Unidad 19A.

Replicación del ADN

 19.1 Replicación del ADN
19.1.1 Dogma central de la biología molecular
La información almacenada en el ADN dirige la
síntesis de proteínas. Replicación
Este debe replicarse. ADN
Transcripción
El flujo de información biológica va del ADN al Transcripción reversa
ARN
y de este a las proteínas. ARN

Traducción
En los retrovirus se ha encontrado una enzima
que cataliza la Transcripción Reversa. Proteínas

Bioquímica 2
 19.1.2 Generalidades de la replicación
Duplicación, lo más fiel posible, del genoma.
Genoma es una hélice doble, con hebras antiparalelas y complementarias.
3’-AGGTCC..........AGGAGC-5’
5’-TCCAGG...... ...TCCTCG-3’
Doble hélice debe copiarse para formar dos nuevos genomas.
Estos se separan en la división celular
Diferente en procariotas y eucariotas
Con mecanismos comunes.
Realizada por el replicón o replisoma.

Bioquímica 3
 19.1.3 ¿Qué pasa con el genoma original?
Posibles formas de replicación:
Conservativa:
Un genoma (ADNdh) conserva las hebras originales (hebras madre) y el
otro está formado por las dos nuevas hebras (hebras hijas).
Semi conservativa:
Cada uno de los dos nuevos genomas (ADNdh) tiene una hebra original
(hebra madre) y una nueva (hebra hija) .
No conservativa:
Ambos genomas (ADNdh) tienen en cada hebra secciones distribuidas al
azar de la hebra original (hebra madre) y de la nueva (hebra hija).

Bioquímica 4
 19.1.3.1 Experimento de Meselson y Stahl (1958) - Concepto
Usaron ADN marcado con N15 (más denso) para evaluar diferentes generaciones.
Diferencia de densidad se evalúa al centrifugar en un gradiente de densidad de CsCl.

Bioquímica 5
 19.3.2 Meselson y Stahl (1958) - Proceso
1. Crecen bacterias en medio con N14. Densidad del ADN baja. Testigo.

2. Crecen bacterias en medio con N15. Densidad del ADN alta (N15).

3. Inician crecimiento en medio con N 14. Toman muestra media generación y

encuentran dos bandas una de densidad intermedia (N 14/N15) con el doble de
absorbancia de otra de densidad alta (N 15).
4. Al final de la primera generación con N 14 . Solo hay una banda de densidad
intermedia (N14 y N15). Sugiere que es semiconservativa.

5. Al final de la segunda generación en N 14 . Hay dos bandas de igual absorbancia

una con densidad intermedia (N14/N15) y otra con densidad normal (N19). Es
semiconservativa.

6. Al final de la tercera generación en N14 . Hay dos bandas una con densidad
intermedia (N14/N15) y tres veces la absorbancia de otra con densidad normal
(N14). Confirma semiconservativa.

Bioquímica 6
 19.1.4 La replicación es secuencial
19.1.4.1 Experimento de Lark, Repco y Hoffman (1963)
Usan E. coli auxótrofa para timina.
1. Cultivo se inicia en medio con timina normal.

2. Pulso de H3-timina a tiempo definido (tP) con duración

de un décimo de una generación (0.10T)

3. Se continua hasta el final de generación (T) con timina normal para

obtener una ADN con un 10% marcado con H3-timina.

4. Células se separan y cultivan en medio con 5-bromo-uracil

desoxirribosa (BrUdR) más denso que UdR.

5. Muestras tomadas antes de tP solo contiene fragmentos con

densidad normal y marca H3 o alta densidad sin marca H3.

6. Cuando el tiempo pasado es superior a tP se hallan también

fragmentos con marca H3 y más densos.
Resultado: Replicación del ADN es secuencial.
Bioquímica 7
 19.1.5 La replicación es bidireccional
19.1.5.1 Experimento de Cairns (1963)
Autorradiografía en ADN de E. coli (1963)

Resumen del experimento del Cairns (1963) Explicación del intermediario de replicación de la 2ª generación

PC = punto de crecimiento

PC Origen PC Origen
Hélice sintetizada en
TH3 TH3 la 2ª generación
PC Hélice sintetizada en PC
la 1ª generación

1ª generación 2ª generación 2ª generación

Doble cantidad
Las bacterias se replican durante
dos generaciones en un medio de marca
con Timidina tritiada (TH3)

Auto radiografía Auto radiografía

Bioquímica 8
 19.1.5.2 Experimento de Cairns (1963) - Continuación
Micrografías en ADN de E. coli (1963)

Se mostró la circularidad del cromosoma.

Se indicó la posibilidad de la bidireccionalidad.
Se sugirió un solo punto de origen.
Bioquímica 9
 19.1.5.3 Experimentos de Cairns (1969)
Autorradiografía en ADN de E. coli con dos tipos de marcas.

Posibles resultados. Origen Origen

Unidireccional
Origen

Marca inicial de Marca seguida de

baja radioactividad. Origen alta radioactividad. Origen

Bidireccional

Resultado: Marcas débiles entre las dos lados fuertes.

Conclusión: Bidireccional.
Bioquímica 10
 19.1.6 La replicación en procariotas tiene un origen
Comprobado por estudios que comprobaron bidireccionalidad.

Bioquímica 11
 19.1.7 La replicación tiene velocidad fija
Procariotas tiene duración fija y mínima.
Velocidad 1000 pares de bases por segundo
6 × 104 pares de bases por minuto.
Genoma (E. coli)  4.2 × 106 (420 × 104) pares de bases.
Tiempo lineal:  70 minutos
bidireccional  35 minutos.
Replicación debe completarse 20 a 25 minutos antes de la división.
 No debería haber menos de 60 minutos entre dos divisiones.

60 minutos 40 minutos 20 minutos

antes de división división
antes de división antes de división

Bioquímica 12
 19.1.8 Replicación con alta tasa de división
¿Como explicar duplicaciones cada 30 o 20 minutos en E. coli?

Aún cuando una replicación no ha terminado 

ya se han iniciado las replicaciones en las dobles hélice hijas.

30 minutos 20 minutos 10 minutos división

antes de división antes de división antes de división

Bioquímica 13
 19.1.9 Replicación en Eucariotas. Varios orígenes
Eucariotas  semiconservativa, secuencial y bidireccional.
Velocidad  100 pares de bases por segundo 6 × 103 pares por minuto.
Genoma (humano)  3.4 × 109 pares de bases
Tiempo bidireccional  5.7 × 105 min = 9.4 × 103 hs = 393 días
real  6 a 12 horas Origen Origen
O O

Diversos orígenes de replicación uno por replicón.

O
T O T T

Entre dos orígenes hay un punto de terminación. T

O
T
O
T

O T O
T T

Bioquímica 14
 19.1.10 Replicación se localiza en la membrana
Enzimas y coenzimas de la replicación
 están asociadas al interior de la membrana celular.
Cromosoma parece unido a la membrana:
 en orígenes de replicación y
 en los puntos en pleno crecimiento.

Evidencia Física:
Lisis suave de ADN en replicación y centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa.
Se obtienen fracciones de ADN altamente sedimentables, asociadas a membranas.

Evidencia Química:
Cultivos en crecimiento exponencial marcados con H3-timina.
Marca aparece primero en el ADN asociado la membrana.
Obviamente el que estaba en el punto de replicación.
Bioquímica 15
 19.2 Proceso de Replicación en Procariotas
19.2.1 Iniciación
19.2.1.1 Desenrollado del ADN - Topoisomerasas
Las topoisomerasas alivian la tensión de las superhélices de ADN
contribuyendo a su desenrollado.
Girasa o topoisomerasa II del ADN actúa en la replicación.
1) Corre delante de horquilla replicativa.
2) Corta ambas cadenas en un punto.
3) Pasa la otra doble cadena pasa al otro lado.
4) Se repara corte gastando ATP.

Bioquímica 16
 19.2.1.1a Mecanismo de la topoisomerasa II
El sitio activo contiene una Tyr que hace el ataque al enlace fosfodiéster.
1. Tyr-OH se une a 2. Tyr-OH se separan y 3. Otra hebra pasa al otro lado
las dos hebras. abren espacio y se regeneran enlaces.

Tyr-OH se desprotona y ataca al P del

enlace fosfodiéster.
El 3´C-O— liberado se protona.
Queda un fosfodiéster de
E-Tyr-O—PO2 ——O-5´C-ADN.

Bioquímica 17
 19.2.1.2 Preparación de origen - Proteína DNA-A

Iniciación de la replicación.
1) Se une secuencia cercana a OriC.
2) Favorece formación de lazo.
3) Requiera ATP para su forma activa.
4) ATP no se hidroliza.

Bioquímica 18
 19.2.1.3 Separación de hebras y reconocimiento de origen
19.2.1.3a Proteína HU
Inicia separación de hebras.
1) Pequeña, básica y termoestable.
2) Asiste en separación de doble hélice.
3) Gasta ATP.

Bioquímica 19
 19.2.1.3b Helicasa (Proteína DNA-B)
Continua separación de hebras
1) Corre por doble hélice durante replicación.
2) Separa las hebras del ADN.
3) Gasta ATP.

19.2.1.3c Proteína ADN C

Reconocimiento de origen
1) Ayuda a helicasa a reconocer origen.

Bioquímica 20
 19.2.2 Elongación
Sistema replicativo sólo replica en dirección 5' a 3.
Complejo enzimático para la replicación (replisoma):

Subunidad b
ADN polimerasa III

Subunidad T con enlazador de subunidad b

Girasa

ADN polimerasa III

Helicasa
Ligasa

Subunidad b

ADN polimerasa I
Primasa

Bioquímica 21
 19.2.2.1 Fragmentos de Okasaki
Encontrados por Okasaki en 1968
Sugirieron que la síntesis de la nueva hebra que va de 3' a 5' es discontinua.
Pulsos de H3-timina de 2 segundos
 marca se recuperó en pequeños fragmentos de ADN (7S).
Pulsos de 2 minutos
 marca se recuperó en fragmentos grandes.
Conclusión:
 ambas hebras se sintetizan de manera discontinua.
 No era claro si
 síntesis empieza una hebra y prosigue con la otra o
 ambas hebras se replican simultáneamente.

Bioquímica 22
 19.2.2.2 Estudios de Igon y Lark (1970)
Mejoraron los hechos por Okasaki.
Pulsos cortos: se recupera marca en fragmentos 7S y 45S.
 hay síntesis continua y discontinua simultáneas.
Conclusión: Dos modos de replicación:
Hebra líder: Molde corre de 3' a 5’ Hebra rezagada: Molde corre de 5’ a 3’
Síntesis de 5' a 3’. Continua. Síntesis de 5' a 3’.
Discontinua, en fragmentos.
3’
5’ Hebra líder

Dirección del movimiento de la 3’ 5’

replicación
5’ 3’

3’
5’

3’ Hebra rezagada
5’
Bioquímica 23
 19.2.2.3 Cebador de ARN
Okasaki y Hirose (1972)

Cada fragmento de ADN tiene fragmento inicial de ARN.

 polimerasa III del ADN requiere un cebador de ARN.

ARN polimerasa no requiere cebador.

Rifampicina inhibe la síntesis de ARN

 También inhibe la replicación.

Conclusión:
Polimerasas de ADN proceden a sintetizar ADN, a partir del 3'-OH del cebador de ARN.

Bioquímica 24
 19.2.2.4 Estabilización de la hebra líder
La proteína SSB son homotetraméricas en bacterias.
 A altas concentraciones: se unen cooperativamente al ADN.
 Mantienen regiones largas del ADN como hebra simple.

Conclusión:
Función de las proteínas SSB
 mantener como hebra simple el ADN que se ha desenrollado.
Bioquímica 25
 19.2.2.5 Elongación: Síntesis del cebador
En hebra líder se sintetiza el ADN continuo
 sólo requiere un cebador inicial de ARN
En hebra retardada se sintetiza cebador para cada fragmento:
 La primasa de ARN se encarga de sintetizar el cebador.

Bioquímica 26
 19.2.2.6 Elongación: Síntesis del ADN
El cebador de ARN:
Sirve de arranque de la síntesis de ADN.
Termina como parte del fragmento de Okasaki.

Cada dNTP entrante:

se aparea a la base complementaria del molde.
sufre ataque nucleofílico del 3’-OH al fosfato a
se incorpora al ADN nuevo y
se libera el pirofosfato.

Bioquímica 27
 19.2.2.7 Elongación: Necesidad de fragmentos de Okasaki
¿Por qué debe replicarse la hebra retardada en fragmentos?
Porque esta se está replicando en contra del movimiento del complejo enzimático.

Bioquímica 28
 19.2.2.8 Elongación: Resumen
Apertura de hélice: heilicasa y proteína SSB. Vieja subunidad b se separa
Síntesis continua en hebra líder. y nueva subunidad b carga el cebador.

Síntesis de cebador por primasa que se separa. Subunidad b se carga al cebador.

Bioquímica 29
 19.2.2.9 Elongación: Eliminación del cebador
Hebra rezagada
Polimerasa I del ADN: 3’ 5’
 degrada cebador de ARN (exonucleasa 5' a 3’) 5’ 3’
 Sintetiza el ADN (polimerasa de 5’ a 3’) Sin enlazar (nick) rNMPs Polimerasa I del ADN
dNTPs

3’ 5’
5’ 3’
Ligasa de ADN une los dos fragmentos.
ATP (o NAD+)
Ligasa del ADN
AMP + PPi (o NMN)

3’ 5’
5’ 3’

Bioquímica 30
 19.2.2.10 Mecanismo de acción de la ligasa

Activación de la enzima.

Ataque del hidroxilo 3' terminal al mismo fosfato

Activación del fosfato 5’ terminal. activado liberándose el AMP inicial.

Bioquímica 31
 19.2.3 Terminación
Los dos replicones se encuentran en zonas de terminación.
• Estas zonas tienen una secuencia Ter.
• La secuencia Ter enlaza a la proteína Tus.
• El replicón puede entrar al sitio Ter-Tus pero no salir.

Al encontrarse los dos replicones se separan.

Quedan dos cromosomas entrelazados.
• Topoisomerasas rompen temporalmente ambas cadenas de un
cromosoma
• El otro pasa en el sitio de ruptura y se separan.
• Topoisomerasa vuelve a unirlos.

Bioquímica 32
 19.2.4 Polimerasas del ADN en Procariotas
Polimerasa I del ADN:
• Tiene actividad de exonucleasa en dirección tanto 5' a 3' como 3' a 5'.
• Despolimeriza el cebador de ARN.
• Rellena con ADN el espacio que ocupaba el ARN.
• Despolimeriza y repara secciones donde la luz UV ha alterado el ADN.
• Más activa in vitro pero sintetiza ADN anormal.
• Hasta 400 moléculas por célula.
Polimerasa II del ADN:
• Relacionada también con la reparación de ADN.
• Activa sobre ADN doble hélice, no sobre el simple.
• Antigénicamente diferente a la polimerasa I.
• Hasta 100 moléculas por célula.
Polimerasa III del ADN:
• Es la enzima que sintetiza nuevo ADN.
• Funciona en ADN simple si hay un cebador.
• Hasta 10 moléculas por célula.

Bioquímica 33
 19.3 Replicación en Eucariotas
Diferencias entre la replicación del ADN en procariotas y en eucariotas

Bioquímica 34
 19.3.1 Polimerasas de ADN en Eucariotas
Existen seis polimerasas del ADN principales

ADN polimerasa a  Síntesis del cebador, replicación del ADN y reparación de rupturas en ADN doble.

ADN polimerasa β  Reparación por escisión, replicación del ADN, mantenimiento y recombinación; y en
resistencia a medicamentos.

ADN polimerasa γ  Replicación del ADN mitocondrial.

ADN polimerasa δ  Alargamiento del ADN cromosómico en replicación, reparación por escisión de
nucleótidos, reparación de doble hélice por ruptura.

ADN polimerasa ε  Funciones similares a la δ.

ADN polimerasa ζ  Reparación de daños en el ADN inducidos por mutagénesis inducida y por
mutagénesis espontánea

Bioquímica 35
 Objetivos
19.01 Explicar el dogma central de la biología molecular.
19.02 Dar una descripción general del proceso de replicación.
19.03 Explicar el concepto de que la replicación en procariotas es semi-conservativa y describir
los resultados experimentales que comprobaron dicha característica.
19.04 Explicar el concepto de que la replicación en procariotas es secuencial y describir los
resultados experimentales que comprobaron dicha característica.
19.05 Explicar el concepto de que la replicación en procariotas es bidireccional y describir los
resultados experimentales que comprobaron dicha característica.
19.06 Explicar el concepto de que la replicación en procariotas presenta un solo origen y
describir los resultados experimentales que comprobaron dicha característica.
19.07 Describir que la replicación en procariotas tiene velocidad fija y que dura de 30 a 40
minutos.
19.08 Explicar cómo que ocurre la replicación completa del genoma procariótico en cultivos que
se dividen cada 10, 15 o 20 minutos.

Bioquímica 36
 Objetivos
19.09 Explicar por qué aunque los genomas en las eucariotas son de miles a cientos de miles de
veces más grandes que en las procariotas y se replican a una velocidad 10 veces menor, la
replicación de los mismos dura a los sumo 50 veces más.
19.10 Describir cómo se encontró que el genoma en replicación se encuentra asociado a la
membrana.
19.11 Describir el proceso de iniciación de la replicación en procariotas y la función de las
diferentes enzimas y componentes que participan en esta (girasa o topoisomerasa I del
ADN, proteína ADN A, proteína ADN B o helicasa, proteína ADN C y proteína HU.
19.12 Describir el proceso de elongación de la replicación en procariotas y la función de las
diferentes enzimas y componentes que participan en esta (helicasa, proteínas SSB,
primasa, complejo de la polimerasa III del ADN —con dos núcleos de polimerasa III, la
unidad T y el enlazador de la subunidad —, polimerasa I del ADN y ligasa.
19.13 Describir los experimentos que llevaron a proponer la discontinuidad de la replicación en
la hebra retrasada y la existencia de cebador con base en el descubrimiento y estudio de
los fragmentos de Okasaki.

Bioquímica 37
Objetivos
19.14 Describir el mecanismo de adición de NTPs por la polimerasa III del ADN.
19.15 Describir la razón de la existencia de los fragmentos de Okasaki.
19.16 Describir de manera resumida con palabras o dibujos el proceso de elongación.
19.17 Describir el proceso de la eliminación del cebador y su sustitución por ADN catalizado por
la polimerasa I del ADN.
19.18 Dados las fórmulas de los participantes hacer un diagrama para el mecanismo de acción
de la ligasa del ADN.
19.19 Describir el proceso de terminación de la replicación en procariotas.
19.20 Describir las características y función de las tres polimerasas de ADN (I, II y III) de las
procariotas.
19.21 Describir las diferencias de la replicación en eucariotas respecto a la de procariotas.
19.22 Describir las características y función de las tres principales polimerasas de ADN ()
de las eucariotas.

Bioquímica Unidad 19. Replicación y Reparación del ADN 38