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Marcel Gutiérrez Correa:

• Biólogo graduado en la UNALM;


• Doctor of Philosophy, Ph.D., en Agricultural Science: Biotechnology por Gifu
University;
• Profesor Principal de la UNALM desde 1975 y Director del Laboratorio de
Micología y Biotecnología de la UNALM;
• Coordinador del Programa Doctoral en Ciencias e Ingeniería Biológicas de la
UNALM
• Profesor Visitante en la Universidad Católica de Valparaíso y Colorado State
University;
• Consultor del Banco Interamericano de Desarrollo, Corporación Andina de
Fomento, INCAGRO, CONCYTEC y evaluador del Programa Europeo de Becas
Alan;
• Chair de Food Biotechnology en la International Society for Food, Agriculture and
Environment;
• Editor para América Latina del Journal of Food, Agriculture and Environment;
• Miembro de ISFAE, ASM, SfAM, EFB, FEMS, IBE, IOBB;
• Más de 55 publicaciones
Selección del organismo
(proceso biológico)

Materia prima Proceso de Salida Venta del


(fuente de C y E) (producto aislado) Producto

Control de
Proceso
DNA es el Material Genético
Por tanto debe:
(1) Replicarse fielmente.
(2) Tener la capacidad
de codificar para
generar proteínas y
otros productos para
todas las funciones
celulares.
MODELOS DE REPLICACION DEL DNA
(a) Hipótesis 1: (b) Hipótesis 2: (c) Hipótesis 3:
Replicación Semi- Replicación Conservativa Replicación Dispersiva
conservativa

Molécula Intermediaria
Meselson and Stahl
Replicación Semi-conservativa del DNA
Generacione
s
HH
0 Detección de la
replicación
0.3
semiconservativa
HH
en E. coli por
centrifugación en
gradiente de
0.7
densidad. La
HL posición de una
1.0 banda de DNA
depende de su
1.1 contenido de 14N y
15
N. Después de 1.0
HL generación, todas
1.5 las moléculas de
DNA son híbridos
LL + HL
1.9
conteniendo
cantidades iguales
de 14N y 15N
2.5

3.0

4.1

0 y 1.0
mezcladas

HL LL LL LH
0 y 4.1
Replicación del DNA

• Puesto que la replicación del DNA


is semiconservativa, entonces la
hélice debe desenrollarse.

• John Cairns (1963) demostró que


el desenrollamiento inicial está
localizado en una región del
genoma circular bacteriano,
llamada “origen” u “ori”.
La Replicación puede ser Uni- o Bidireccional

REPLICACION UNIDIRECCIONAL
Origen
REPLICACION BIDIRECCIONAL
5’ 3’ Origen
3’ 5’

5’ 3’
3’ 5’
John Cairns
cultivo
Bacteriano
*T

*T
Crecimiento por varias generaciones
*T
*T

Pequeñas cantidades de timidina-3H


en medio con bajason incorporadas en el nuevo DNA *T
*T *T

concentración de
Timidina- 3H Todo el DNA es ligeramente
marcado con radioactividad

Adicionar una alta


concentración
crecer por un
de timidina-3H
corto periodo de
*T *T *T *T*T
tiempo
*T *T *T *T *T
*T *T *T
*T *T
*T *T *T*T *T *T*T*T
*T *T *T*T

Fuerte marca en la horquilla de replicación


Donde el nuevo DNA es sintetizado

Cairns luego aisló los cromosomas mediante lisado de las células


muy suavemente y las colocó sobre una rejilla de microscopio
electrónico, la cual expuso a una película de rayos X durante dos
Puntos de evidencia de replicación bidirecciona

Marca en ambas horquillas de replicación


Características de la Replicación
del DNA
• La replicación del DNA es
semiconservativa
– Cada hebra de ambas horquillas de
replicación es copiada.

• La replicación del DNA es bidireccional


– La replicación bidireccional involucra dos
horquillas de replicación, las cuales se
mueven en direcciones opuestas.
Arthur Kornberg (1957)
Extractos de Proteína de E. coli
+
DNA Templado
Se sintetiza nuevo DNA??

- dNTPs (sustratos) los 4 a la vez


- Mg2+ (cofactor)
- ATP (fuente de energía)
- Extremo libre 3’OH (primer)
Prueba in vitro de síntesis de DNA

Usó esta prueba para purificar una enzima polimerizante de


DNA: DNA polimerasa I
Kornberg tambien usó la prueba in vitro para caracteriza
La actividad polimerizante de DNA

Los dNTPs se adicionan solamente al extremo


3’ del nuevo DNA replicado

5’ 3’Nueva hebra hija


3’ 5’Hebra parental templado

5’ 3’
3’ 5’

5’ 3’
3’ 5’

5’ 3’
3’ 5’

Por tanto, la síntesis de DNA ocurre sólo en la


dirección 5’ a 3’
Esto lleva a un problema
CONCEPTUAL
onsiderando una horquilla de replicación:

3’
5’
Primer
3’

Replicación Continua
5’
Dirección de
apertura
er
3’ 5’ Pr i m
Replicación Discontinua
3’
er
5’ Prim
3’

5’
La Evidencia para el modelo de la
Replicación Semi-Discontinua fue
proporcionada por los Okazakis (1968)
Evidencia de la Replicación Semi-Discontinua
(experimento de “pulse-chase”)

Agregar Timidina-3Cargar
H con T no-radioactivaCosechar las
Cultivo
Bacteriano bacterias
Por un CORTO Dejar que la replicación a diferentes
tiempo (segundos) continúe tiempos
después del
Bacterias cargado
replicándose

Más pequeño
Aislar su DNA
Separar las hebras Habrá Radioactividad sólo
(usando condiciones alcalinas) en el DNA que fue hecho
Correr en una gradiente de tamaño durante el pulso

Más grande
Resultados del experimento “pulse-chase”

Pulso
Carga
3’
5’
Primer
3’

*
**
pequeño

5’
Dirección de
apertura er
i m
3’ 5’ Pr
3’
mer grande
5’ P ri
3’
***
5’
La replicación del DNA es semi-
discontinua
Síntesis Continua

Síntesis Discontinua
Características de la Replicación
del DNA
• La replicación del DNA es semiconservativa
– Cada hebra de ambas horquillas de replicación es
copiada.
• La replicación del DNA es bidireccional
– La replicación bidireccional involucra dos horquillas
de replicación, las cuales se mueven en direcciones
opuestas.
• La replicación del DNA es semidiscontinua
– La hebra lider se copia continuamente
– La hebra retrasada se copia en segmentos
(fragmentos de Okazaki) los cuales son luego
unidos.
Enzimología de la Replicación del DNA
• En 1957, Arthur Kornberg demostró la
existencia de una DNA polimerasa - DNA
polimerasa I
• La DNA Polimerasa I tiene TRES diferentes
actividades enzimáticas en un solo polipéptido:
 una actividad polimerizante 5’ a 3’
 una actividad exonucleasa 3’ a 5’
 una actividad exonucleasa 5’ a 3’
La actividad polimerizante de DNA 5’ a 3’

La Subsiguiente
hidrólisis de
PPi maneja la
Reacción de avance

Los Nucleótidos se adicionan en el extremo 3' de la hebra


¿Por qué las actividades de exonucleasa?

• La actividad exonucleasa 3'-5' sirve


para la función editora (proofreading).
• Remueve las bases incorrectamente
apareadas, de tal forma que la
polimerasa puede volver a polimerizar.
Actividad correctora de la
exonucleasa 3’→5’.

La DNAPI se detiene si un ntd es


insertado erradamente – no puede
insertar el siguiente ntd en la
cadena.

La actividad correctora es lenta


comparada con la actividad
polimerizante, pero la detención de
la DNAP I después de la inserción
de una base incorrecta permite a la
actividad correctora alcanzar a la
actividad polimerizante y remover
la base incorrecta.
La Replicación del DNA es Precisa
(En E. coli: 1 error/109 -1010 dNTPs adicionados)
¿Cómo?
1) Especificidad de apareamiento en el sitio
activo
- geometría correcta en el sitio activo ocurre sólo
con bases correctamente apareadas, PERO las
bases erradas aun pueden ser insertadas a una
frecuencia de 1/ 104 -105 dNTPs adicionados.
2) La actividad correctora por la exonucleasa 3’-5’
- remueve dNTPs mal apareados desde el extremo
3’ del DNA;
- incrementa la fidelidad de la replicación 102 -103
veces.
3) Sistema de Reparación de malos
apareamientos
¿Es la DNA Polimerasa I la principal
enzima de replicación?
En 1969 John Cairns y Paula deLucia aislaron una
cepa bacteriana mutante con sólo el 1% de la
actividad de DNAP I (polA)
- El mutante era súper sensible a la radiación UV
- Por lo demás el mutante no tenía otros
inconvenientes, es decir, podía dividirse,
obviamente por tanto podía replicar su DNA
Conclusión:
• La DNAPI NO ES la principal enzima de
replicación en E. coli
Otras claves….
- La DNAPI es muy lenta (600 dNTPs
agregados/minuto – le tomaría 100 h para replicar
todo el genoma en lugar de 40 minutos)
- La DNAPI es sólo moderadamente procesiva
(la procesividad se refiere al número de dNTPs
adicionados a una cadena de DNA en crecimiento
antes de que la enzima se disocie del templado)

Conclusión:
• Deben haber DNA polimerasas adicionales.
• Estas fueron después purificadas a partir del
mutante polA.
¿Entonces, si no es la principal enzima
de replicación, qué hace la DNAP I?

- funciona en múltiples procesos que requieren sólo


trechos cortos de síntesis de DNA
- tiene un papel mayor en la reparación de DNA (el
mutante de Cairns-deLucia era UV-sensible)
- su papel en la replicación del DNA es remover los
primers y llenar la brechas formadas
- Para esto requiere de la actividad de nick-translation
(traducción de corte)
La Familia de la DNA Polimerasa
Un total de 5 diferentes DNAPs han sido
reportadas en E. coli

• DNAP I: funciona en reparación y replicación


• DNAP II: funciona en reparar DNA (probada en 1999)
• DNAP III: enzima principal replicadora de DNA
• DNAP IV: funciona en reparar DNA (descubierta en
1999)
• DNAP V: funciona en reparar DNA (descubierta en
1999)
DNA Polimerasa III
La “verdadera" polimerasa replicativa en E. coli
• Es rápida: hasta 1,000 dNTPs
agregados/seg/enzima.
• Es altamente procesiva: >500,000 dNTPs
agregados antes de disociarse.
• Es precisa: 1 error en 107 dNTPs agregados,
con proofreading, esto da una tasa final de
error de 1 en 1010 en total.
DNA – emblema del siglo 20.
1. Una estructura simple pero elegante –
una doble hélice con una columna de
azúcar fosfato unido a 4 tipos de
nucleótidos en el lado interno que se
aparean de acuerdo a reglas básicas.
Esta molécula “simple” tiene la capacidad
de especificar toda la inmensa diversidad
biológica de la Tierra.
2. La estructura de doble hebra sugiere un
modo de copiado (replicación) y las largas
cadenas de 4 bases codifican la vida.
3. El genoma humano es sólo de 3.5 mil
millones de pares de bases y más del
95% es considerado como no codificante.
as subunidades de la DNA polimerasa III de E. c
Subunidad Función

 actividad polimerizante 5’ → 3’
Núcleo de 
Dímero del
actividad exonucleasa 3’ → 5’
La Enzima  Ensamblaje  y  (scaffold)
 Ensamblaje de la holoenzima sobre
Holoenzima

 el DNA
 Grapa deslizante = factor de
 procesividad
’ complejo grapa-cargador
 complejo grapa-cargador
 complejo grapa-cargador
 -dimeriza el núcleo y lo conecta al complejo 
Primasa:
• Produce los primeros
nucleótidos (RNA
primer) sobre los
cuales la DNA
polimerasa se une
• La nueva hebra se
inicia por adición de
nucleótidos al cebo de
RNA
• El cebo de RNA es
luego reemplazado
con DNA
Proteínas Involucradas en la
Replicación del DNA en E. coli
Estrategia para identificar el Origen en E. coli
Elementos cis conservados en orígenes bacterianos

Bloques DnaA
Iniciación de la Replicación
del Cromosoma bacteriano

DnaA

DnaB
DnaC
DnaA, ensamblajes DnaB, DnaC en un Origen “abierto”

• Enrollamiento por HU
• Formación de R-loop por RNAP cerca ó en el Origen
El Primosoma tiene varias proteínas
Complejo Pre-priming:
Proteína   Gen    función
PriA    priA   helicasa, movimiento 3' a 5', reconocimiento de sitio
PriB    priB
PriC    priC
DnaT    dnaT   para adicionar el complejo DnaB­DnaC al preprimosome
DnaC    dnaC  forms complex with DnaB
DnaB    dnaB   helicasa, movimiento 5' a 3', es un hexámero
  ATPasa dependiente de DNA.
DnaG dnaG Primasa
Enzimas en la replicación del DNA

Helicasa abre la Las proteínas SSB La Primasa coloca


doble hélice parental estabilizan las un primer corto
hebras separadas a la hebra templado

La DNA polimerasa La DNA polimerasa I La Ligasa pega los


une nucleótidos para (Exonucleasa) fragmentos de Okazaki
formar hebras nuevas remueve el cebo de y sella otros nicks en
RNA e inserta las la columna azúcar-
bases correctas fosfato
Replicación
3’
3’ 5’
5’
3’

5’ 3’
5’

La Helicasa se une a secuencias de DNA


llamadas orígenes y abre las hebras de
DNA.
Las SSB evitan que las hebras simples se reapareen.
La Primasa construye un segmento corto de RNA
complementario al DNA, un cebo (primer).
Replicación
Dirección global 3’
de replicación
3’ 5’
5’

3’

5’ 3’
5’

La DNA polimerasa adiciona nucleótidos DNA


Al cebo RNA.
Replicación
Dirección global
3’
de replicación
3’ 5’

5’
3’

5’ 3’
5’

La DNA polimerasa adiciona nucleótidos DNA


al cebo RNA.
La DNA polimerasa verifica las bases agregadas y
Reemplaza los nucleótidos incorrectos.
Replicación
Dirección global
3’
de replicación
3’ 5’

5’
3’

5’ 3’
5’

La síntesis de la hebra líder continua en la


dirección 5’ a 3’.
Replicación
Dirección global
3’
de replicación
3’ 5’

5’
Frag. Okazaki
3’

5’ 3’ 5’ 3’
5’

La síntesis de la hebra líder continua en la


dirección 5’ a 3’.
La síntesis discontinua produce segmentos
de DNA 5’ a 3’ llamados fragmentos de
Okazaki.
Replicación
Dirección global
3’
de replicación
3’ 5’

5’
Frag. Okazaki
3’

5’ 3’ 5’ 3’
5’

La síntesis de la hebra líder continua en la


dirección 5’ a 3’.
La síntesis discontinua produce
segmentos de DNA 5’ a 3’ llamados
fragmentos de Okazaki.
Replicación

3’
3’ 5’

5’
3’
5’ 3’ 5’ 3’5’ 3’
5’

La síntesis de la hebra líder continua en la


dirección 5’ a 3’.
La síntesis discontinua produce
segmentos de DNA 5’ a 3’ llamados
fragmentos de Okazaki.
Replicación

3’
3’ 5’

5’
3’
5’ 3’5’ 3’5’ 3’
5’

La actividad Exonucleasa de la DNA


polimerasa I remueve los cebos de
RNA.
Replicación

3’
3’

5’
3’
5’ 3’5’ 3’
5’

La actividad polimerasa de la DNA polimerasa I


llena las brechas.
La Ligasa forma enlaces en la columna azúcar-
fosfato.
REPLICACION DEL DNA

3 Pol III sintetiza la hebra líder


2 1 Helicasa abre la hélice
La Topoisomerasa
corta el DNA para 4 Primasa sintetiza el cebo de RNA
reducir la tensión
del desenrollado Pol I separa el cebo de RNA; llena las
5
(apertura) 6 brechas
7

Pol III elonga a partir del primer; DNA ligasa une los
produce fragmentos de Okazaki fragmentos de Okazaki para
formar una hebra continua
Cargadores y grapas

PNAS October 18, 2005 vol. 102 no. 42 14939–14940


Síntesis de DNA

•Síntesis en las hebras líder y retrasada


•Proofreading y corrección de errores durante la replicación de DNA

• Replicación simultánea
ocurre vía doblado (looping) de
la hebra retrasada
Ocurre Replicación Simultánea vía
Looping de la hebra retrasada

•La Helicasa abre la hélice


•Las SSB evitan que junten las hebras
•La DNA girasa reduce la tensión
•Asociación del núcleo de la polimerasa
con el templado
•DNA síntesis
•No se muestra: pol I, ligasa
Terminación de la Replicación del
Cromosoma Bacteriano
REPLICACION BIDIRECCIONAL
Origen

5’ 3’
3’ 5’

ori

ter
Replicación del Cromosoma
Procariótico (Bacteriano)

ori

ter

Horquillas de
Replication
La Replicación Bidireccional
Produce
un Intermediario Theta
Terminación de la Replicación del
Cromosoma Bacteriano
 Terminación: reunión de dos horquillas de replicación y la
finalización de los cromosomas hijos
 Región a 180o del ori que contiene trampas para las
horquillas de replicación:

ori

Cromosoma

Sitios Ter
Terminación de la Replicación del
Cromosoma Bacteriano
 Un grupo de sitios Ter (23 bp) detienen a la horquilla DNA
avanzando en sentido horario, un segundo grupo detiene la
horquilla que va en dirección anti-horaria:

Cromosoma

 100 Kb
TerD
TerB TerC TerA
Terminación de la Replicación del
Cromosoma Bacteriano
 Los sitiosTer son zonas de ligamiento de la proteína Tus.
Tus: 35.8 kD
Se une al DNA en el sitio Ter
Monómero

Tus Horquilla detenida


DNA de una manera polar

Ter

 Tus puede inhibir el avance de la horquilla de replicación por


contacto con la DnaB helicasa, inhibiendo la apertura del DNA
Terminación

y
resolución
Estructura de Rayos-X de la proteína Tus
de E. coli en complejo con un DNA
conteniendo un Ter de15-bp.
Separación

Topo IV - topoisomerasa tipo 2 separa los dos plasmidios hijos


Cromosoma
de E. coli
4288 orf‘s
Resumen

 Proteínas de la replicación DNA:


DNA PolIII
DNA PolI
DNA Ligasa
Primasa (DnaG)
Helicasa (DnaB)
SSB

 Terminación de la replicación
Horquilla de replicación atrapada en un sitio opuesto al oriC
- SitiosTer
- ProteínaTus
Replicón = unidad que controla la replicación

duplex
DNA Replicador + Iniciador Replicador
Iniciador
E. coli oriC DnaA
Levadura ARS ORC (Complejo de Complejo del
una secuencia reconocimiento del Replicador +
de replicación origen) iniciador
autónoma + ABF1 (ARS binding permiten que la
factor 1) replicación se
inicie
Replicador: secuencia de DNA de acción cis
requerida para la iniciación; está definida
genéticamente
Origen: sitio en el cual se inicia la replicación del
DNA; definido bioquímicamente
Iniciador: proteína necesaria para la iniciación,
Control de la replicación en bacterias
• Las bacterias re-inician la replicación más frecuentemente
cuando crecen en medio rico.

– El td de un cultivo bacteriano varía entre 18 min (medio rico) a


180 min (medio pobre).
• El tiempo requerido por el ciclo de replicación es
constante.
– Periodo C
• tiempo para replicar el cromosoma; 40 min
– Periodo D
• tiempo entre la finalización de la replicación del DNA y la
división celular; 20 min
– C + D = 1 hora
Múltiples horquillas de replicación permiten
acortar el tiempo de duplicación
• El tiempo de duplicación de un cultivo puede
variar, pero el tiempo para el ciclo de replicación
es constante!
• La variación es alcanzada cambiando el número
de horquillas de replicación por célula.
• Si el tiempo de duplicación de un cultivo es < 60
min, entonces un nuevo ciclo de replicación debe
iniciarse antes que el ciclo previo se complete.
• Iniciar la replicación a la misma frecuencia cada
duplicación celular, p.ej. cada 30 min.
Múltiples
horquillas de
replicación en
células
bacterianas
de rápido
crecimiento

Ej.: cada 30 min:


Las Células se
dividen
La Replicación se
inicia
El inicio de la replicación está estrictamente regulado
Control por metilación
• Los bloques GATC son sustratos para metilación
por la metilasa-dam.
• La metilasa transfiere un grupo metilo desde la S-
adenosilmetionina al N-6 de la adenina en GATC.
• Los GATC metilados en AMBAS HEBRAS: el oriC
servirá como un origen
• Los GATC metilados en SOLO una hebra
(hemimetilados): el oriC no es activo
• La re-metilación es lenta, retrasa el uso del oriC
para empezar otra ronda de replicación.
Regulación de la replicación por
metilación
m m
GATC GATC

CTAG CTAG
m dam m
GATC
metilasa
CTAG replicar Metilar
m m
GATC GATC

CTAG CTAG
m m

Totalmente metilado Hemimetilado Totalmente metilado

Se replicará No se replicará Se replicará


Síntesis de la hebra (–) del fago X174 sobre una hebra
(+) templado para formar el DNA RF I.
Replicación de círculo giratorio (rolling circle
replication, tipo sigma) de plasmidios
frecuente en plasmidios de bacterias Gram(+).
dso (double strand
replication origin)

proteína Rep
(plasmidial)

sso (single strand


replication origin)

RNA primer
DNA pol III (primasa)

Elongación
1. DNA pol I
2. DNA pol III
Replicación sigma
(círculo giratorio)
Replicación de DNA dependiente de DNApol I
en Plasmidios
- ambas hebras se replican simultaneamente
-Ej. ColE1 (derivados pUC)
- frecuente en bacterias Gram(-).

DNA pol.III
continúa la
La RNApol construye el DNA pol. I elongación
„pre-primer“ de ~ 500 nt elonga
100 nt
Corte por la
RNaseH
Plasmidios: control de la replicación
modelo de la dilución del inhibidor
- el plasmidio produce un inhibidor:
-constitutivamente: concentración del inhibidor es proporcional al número de copias
-estallido después de la replicación: inhibe otra replicación hasta que se diluya

-Ej. ColE1: inhibidor = „RNA I“ muy estructurado y antisentido


(se une e inactiva al pre-primer)

La RNApol construye el
„pre-primer“ de ~ 500 nt RNA I

Primer paso de la replicación del ColE1


Dilema en la terminación de un cromosoma lineal
Adenovirus
Algunas bacterias tienen cromosomas lineales

circular Lineal
Multiples orígines de replicación en Eucariotas

¿Todos los orígenes se crean igual?
Telomerasa
T-loops
(Estabilizan los terminales expuestos)
Telomeros y Telomerasas
• Límite de Hayflick (50 generaciones/agotamiento del
buffer telomérico)
• La Telomerasa no es activa en células somáticas (sólo en
células embrionarias)
• Las Telomerasas se activan en las células cancerosas
• La inactivación de la telomerasa no detiene el cancer

• El envejecimiento se correlaciona con el acortamiento


telomérico
• La activación de la telomerasa en células somáticas
extiende la longevidad sin ningún obvio fenotipo
canceroso
Velocidad de síntesis de DNA y la necesidad de orígenes múltiples

Genoma Veloc. Horq. Fase S Orígenes Comentario

E. coli 4.6 Mbp 30 kb/min 40 min 1 S mayor que tiempo de dupl.

Levadura 14 Mbp 3 kb/min 20 min 330 S duraría 80hr con sólo 1 ori
(1 cm)

1 l cultivo = 4.1010 células --> 400 000 km DNA sintetizado (distancia Tierra-Luna)

Humanos 3 Gbp 3 kb/min 7h >10 000 ? S duraría 1 año con 1 ori


(2 m)

2.1013 km DNA sintetizado (2 años-luz) durante el tiempo de vida (1016 divisiones cel.
Segregación del cromosoma bacteriano

David J Sherratt, Ivy F Lau & François-Xavier Barre. Current Opinion in Microbiology 2001, 4:653–659