Introducción

¿Qué es un gen?

- Es una unidad física y funcional es básica en la herencia que pasa de padres a hijos

- Los genes segmentados de ADN; Codifican moléculas de RNA o tienen información

para elaborar proteínas especificas

 Los genes están dispuestos en cromosomas que vendría a ser una única molécula larga de
ADN y solamente una parte de esta corresponde a un gen particular

 En los seres humanos hay aproximadamente 20.000 genes

 Molecularmente un Gen es una secuencia de nucleótidos contiguos a una molécula de

ADN/ARN en algunos virus que contiene información para la síntesis de una
macromolécula con función específica, ósea, vinculados al desarrollo o funcionamiento
fisiológico

Estructura de un GEN
 Consta de una secuencia de intrones y exones, los exones son la secuencia codificadora y
los intrones no
 Secuencias regulatorias en 3´ o 5´

- 5 está la secuencia promotora y mas alejada de esta van a regular la expresión especifica
del GEN los potenciadores o silenciadores

- También se encuentran las 5 UTR y 3 UTR no van a codificar para proteínas, son
importantes para regular la expresión de los genes, tanto espacial como temporalmente

Alelo
Es cada una o más versión de un gen tanto de padre y madre, se encuentran dentro de los
cromosomas homólogos
Forma alterna de un gen que difieren en su secuencia de nucleótidos
Toda característica que está determinada genéticamente va a estar dependiendo de los genes
Homólogos
Si son iguales son homocigotas para A-A para ese GEN idéntico y también a-a
Si son distintos son Heterocigotas para a-A o A-a

¿Qué es la dominancia Genética?

 Alude al vinculo que se establece entre los alelos que forman parte de un mismo GEN

 El producto de uno de estos alelos consigue enmascarar el fenotipo del otro Alelo es el
Dominante y el que queda es el Recesivo

 El producto génico que domina puede ser apareciendo en doble dosis o una simple,
consiguiéndose imponer en la expresión de ciertas características fenotípicas

¿Qué es la codominancia?

 Es cuando los productos alelos distintos de un mismo GEN derivan en un mismo Fenotipo y
sus productos participan por igual en la expresión del Fenotipo

Ej.: Grupo sanguíneo AB0

Es un polimorfismo de oligosacáridos resultado de un polimorfismo proteico en las

Glicosiltransferasas responsables de su propia síntesis

Básicamente existen 3 alelos para el GEN ABO que codifica el mismo Glicosiltransferasa,
que codificara 3 distintos tipos de oligosacáridos

A y B esta condicionada por otro GEN polimórfico el H cuyo producto es otra

Glicosiltransferasa que sintetiza el antígeno H sobre el cual actúan las transferasas
codificadas por el GEN ABO

Alelos Múltiples
La mayoría tienen dos formas Alélicas, algunos tienen múltiples
Ej.: común ABO

 Hay cuatro fenotipos (A, B, AB u 0) y seis posibles genotipos para los grupos ABO
humanos

- 4 Fenotipos: A, AB, 0

- 6 Genotipos: AA; BB; AB; A0; B0; 00

o Fenotipo A: Corresponde a AA o A0

o Fenotipo B: Corresponde a BB o B0

o Fenotipo AB: Corresponde a AB CODOMINANCIA

o Fenotipo 0: Corresponde 00 porque es recesivo al Alelo A y B

Compuestas Heterocigotas heredan la variante patogénica, ósea pueden heredar una enfermedad
autosómica recesiva. Pueden ser homocigotas para la misma variante de un alelo patogénico o
heterocigota para una variante patogénica en un mismo GEN

Polimorfismos
Variaciones comunes en nucleótidos y que se encuentra con frecuencia en mas del 1% de
individuos
No se han determinado que no sean funcionales y otros tienen cierto grado de susceptibilidad a
algunas enfermedades complejas

¿Como se encasillan las variantes patogénicas Benignas, Malignas o Neutras?

 Evalúan 28 tipos de características

Frecuencia Alélica- Análisis Funcionales- Predicciones in-silico (A través de internet
donde hay distintas bases de datos para distintos casos, utilizando los datos del GEN)-
Análisis de Segregación, Relación Geno-Feno-Mecanismo molecular por el cual se
desarrolla la enfermedad- Tipo de variante

 Se le asigna un código Alfanumérico que valora su contribución al nivel de la

Patogenicidad
Los códigos se combinan y los clasifican en 5 clases

- Clase 5: El score da una probabilidad mayor del 0,99 de que esa variante es Patogénica. Le
debo hacer un seguimiento de alto riesgo, informar a los familiares y de reducción de riesgo

- Clase 4: El score da 0.95 o 0.99 Probablemente patogénico y el mismo seguimiento. Se

debería hacer un test genético familiar y de reducción de riesgo

- Clase 3: El score da 0.05-0.949 es un resultado incierto y se debería estudiar mas e informar

a la familia, para saber si pueden llegar a desarrollar la enfermedad. Se debería
hacer un test genético Familiar

- Clase 2: El score 0.001-0.049 Probablemente no patogénico y no se toman medidas

importantes

- Clase 1: El score 0.001 No patogénica con poco seguimiento

PCR Alelo especifica

 Sirve para detectar variantes genéticas missense/sinónimas

3´ del cebador no es complementario y se utilizan 3 primers

 1 primer Forward con secuencia Wild Type

 1 primer Forward con secuencia cambiada en 3´ de acuerdo a la mutación que se busca
 1 primer Reverse con secuencia Wild Type
Todo se hace de manera simultanea
El DNA-Pol solo amplifica cuando el missmatch entre el molde y primer sea al 100%. El
fragmento de ADN amplificado va a tener determinado tamaño y se visualizara en una
corrida Electroforética
Cada primer dará distintos tamaños del fragmento por lo que vamos a tener 2 bandas y
podemos distinguir si es Homocigoto o Heterocigoto
Siempre con blanco de RN, y controles positivos y negativos

Secuenciacion Sanger Automatizada

 Fluorescencia permite la automatización

 La detección de fluorescencia es simultanea a la electroforesis y permite eliminar
fragmentos ya secuenciados
Se utiliza para estudiar genes chicos o estudiar mutaciones conocidas demanda muchas horas y
es costosa. Se utiliza más la Secuenciacion Masiva
Amplificamos por PCR con Forward y Reverse, hacemos la reacción de secuenciación
asimétrica:
Tomo una muestra de ese ADN amplificado y con fluorocromos específicos para los
nucleótidos. Nos dará una amplificación asimétrica entre los dos tubos, en uno estará con primer
Reverse y otro Forward entre esos tubos donde se realizará la electroforesis
Los colores van a ser
Guanina
Citocina
Timina
Adenina
Donde hay cambio de Nucleótidos se verían las bandas de dos colores superpuestas, puede ser
igualmente un Polimorfismo no necesariamente Patogénica
Inserción o deleción de 1 o 2 Nucleótidos, Corrimiento de Marco de Lectura y veríamos
superposiciones de doble pico por lo general es patogénica
Diferencias entre secuenciación Masiva y Sanger
1. En Sanger puedo hacer en forma simultánea la secuenciación de hasta 96 regiones de
ADN o pacientes
2. Masiva puedo secuenciar en Paralelo masiva cantidad de regiones y pacientes. Se
estudia de manera simultanea de manera simultanea y de varios pacientes
¿Como es la secuenciación Masiva?
1. El ADN Vamos a formar lo que es la librería o fragmentación:

- Vamos a fragmentar de manera mecánica o por una enzima Trasfosasa que corta al azar al
ADN, dándonos pequeños fragmentos aleatorio

- A cada uno de los fragmentos se le va a añadir mediante una ligasa secuencias adaptadoras

2. Se hace una amplificación

- Se toma un primer con secuencias complementarias a los adaptadores

- Los adaptadores están formados por un código de barra llamado índice. Nos va a identificar
a que paciente pertenece. Otra parte es complementaria a un oligonucleótido en la celda de
flujo

3. Secuenciacion

- La celda de flujo son pasillos microscópicos donde los oligonucleótidos se van a pegar
gracias a la complementariedad que van a tener los adaptadores, ahí es donde se va a
amplificar y va a quedar un ADN de doble cadena.

La hebra original va a ser removida y quedará la de síntesis, que se doblará y se

unirá al otro Oligonucleótido ligado en la celda, que dará la amplificación en
puente. Donde esta será cortada y quedará una hebra simple cadena, así se
repite el ciclo generando un clon de cada hebra de ADN. Ese clon será
secuenciado por la secuenciación por síntesis y utilizaremos los nucleótidos con
distintos fluorocromos

- Básicamente las reversas se van y las Forward se quedan

4. Obtendremos una gran cantidad de datos gracias a los millones de lecturas cortas

-
 Variabilidad genética

¿Qué es el genoma?

 Material genético de un organismo en particular, constituye los genes y las secuencias

relacionadas ósea codificantes o no codificantes

Genes y secuencias relacionadas (30%)

 Codificantes:

- Constituyen el 10%

 No codificantes

- Constituyen el 90%

Son:
- Pseudogenes
- Fragmentos génicos
- Intrones y secuencias no traducidas

ADN Extra génico (70%)

 80% con secuencias únicas con pocas repeticiones

 20% secuencias moderadas y altamente repetitivas:

- Repeticiones dispersas
- Repeticiones en Tándem

Regiones de alta variabilidad = Muchas variantes = Múltiples alelos

Esto nos permite identificar individuos y establecer vínculos de parentescos
Alelos:

 Secuencia normal-patrón-Wild type (más frecuente)

 Secuencia distinta a la variante Wildtype
- Si se presenta con frecuencia mayor al 1% tenemos un Polimorfismo

- Estas variantes pueden tener efecto o cambio en el fenotipo

- Ventaja en la sobrevida de la población o una variante patogénica

Marcadores Polimórficos VNTR (Repeticiones en Tándem de Numero Variable y STR

(Repeticiones cortas en Tándem) Tándem seria una al lado de la otra

 Ambas están formadas por una unidad de repetición = secuencia de nucleótidos

- Decenas a centenas de pares de bases son Minisatelites

- 2-7 pares de bases son Microsatélites

 Estos Alelos distintos están formados por la misma unidad de repetición, pero la
cantidad de veces que aparece va a determinar dicho Alelo

 Una ventaja de estos es que se pueden recuperar gracias a la técnica de PCR

 Existen regiones flanqueantes de secuencia no redundantes para poder diseñar los

primers específicos, ósea con un mismo primer podemos recuperar las distintas
secuencias

¿Cómo se generan estos Alelos distintos?

 Deslizado de la polimerasa que ocurre durante la replicación

- Esta polimerasa mientras va polimerizando puede tener una disociación del ADN y
dará un emparejamiento desigual de las dos hebras de ADN

- Puede aumentar el número o disminuirlo por el deslizamiento, dependiendo de

como se produce el emparejamiento

 Crossing Over desigual durante la Meiosis

Lo mismo aumenta o disminuye
Locus simple vs Loci múltiple

 Loci múltiple da una huella digital de ADN

- Significa que estudiamos que alelos están presentes en cada región VNTR O STR
para un individuo o distintos

 Supongamos que analizamos los marcadores moleculares por un análisis simple

- El objetivo será evaluar las características genético poblacionales de un marcador

polimórfico
- El marcador puede ser un Micro/Mini-satelite de interés: PCR

Diseñamos los primers específicos para un locus minisatelite de interés y a partir de

esto podemos obtener toda la variabilidad Alélica de este sitio de interés

Necesitamos tener todo el material genético de los individuos de interés y todos los
elementos de interés

Obtendremos la información genética total para este sitio en especifico como somos
haploides tenemos dos copias para dichos sitios y pueden coincidir como no

Podemos realizar una electroforesis en un gel de agarosa

Identificación de individuos

 Podemos estudiar varios Loci en simultaneo gracias a un Locus

 Se analizan diferentes VNTR o STR, que darán un perfil de banda para cada individuo

 Está asociado a una probabilidad de identificación

Donde vemos varias bandas para un mismo individuo se lo conoce como Huella de ADN y se
utiliza mucho en escenas del crimen
Si elegimos marcadores no polimórficos tendríamos una similitud y se perdería la especificidad
de la identificación. También sirve para establecer vínculos de parentesco

Medicina de precisión: Nos permite saber el riesgo de una población a través de un análisis
poligénico y así poder aplicar una medicina preventiva