin de una mutacin sola durante meiosis

Si el fenotipo es debido a una sola mutacin, la mutacin debera segregar 2:2 durante cada meiosis resultando en dos esporas WT y dos esporas mutantes Si la mutacin causa cualquier otro fenotipo, estos fenotipos edberan cosegregar en cada espora

Anlisis de tetradas (cont...)

Pregunta #1:
El fenotipo segrega 2:2 a travs de cada meiosis? SI: el fenotipo es debido a mutacin en un solo gen

NO: algo ms ocurre

(ej. mutaciones mltiples no ligadas, plasmdicas, mitocondriales)

2:2 Tetrads

Not 2:2 Tetrads

Hay 3 tipos de tetradas

Rb x rB
R = resistente a frmaco r = sensible
B = blanco b = azul

PD, NPD y T simplemente describe el patrn de segregacin de dos marcadores en una sola meiosis en relacin a su distribucin en las cepas padres Una tetrada puede ser un PD para un par de marcadores y un NPD para otro par Los recombinantes aparecen a partir de dos tipos de eventos: segregacin al azar de cormosomas durante meiosis I y crossovers entre marcadores y sus centrmeros

Segregacin de dos mutaciones ligadas durante meiosis

ura3YFG+ URA3+ YFG+URA3+

YFG+URA3+

a b c d

meiosis I
yfg- ura3X X X X

YFG+URA3+

M II

YFG+URA3+ yfg- ura3-

yfgX X

ura3X X

yfg- ura3X X

yfg- ura3-

Si dos mutaciones estn cercanamente ligadas, los fenotipos resutantes deberan cosegregar durante la mayor parte de meiosis resultando en la configuracin parental en la mayor parte de tertadas Si las dos mutacioes no estn relacionadas, se observarn tetradas recombinantes con alta frecuencia

Segregacin de dos mutaciones no ligadas durante meiosis

Algo acerca de eventos de crossover?

Crossovers entre cualquiera de los marcadores y sus respectivos centrmeros generarn tetradas recombinantes (tetratipos)

Un solo crossover entre dos mutaciones ligadas genera una tetrada tetratipo

YFG+URA3+ URA3+

YFG+URA3+

a b
T

meiosis I
yfg- ura3X X X X

YFG+ ura3-

M II

YFG+ ura3X

yfgyfgX X

URA3+

URA3+
X

c d

yfg- ura3X X

yfg- ura3-

Pregunta #1:El fenotipo segrega 2:2 durante la meiosis?

SI: El fenotipo es debido a una mutacin en un solo gen NO: Algo ms est pasando

Resumen del anlisis de tetradas (linkage analysis)

Pregunta #2:Hay tetradas recombinantes (NPD y T)?

NO: Las mutaciones estn cercanamente ligadas SI: Los dos genes estn al menos parcialmente no ligados
(para genes completamente no ligados, el radio PD:NPD:T ser 1:1:4)

Porqu?
Respuesta sencilla: si no ocurre recombinacin (perfect linkage), solamente se observarn PDs. Los eventos de recombinacin generan NPD y Ts con los radios dependiendo de cun fuertemente ligados estn (el nmero de eventos de recombinacin), el nmero de cepas involucradas, si los genes estn en diferentes cromosomas y si los eventos de recombinacin son relativos a sus centrmeros

Anlisis de tetradas (mapeo)

N N S (5 cM) N N S (20 cM)

Dominancia vs. complementacin vs. Dominancia linkage

Cruzar un mutante y una cepa WT, examinar el fenotipo del diploide heterocigoto Complementacin: un test de FUNCION Cruzar dos cepas MUTANTES con el mismo fenotipo mutante, examinar el fenotipo del diploide Linkage: un test de LOCALIZACION Examina la progenie de una meiosis

Tenemos los mutantes. Y ahora???

Buscando levaduras resistentes a kriptonicina

-UV

+UV