ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Kevin Ortega Franco, Valentina Rodriguez Torres. Ingeniería Biomédica. Facultad de

Ingeniería. Universidad Autónoma de Bucaramanga.

Resumen: En esta práctica de laboratorio se realizaron diferentes procedimientos a partir

de una enzima trabajada (GOT, GPT o Fosfatasa Alcalina) y en los cuales se tenían en
cuenta factores como la temperatura, el pH y la concentración; esto con el fin de leer la
absorbancia de las soluciones formadas.
Introducción
Las enzimas son las responsables de la
mayoría de las reacciones que se
producen en el organismo y se
encuentran en todos los tejidos, aunque
no todos tienen las mismas enzimas ni en
igual cantidad. El conocimiento de su
función, ubicación en los tejidos y en las
células nos permite utilizarlas como
verdaderos marcadores de ciertas
patologías, siendo así, la determinación
de una enzima o grupo de ellas en sangre
u otro líquido biológico proporciona
información sobre el estado del tejido o
células de las que provienen las enzimas
detectadas en el laboratorio.
Marco Teórico
Las enzimas son eficaces en muy
pequeñas cantidades, no alteran la
reacción en la que están involucradas,
solo afectan la velocidad con la que se
alcanza el equilibrio de la reacción y
poseen mayor especificidad que los
catalizadores químicos habituales.
Isoenzimas
Son formas moleculares múltiples de una
enzima. Son diferentes formas
estructurales de una enzima que
catalizan la misma reacción, pero difieren
en sus propiedades químicas, físicas,
estructurales o inmunoquímicas. Estas
diferencias se originan en su biosíntesis,
debido a modificaciones genéticas. Su
diferencia radica en la estructura
primaria de su proteína, pudiendo formar
también dímeros o tetrámeros
conformados por subunidades idénticas
o no. El estudio de isoenzimas ha llevado
a ser utilizadas como marcadores
genéticos, es el caso de la Colinesterasa
Sérica y sus variantes genéticas o
marcadores muy específicos de lesión
tisular, celular o sub-celular como por
ejemplo la Creatinquinasa y sus enzimas.
Otro de los ejemplos conocidos de
isoenzimas es el de la Deshidrogenasa
Láctica (LDH) que está presente en los
tejidos animales en 5 formas, separables
por electroforesis. Estas 5 isoenzimas
están constituidas por la combinación de
dos clases diferentes de cadenas
polipeptídicas de un peso molecular de
33500 c/u. Para poder identificar y
diferenciar isoenzimas se usan métodos
cromatográficos, electroforéticos,
inhibidores químicos o los respectivos
antisueros contra isoenzimas. Estos
últimos son anticuerpos inhibidores
obtenidos por vía inmunológica que
actúan generalmente por precipitación
en la solución reactiva, al ser insoluble el
complejo enzima antisuero.
Significado de las enzimas
En el suero de personas sanas y enfermas
se detectan actividades enzimáticas de
diferente origen:
1. Por una parte, se encuentran las
enzimas llamadas plasma
específicas, que tienen su función
específicamente en el plasma;
Estas enzimas son sintetizadas en
determinados tejidos y vertidas a
la sangre activamente, que es su
lugar de acción, donde se
encuentran su sustrato y su
coenzima, por ejemplo, las
enzimas responsables de la
coagulación que son secretadas
por el hígado (Protrombina);
lipoproteinlipasa, plasminógeno y
pseudocolinesterasa.
Este grupo de enzimas son
sintetizadas fundamentalmente
por el hepatocito y son muy
activas en el plasma, por lo tanto,
nos interesa saber sus valores
inferiores; porque una
disminución de su actividad
(normalmente alta en suero)
indica una alteración en la
síntesis, y como la mayoría son
producidas en el hígado esto nos
estaría indicando una alteración
de la funcionalidad hepática.
2. Por otra parte, se encuentran las
enzimas No plasma-específicas
que se subdividen en (Enzimas de
secreción o Enzimas del
metabolismo intermedio). Las
enzimas de secreción ejercen su
actividad fuera de las cé lulas que
las originaron, por ejemplo se
producen en glándulas exócrinas,
como páncreas (enzimas
digestivas), próstata, así como en
tejidos de mucosa gástrica y
hueso.
Las enzimas celulares del
Metabolismo Intermedio son las
que se ubican en los distintos
componentes celulares y cuya
salida se produce cuando una
causa determinada altera la
estructura de la célula. Un daño
puede conducir a un aumento en
la permeabilidad de la membrana
plasmática con su consecuente
liberación a la circulación general,
por lo tanto, la concentración de
las enzimas aumenta tanto en los
tejidos como en el plasma.
Algunas de las enzimas que
corresponden a este grupo son:
aspartato amino transferasa (AST)
o glutámico oxalacético
transaminasa (GOT), alanina
amino transferasa (ALT) o
glutámico pirúvica transaminasa
(GPT), lactato deshidrogenasa
(LDH), creatín quinasa (CK),
amilasa, γ- glutamiltranspeptidasa
(γ-GT).
Distribución de las enzimas en las
células: hay enzimas 100%
citoplasmáticas es decir que solo
se encuentran en el citosol (LDH,
GPT). Hay otras enzimas que
están en un cierto porcentaje en
un organelo y otro porcentaje en
el citoplasma: por ejemplo, la
GOT (60% en citoplasma y 40% en
mitocondria); la malato
deshidrogenasa 50% en
citoplasma y 50% en
mitocondria); otras solo
mitocondriales (glutamato
deshidrogenasa).
En la actualidad la búsqueda
permanente, en el campo de la
enzimología clínica, es la de
encontrar la mayor cantidad de
enzimas órgano-específicas, lo Unidades: La actividad enzimática
cual permitirá́ efectuar, con gran se expresa Unidades
seguridad, diagnósticos de lesión Internacionales (UI) por unidad de
por medios bioquímicos. Cuando volumen (UI/ml, UI/L...) siendo
las enzimas son ubicuas, es decir, una UI la cantidad de enzima que
tienen distintas localizaciones, transforma un micromol de
entonces el incremento de su sustrato por minuto en
actividad pone en juego todo un condiciones estándar
mecanismo deductivo para poder previamente establecidas.
apreciar cuál es el tejido que
contribuye al incremento de la Cinética Enzimática
actividad sérica (ejemplo: la Las enzimas reaccionan
deshidrogenasa láctica). ofreciendo su sitio activo al
sustrato con el cual se acoplan
Análisis de enzimas en el formando un complejo ES, donde
laboratorio actúa con gran rapidez hasta
La concentración de enzimas en obtener el P formado, sin que en
suero es muy baja, sin embargo, la reacción se altere la enzima
dada su eleva capacidad que queda libre para fijar otra
catalítica, es posible determinar molécula de sustrato. Si
su actividad y presuponer que encontramos constantes las
ésta es proporcional a su condiciones de la reacción (PH,
concentración. Por tanto, el temperatura, cofactores y
estudio de las enzimas en el concentraciones de enzima), la
laboratorio se basa en la velocidad aumenta a medida que
demostración “in vitro” de la aumentamos la concentración de
actividad catalítica. sustrato hasta que llegamos a un
punto, velocidad máxima, a partir
Se puede determinar la actividad del cual la velocidad es constante,
enzimática analizando: aunque sigua aumenta la (S).
 La aparición de algún producto.
 La desaparición del sustrato.
 La variación de un cofactor o de
algún componente de la reacción.

Es así ́ como la actividad de una

enzima se mide mediante la
determinación de la cantidad de
sustrato formado por unidad de
tiempo, en condiciones
exactamente definidas (pH,
Temperatura) y estrictamente
controladas.
Esto se explica porque al 1. Midiendo el aumento del
aumentar mucho la cantidad de producto formado durante el
sustrato, la enzima se ve tiempo de la reacción.
saturada, alcanzándola en este 2. Midiendo la disminución del
momento la mayor velocidad de S a lo largo del tiempo.
reacción posible, que depende
únicamente del tiempo que Objetivos
necesite la enzima para
transformar el sustrato. Cuando General:
se estudia una actividad Identificar los efectos que tienen
enzimática, se observa que a diferentes condiciones físicas y químicas
concentraciones bajas de sustrato sobre la actividad enzimática.
la velocidad es una función lineal Específicos:
de la cantidad de sustrato; a este
fenómeno se le llama cinética de  Observar el efecto de la
primera orden; si sigue Temperatura en la actividad
aumentando llega un momento enzimática.
que la velocidad es independiente  Observar el efecto del pH en la
de la concentración de sustrato, actividad enzimática.
se dice que es una cinética de  Observar el efecto de la
orden cero. Laboratorio de concentración en la actividad
Bioquímica Ingeniería Biomédica enzimática.
Teniendo en cuenta lo anterior,
cuando se determina una Resultados
actividad enzimática, se debe
trabajar en la parte de la curva Determinación de la actividad de GOT
que llamamos de orden cero en la y/o GPT
cual la velocidad de la reacción es
lineal con el tiempo, Normal
independiente de la Blanco Muestra
concentración de S, siendo 0,297 0,344
proporcional a la concentración
de la enzima. En la práctica, si Cambio de temperatura
mantenemos constante la Blanco Muestra
temperatura y el pH para que no 0,285 0,313
se afecte la enzima y empleamos
una concentración de S como Cambio de PH
mínimo 10 veces superior al Km,
Blanco Muestra
con objeto de trabajar en la parte
0,106 0,170
de la curva de orden cero, se
puede determinar la
Cambio de concentración
concentración de S de dos
Blanco Muestra
maneras:
0,267 0,325

Discusión de resultados
 Condiciones normales
Actividad GOT/GPT (U/L) = Absorbancia
de la muestra – Absorbancia del blanco
A= 0,344 – 0,297= 0,047
0,047∗7
=7 U / L
0,047
La actividad tiene un valor de 7 U/L
 Cambio de temperatura
Actividad GOT/GPT (U/L) = Absorbancia
de la muestra – Absorbancia del blanco
A= 0,313 – 0,285= 0,028
0,028∗5
=4,11 U / L
0,034
La actividad tiene un valor de 4,11 U/L
 Cambio de PH
Actividad GOT/GPT (U/L) = Absorbancia
de la muestra – Absorbancia del blanco
A= 0,170 – 0,106= 0,064
0,064∗10
=10,49 U / L
0,061
La actividad tiene un valor de 10,49 U/L
 Cambio de concentración
Actividad GOT/GPT (U/L) = Absorbancia
de la muestra – Absorbancia del blanco
A=0,325 – 0,267= 0,058
0,058∗7
=8,63 U / L
0,047
La actividad tiene un valor de 8,63 U/L
Análisis
Temperatura
Se puede observar que al variar la
temperatura la actividad enzimática pasa
a tener un valor por debajo de lo que
estaría en condiciones normales, el variar
la temperatura arrojara el dato más bajo
de actividad enzimática en comparación
con las otras pruebas realizadas.
PH
Se puede observar que al momento de
variar el PH la actividad enzimática
aumentara de manera dramática siendo
este el valor más alto en comparación a
las condiciones normales y a las demás
pruebas realizadas.
Concentración
Se puede observar que al variar la
concentración la actividad casi no se verá
afectada, es cierto que tendrá un
pequeño aumento pero este valor será
muy similar a cuando se está en
condiciones normales
Conclusiones
 A la hora de modificar el PH la
actividad será dramáticamente
mayor que en condiciones
normales
 Se necesita de precisión a la hora
de preparar los tubos ya que el
tiempo es un factor determinante
en el momento de la toma de
datos.
 Los dispositivos medidores de
absorbancia pueden presentar
cierto margen de error en la toma
de este dato.
 Fue necesario de llevar un conteo
riguroso del tiempo que estaban
 los tubos en los baños para que
todos los datos fueran lo más
precisos.

Bibliografía

 Guía adaptada de la Guia

“Practica: Medición de la
actividad enzimática y
aplicaciones”. Arenas, G., Zamora,
R.
 Lehninger A. L. Principles of
Biochemistry. 4 ed. Worth
Publishers. New York. 2003.