UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA)

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOQUÍMICA

Problemas de cinética enzimática

ASIGNATURA: BIOQUIMICA I
PROFESORA: GLORIA GORDILLO
1-Problemas sobre inhibición: Se realizaron estudios de inhibición para
dos enzimas diferentes presentes en el suero bovino. Se varió la
concentración de sustrato a en ausencia y en presencia de tres
concentraciones diferentes de inhibidores de cada enzima. En cada caso
encontrar: a) El tipo de inhibición. b) El valor de Km y Vmax.
c) El valor de Ki para el inhibidor.
Enzima: Fosfatasa alcalina de suero bovino, inhibidor: Oxalato de
Bromolevamisol [Bromolevam 0 8 16 40
isol] (mM)
[Sustrato]¯[F Velocida iniciales (mmol mgProt.-
P](mM) des min-1 1)
0.1 0.231 0.210 0.191 0.158
0.3 0.431 0.369 0.309 0.239
0.7 0.607 0.488 0.425 0.277
1.3 0.751 0.599 0.467 0.304
1.8 0.811 0.657 0.530 0.319
2.6 0.912 0.657 0.546 0.328
4.1 0.957 0.688 0.561 0.351
5.8 0.981 0.741 0.558 0.344
.- parte a. En este problema, podemos graficar los valores de
velocidad frente a la concentración de sustrato para las series
obtenidas sin y con las distintas concentraciones del inhibidor.
Esto se muestra en la figura. Aunque es posible estimar los
valores de Km y Vmax (en ausencia del inhibidor) y los valores
de las constantes aparentes en presencia del inhbibidor en esta
figura, el estimado será difícil de hacer, debido a que la Vmax es
una valor límite que debe extrapolarse y el valor de Km debe
estimarse una vez que se conoce la Vmax, lo que significa que
un mal estimado de Vmax dará un mal estimado de Km. Una
manera sencilla de resolver este problema es realizar la gráfica
que se presenta en el lado izquierdo de la figura, la
representación de 1/v vs. 1/s propuesta por Linewaver & Burk
permite, uniéndo los puntos con una recta, determinar los
valores de 1/Vmax a partir de la intercepción con el eje
ordenado y -1/Km a partir de la intercepción de la recta
extrapolada al eje de las abscisas.
• a) A partir de la representación mostrada en la figura,
puede también determinarse el tipo de inhibidor que
se tiene, que en este caso
es acompetitivo (tambiénllamado incompetitivo)
dado que las rectas que unen cada una de las series
de puntos son paralelas. En estos casos, una vez que
se ha decidido que los puntos realmente representan
rectas paralelas, lo mejor es tomar una regla y trazar
todas las recta paralelas buscando que el conjunto de
líneas realmente describan, tan cercanamente como
sea posible, el conjunto de puntos experimentales
• b) Aquí, el único valor de Vmax para la enzima es el determinado
en ausencia del inhibidor (O). Es decir 1/Vmax = 0.965 (mmol-1 min
mg prot) ó Vmax = 1.04 (mmol min-1 mg prot-1).
• Los valores obtenidos con las otras rectas representan tan sólo
parámetros cinéticos aparentes cuyo valor refleja las alteraciones
impuestas sobre la actividad enzimática por la presencia del
inhibidor. Km se determina por consiguiente del valor de la
intercepción con las absisas de esta misma recta i.e. -1/Km = -2.4
mM-1 ó Km = -1/-2.4 mM = 0.417 mM de p-nitrofenilfosfato. Esto
significa que cuando la concentración de p-nitrofenilfosfato en el
medio de reacción (al pH y temperatura empleados en este
experimentos) alcanzan 0.417 mM, el 50% de los sitios activos de
la enzima se encontrarán saturados y por tanto la actividad derá
igual a la mitad de la máxima que puede observarse en dichas
condiciones.
2. Se hacen cinco mezcla de reacciòn que contiene concentraciones iguales de
una enzima, a las concentraciones de S indicadas en la tabla, y se miden las V de
reacción.El experimento se repite luego con un inhibidor enzimàtico presente a
una concentraciòn de 2.2 x 10‾4M EN CADA MEZCLA DE REACCIÒN.Utilizando las
gràficas de Lieneweaver-Burk de estos datos,determine gràficamente la KM para
el S ,la Ki para el inhibidor y la Vmáx en ausencia y presencia del inhibidor. Es este
un inhibidor competitivo o no competitivo.

Inhibidor ausente Inhibidor presente

S (moles/litro) V(umoles/min) (2.2 x 10‾4M)
V(umoles/min)
1.x10‾4 28 18
1.5x10‾4 36 24
2x10‾4 43 30
5x10‾4 63 51
7.5x10‾4 74 63
• a) Sin CTP, K0,5 = 4 mM (es decir, la [S] para la cual Vo es ½ de la Vmáx)
• Con CTP, K0,5 = entre 7 y 9 mM

b) Sustituyendo en la ecuación de Michaelis-Menten, para una [S] = 3 mM:

• Vo = 5,8 x 3/ 4 + 3 . Luego Vo = 2,48 u.a. (unidades arbitrarias).
• Existe discrepancia porque a una [S] = 3 mM le corresponde, según los
datos obtenidos experimentalmente, una velocidad de 1,7 u.a. Por lo
tanto, no se ajusta a la ecuación de Michaelis-Menten (si se representa
se comprueba que es una enzima alostérica).
• c) Efecto inhibidor, ya que en presencia de CTP aumenta KM, por tanto,
disminuye la afinidad de la enzima por el sustrato.