INTRODUCCIN

La Histologa se ocupa del estudio de las clulas y tejidos normales, lo que

permite la comprensin de los procesos fisiolgicos y patolgicos que se
desarrollan en el cuerpo humano.

Tanto los conocimientos sobre las caractersticas morfofuncionales normales de

las clulas que conforman los tejidos y rganos, como de las enfermedades y su
tratamiento, se logran a partir de experimentos cientficos que han sido el
producto de muchos aos de investigacin. La evolucin del conocimiento
depende fundamentalmente del progreso tecnolgico que se ha logrado en
materia de diseo y construccin de instrumentos, equipos y tcnicas de
laboratorio. Uno de estos instrumentos es el microscopio. De igual manera, el
estado actual de conocimientos es el resultado de la interaccin de diversas
disciplinas que aunque puedan parecer dismiles, encuentran un punto de
convergencia en la microscopa.

El microscopio es el instrumento insigne en el estudio histolgico y uno de los

principales objetivos de la Histologa es permitirle al estudiante la comprensin
de la estructura microscpica de las clulas, tejidos y rganos, al mismo tiempo
que se relaciona la morfologa con la funcin (1). Los numerosos
descubrimientos han hecho posible que el ser humano logre ver ms all de sus
capacidades, observando tanto aquellos objetos que estn muy lejanos, como
tambin los que, por su reducido tamao, se escapan a la capacidad del ojo
humano para formar una imagen de los mismos.

Es deseable que el estudiante de Medicina conozca, en relacin a la

microscopa, lo ms resaltante del desarrollo de conocimientos, el diseo, los
fundamentos y principios, as como tambin los diversos tipos de microscopios
y sus variadas aplicaciones, sobretodo en el mbito de la investigacin clnica.
El estudiante debe estar al tanto de cmo funciona el microscopio, al ser ste el
instrumento bsico que utilizar en todas las prcticas de la asignatura
Histologa, para estudiar clulas y tejidos y que adems se emplear para
evaluar los conocimientos prcticos en los exmenes.

El presente trabajo consiste en una revisin bibliogrfica sobre la microscopa,

sus principios y aplicaciones.
 CAPITULO I

FUNDAMENTO DE LA MICROSCOPA

1.1. Microscopia. Se ha definido la microscopa como la tcnica que permite

observar objetos con un microscopio (simple o compuesto) y obtener una
imagen aumentada del mismo y para ello es necesario tener en cuenta
estos tres elementos:
El objeto a estudiar (preparado histolgico por ejemplo).

Una fuente de iluminacin.

Un sistema ptico.

Cuando se plantea el estudio de alguna clula, tejido u rgano, previamente se

debe definir cuales aspectos (morfolgicos, bioqumicos, fisiolgicos, genticos,
entre otros) se desean analizar, o si se desea observar clulas vivas o clulas
fijadas. En base a esto ltimo se definir y planificar la metodologa a seguir.
Se seleccionar la tcnica de visualizacin y el tipo de instrumento ptico para
obtener las imgenes. Las tcnicas de laboratorio para preparar la muestra y
obtener el preparado histolgico que ser observado, dependern en gran
medida del tipo de microscopio requerido para visualizarlo, segn los aspectos
que han sido definidos previamente.

De la misma manera que se ha razonado en relacin al preparado histolgico

(objeto), se debe analizar el papel que juega la luz o sistema de iluminacin
empleado. Se desea evidenciar y distinguir a mayor aumento los detalles del
objeto que se estudia. Generalmente se habla de la iluminacin, trmino
ampliamente utilizado, que en microscopa no siempre denota el empleo de un
rayo luminoso conformado por fotones, los cuales si pueden ser captados por la
retina del ojo.

Adems de la luz solar y la luz producida por bombillas incandescentes, tambin

se pueden emplear otros tipos de radiaciones electromagnticas, tales como la
luz ultravioleta, los rayos lser o un haz de electrones. Estos ltimos no son
captados por la retina pero si por una placa fotogrfica o una pantalla
fluorescente, siendo considerados como un tipo de iluminacin, que a pesar de
no estar constituida por fotones, tambin permite la formacin de una imagen
que muestra los detalles finos de un espcimen.

Para iluminar el objeto se pueden emplear dos mecanismos, ya sea que el rayo
de luz lo atraviese o que simplemente incida en cierto ngulo sobre el objeto. En
el primer caso se habla de trans-iluminacin y en el segundo caso de epi-
iluminacin.

1.1.1. Trans-iluminacin:
La trans-iluminacin ha sido indudablemente el primer mtodo de
iluminacin en la larga historia de la microscopa. El rayo electromagntico
(luz visible por ejemplo) debe atravesar el objeto, en ste caso un corte
histolgico (fig. 1). Como condiciones fundamentales para ser observados
al microscopio compuesto, los preparados biolgicos deben ser muy
delgados y transparentes. Deben ser rebanados con instrumentos
especializados (micrtomos) que permiten obtener cortes cuyo espesor
debe estar en el orden de las micras. Rutinariamente el espesor del corte
puede oscilar en un rango que va de 1 a 5m, pero su grosor depender
del tipo de clulas y tejidos. Para el estudio de las neuronas se realizan
cortes ms gruesos (alrededor de 30 m), mientras que para el estudio
de clulas del rin, en ciertos casos son ideales los cortes de 4 m. Para
la microscopa electrnica se emplean cortes cuyo espesor est en el
orden de los nanmetros (cortes ultra finos) debido al bajo poder de
penetracin de los electrones.

La transparencia es otra cualidad que debe tener el objeto (preparado

histolgico). Las clulas son incoloras por naturaleza, pero algunas poseen color
propio (pigmentos). Para mejorar la transparencia se emplean ciertas sustancias
qumicas (agente aclarador) como el xilol, entre otros. Ser transparente facilita
en gran medida el paso del rayo de luz. La estructura de las clulas y tejidos es
muy heterognea y crea diferentes densidades en los compartimientos intra y
extracelulares. Para mejorar la visualizacin de tales variaciones en la
concentracin de los constituyentes celulares, se pueden emplear colorantes u
otros reactivos qumicos que incrementen el contraste entre ellas y permitan su
identificacin. Esto no siempre es necesario, puesto es factible sin ningn tipo
de colorantes observar clulas con algunos microscopios especiales, cuyo
sistema de iluminacin crea contrastes muy evidentes, que de ordinario no se
observan con el microscopio compuesto clsico.

La trans-iluminacin permite obtener un campo de visin con una cantidad de luz

importante, resaltando la estructura observada sobre un fondo muy iluminado. El
microscopio compuesto clsico emplea este tipo de iluminacin y por ello
tambin se denomina de campo claro. La microscopa electrnica de transmisin
(14) y la mayora de microscopios especiales tambin se fundamentan en este
principio.

1.1.2. Epi-iluminacin:
Con esta tcnica de iluminacin el rayo de luz incide de manera oblicua
sobre la muestra (fig. 1). La iluminacin puede abarcar simultneamente
todo el campo de visin o por el contrario, focalizarse en un punto
determinado del objeto. Las muestras pueden observarse sin necesidad
de realizar cortes finos y en muchos casos tampoco se emplean
colorantes. La transparencia del objeto no es imprescindible. Como efecto
de la epi-iluminacin es posible obtener imgenes tridimensionales,
complementando de esta manera lo observado con la microscopa por
trans-iluminacin. Varios tipos de microscopios emplean este mtodo y
como ejemplo podemos citar microscopios binoculares estereoscpicos
para microdisecciones, y los microscopios de epi-fluorescencia, el
confocal y el electrnico de barrido.
Figura 1.-Comparacin de los mecanismos de iluminacin ms empleados en
microscopa. La flecha amarilla representa el haz de luz incidente sobre la
muestra, que en la transiluminacin atraviesa la misma; mientras que en la epi-
iluminacin el rayo incide de manera oblicua y en este caso son los rayos
reflejados los que se capturan para formar la imagen.

1.2. Aumento y resolucin

Los trminos aumento y resolucin deben ser bien conocidos por todo usuario
del microscopio. El mecanismo mediante el cual se produce este fenmeno ha
sido estudiado por siglos y se explica mediante leyes de la fsica. Considerar
nicamente el aumento no es suficiente para sacar el mejor partido del
microscopio, pues otro factor, la resolucin, determina lo que se ver.

1.2.1. Aumento

El poder de aumento de una lente est determinado por el grado de curvatura de

su superficie y la distancia focal. En las lentes convexas mientras mayor sea la
curvatura, menor ser la distancia focal y mayor ser el aumento. Se ha
enunciado anteriormente que el microscopio compuesto aumenta en dos etapas
y puesto que una sola lente no es suficiente se deben colocar varias lentes una
detrs de la otra, potenciando de esta manera el poder de aumento. El primer
juego de lentes, cercano al objeto en estudio, se denomina objetivo y el segundo
juego, cercano al ojo del observador se denomina ocular (11). Cada sistema de
lentes es capaz de producir una imagen aumentada cuyo valor se enuncia con
la letra x, as que 10x significa que la imagen est aumentada 10 veces.

Para conocer en el microscopio compuesto el aumento definitivo de una imagen

se aplica la siguiente frmula:

AUMENTO TOTAL: Aumento del objetivo x Aumento del ocular

Aunque esta frmula bsica permite obtener el aumento total de una imagen,
con las tcnicas de fotografa clsica o fotografa digital y el uso de software de
procesamiento de imgenes es posible lograr un aumento suplementario. Para
obtener el aumento definitivo habra que considerar los factores de ampliacin
que se realizan en la pantalla del computador (para luego imprimirla) o al copiar
la foto a papel mediante la tcnica de fotografa clsica.

El poder de aumento de un sistema ptico tiene sus lmites y el aumentar las

imgenes acarrea prdida de informacin o detalles del objeto estudiado. Esto
puede ser resuelto mediante otro principio: La resolucin.

Con el microscopio compuesto clsico es posible alcanzar un aumento mximo

de 1000x. Esta limitacin ha sido resuelta empleando un haz de electrones en
lugar de un rayo de luz visible, y se abri as una nueva era con la microscopa
electrnica aplicada al estudio morfolgico.

1.2.2. Resolucin

Es la capacidad que tiene un sistema ptico de aislar dos puntos que se

encuentran muy prximos entre s, de manera que se puedan ver
individualizados uno del otro (14). La riqueza de detalles que puede ser
observada al microscopio depende de la habilidad de este para hacer que los
puntos del objeto que estn muy cercanos aparezcan en la imagen como puntos
separados. Mientras ms corta sea la distancia entre esos puntos del objeto, ms
finos sern los detalles. La distancia entre esos dos puntos se conoce como
Lmite de Resolucin, el cual es tambin referido como el Poder de Resolucin
y puede ser utilizada como un indicador del rendimiento del microscopio. Esto se
puede comparar vagamente con algunos aspectos de la informtica, el tamao
del pixel por ejemplo; mientras ms pequeo sea el tamao, mayor ser la
cantidad de detalles de la imagen digital.

Lmites de Resolucin aproximados de algunos sistemas pticos:

Ojo humano: 0,2 mm.

Microscopio Fotnico: 0,2 m.

Microscopio electrnico: 0,2 nm.

1.3. Factores que determinan el poder de resolucin

Al observar pequeos objetos al microscopio, la luz incidente proveniente de

ellos es desviada de su trayectoria inicial y mientras ms pequeos sean, mayor
ser la desviacin. Las lentes del objetivo deben recolectar como sea posible la
mayor cantidad de rayos desviados para formar una imagen ntida; a ms rayos
capturados, mayor resolucin (fig. 2).

Figura 2. Esquema que muestra un objeto (1) que es atravesado por un haz de
rayos luminosos (2) los cuales son captados por el objetivo (3). Al formarse el
cono de luz proveniente del objeto se determina un ngulo, tambin llamado de
apertura, donde a representa la mitad del mismo.

A partir de las observaciones precedentes, nace la definicin de apertura

numrica (AN), cifra a considerar para determinar el rendimiento de una lente
objetivo (13):

AN = n x sen a

Donde a = la mitad del ngulo de apertura del objetivo.

n = el ndice de refraccin del medio que se encuentra entre el objeto y el
objetivo.
(Para el aire n = 1 y para el vidrio o aceite n = 1.51)
Otra manera de incrementar la resolucin es creando, del lado de la fuente
luminosa, un cono amplio con un ngulo mayor. Para ello se emplea otro juego
de lentes denominado condensador el cual posee la misma apertura numrica
que el objetivo (fig. 3).

Figura 3. El objeto (1) es iluminado con un rayo de luz (2) que formar un cono
luminoso frente al objetivo. Se coloc otra lente (4) que recoge y condensa la luz
antes que ilumine al objeto.

Para aumentar an ms la resolucin, adems de agregar un condensador, otra

posibilidad es colocar algn lquido entre la lmina cubreobjeto y el objetivo. Se
ha obtenido buenos resultados con ciertos aceites (aceite de cedro) cuyo ndice
de refraccin es igual al del vidrio cubreobjeto, eliminando toda reflexin de los
rayos luminosos (fig. 4).
 .

Figura 4. A la izquierda el espacio entre el cubreobjeto (5) y el objetivo (3) es

ocupado por el aire; a la derecha el espacio es ocupado por un lquido de
inmersin (6). Aprciese que el cono de luz y el ngulo a son mayores con
inmersin.

El poder de resolucin de un microscopio compuesto de campo claro puede ser

calculado de manera razonable mediante la frmula (13):

Donde delta= resolucin expresada en micrmetros.

lambda = longitud de onda de la luz empleada.
Como la ANobj y la ANcond son iguales, se resume 2AN.

De los anteriores planteamientos se deduce que el poder de resolucin de un

sistema ptico, en trminos generales depende principalmente de:

Apertura numrica del objetivo y condensador: La relacin apertura/resolucin

es directamente proporcional; a mayor apertura, mayor resolucin.
 Longitud de onda de la radiacin electromagntica utilizada: La relacin
longitud de onda/resolucin es inversamente proporcional; a menor longitud de
onda, mayor resolucin.

1.5. Factores que limitan la resolucin en un sistema de formacin de

imgenes

Los sistemas pticos y habitualmente los microscopios pueden presentar errores

que producen distorsin de las imgenes. Son producidos mediante varios
mecanismos, ya sea por el comportamiento de la luz al incidir sobre el objeto en
estudio o ya sea por defectos propios de las lentes. Estos defectos son
comunmente conocidos como aberraciones. Algunos resultan de la esfericidad
de la superficie de la lente y son derivados de la interaccin de la luz con dicha
superficie (15). Estos defectos producen alteraciones de los detalles de las
imgenes y se pueden presentar combinados. En la actualidad, con el uso de
tcnicas de manufactura moderna que han permitido la elaboracin de lentes
ms efectivas, se ha logrado corregirlos en gran medida.

1.5.1. Difraccin

El trmino difraccin viene del latn diffractus que significa quebrado. La

difraccin es el fenmeno que se observa cuando la luz, al pasar por el extremo
de una superficie se "dobla" desviandose del trayecto y no sigue su propagacin
en lnea recta (58) (fig. 5).
Figura 5.-Cuando al luz pasa por una rendija, no sigue su trayecto en lnea recta,
se dobla, en otras palabras, se difracta. Tomado de Braun, E. Arquitectura de
slidos y lquidos (58).

En la trans-iluminacin del objeto, las ondas luminosas encuentran obstculos

en su trayecto, lo que produce una expansin de la luz por la difraccin y se
obtiene una imagen borrosa que limita la capacidad de aumento til de un
microscopio. Por ejemplo, los detalles menores de media milsima de milmetro
(0,5 m) no pueden verse en la mayora de los microscopios pticos.

Al ser observado un objeto transparente al microscopio, cada detalle iluminado

del mismo crea un patrn de difraccin denominado disco de Airy. Este patrn
esta formado por un punto central brillante y varios anillos brillantes separados
por anillos oscuros. Cuando dos detalles estan muy prximos entre s se puede
verlos separados slo si los puntos centrales no estn muy prximos o
superpuestos. Mientras ms pequeos sean los discos de Airy, mayor ser la
resolucin en una imagen (fig. 6). Los objetivos con mayor apertura numrica
producen discos de Airy ms pequeos (12).
Figura 6. Discos de Airy y resolucin. (a,b,c) tamao de los discos y su perfil de
intensidad, que decrece de (a) hasta (c) relacionados con la apertura numrica
a medida que aumenta. (d) dos discos de Airy superpuestos y (e) discos de Airy
en el lmite de resolucin. Tomado de Davison M, Abramowitz M. Optical
Microscopy (15).

1.5.2. Aberraciones

Hay varios tipos de aberraciones:

De esfericidad, relacionadas con la forma esfrica de la lente: Se producen por

falta de convergencia de las ondas luminosas que pasan por la periferia de la
lente cuando no son enfocadas en el mismo punto que aquellas ondas que pasan
por el centro, las cuales son refractadas ligeramente; mientras que las que
inciden en la periferia son refractadas en mayor grado y convergen en diferentes
puntos focales. Este es uno de los artificios ms molestos y la imagen del objeto
aparece dispersa y borrosa, en lugar de enfocada y ntida (fig. 7). Adems de la
lente, la lmina cubreobjeto empleada en la preparacin histolgica puede
producir este tipo de aberracin. Una lmina de calidad debe tener 0,17 mm de
espesor para poder ser utilizada con las lentes objetivo de la mayora de
microscopios, de lo contrario produce una marcada aberracin de esfericidad
(13, 57).

Figura 7. Aberracin de esfericidad. Los rayos que inciden paralelamente al eje

principal no convergen todos en un mismo punto. Los rayos de la periferia
convergen ms cerca de la lente. Modificado de Dini, A. Apuntes de Fsica (59).

Cromticas, relacionadas con las variaciones en los ndices de refraccin de

las diversas frecuencias (colores) que conforman la luz blanca visible: Cuando la
luz blanca atravieza una lente, las diferentes frecuencias son refractadas de
acuerdo a su frecuencia. Cada color tiene un camino y un foco diferente; la luz
violeta es la ms refractada y le siguen la azul, la verde y la roja, fenmeno
tambien conocido como dispersin (fig. 8). La incapacidad de la lente de reunir
nuevamente los rayos refractados en un punto focal comn resulta en una
discreta diferencia en el tamao del objeto y en franjas de colores rodeando la
imagen (43). Los sistemas pticos que dan corregida esta aberracin se
denominan acromticos.
Figura 8. Aberracin cromtica. La luz blanca se descompone al atravezar la
lente y las diversas longitudes de onda convergen en varios puntos focales
diferentes. Modificado de Dini, A. Apuntes de Fsica (59).

Otras aberraciones geomtricas: Incluyen una variedad de efectos, tales

como: Astigmatismo: No se puede enfocar simultneamente lneas verticales y
horizontales.
Coma: Se produce una degradacin de la imagen de un punto, se ve similar a
un cometa.

Distorsin: Se manifiesta en la forma del objeto, afectando particularmente a los

bordes. El objeto se ve en forma de barril o de corset.
Curvatura del campo: El campo se ve con bordes curvos, deformando la imagen.

1.5.3. Correccin de las aberraciones de los objetivos

La ptica geomtrica da las bases para aplicar mtodos que permiten la

correccin o compensacin de las aberraciones. Uno de ellos es la reduccin de
la apertura de ngulo del haz de luz, de manera que se evitan los rayos
incidentes en la periferia de las lentes.

Un procedimiento ms complejo es la combinacin de varias lentes que corrijan

la aberracin. Esto se aplica para la aberracin cromtica y fue propuesto por
Chester More Hall en 1735 y aplicado algo ms tarde en microscopios. La
correccin de la aberracin esfrica fue resuelta por Joseph Jackson Lister en
1830.

Para corregir las aberraciones geomtricas se fabrican objetivos planos o

aplanticos, detalle sealado con la etiqueta PLAN. Para la correccin de las
aberraciones cromticas se elaboran objetivos denominan acromticos, los
cuales corrigen el rojo y el azul. Los objetivos semiapocromticos son
acromticos que tienen una mayor apertura numrica. Los objetivos
apocromticos corrigen los colores rojo, azul y adems el verde. Estos ltimos
son los objetivos de mayor calidad (47).

En el ojo humano aparecen todo tipo de aberraciones, notablemente desenfoque

(miopa e hipermetropa), astigmatismo, coma y curvatura de campo entre otras,
debido a que en generalmente este sistema ptico trabaja con una apertura
pupilar grande. Algunas se compensan de forma natural pero las ms graves
tales como el desenfoque y el astigmatismo se corrigen mediante lentes o
ciruga.
 CAPITULO II

EL MICROSCOPIO COMPUESTO.

2.1.-Breve resea histrica

Los orgenes del microscopio son inciertos; probablemente en Holanda, en la

ciudad de Middelburg entre 1590 y 1610, algunas personas relacionadas con el
mundo del espectculo inventaron tanto el microscopio compuesto como el
telescopio. Hans Janssen y su hijo Zacharias, fabricantes de anteojos, se
mencionan como posibles inventores. Sin embargo, algunos atribuyen a Galileo
Galilei su invencin en la primera mitad del siglo XVII, gracias a que l difundi
el microscopio y su uso. El microscopio compuesto original consista en dos o
ms lentes colocadas en un tubo rgido (17).

Los primeros usuarios bien conocidos fueron M. Malpighi, de Italia, A. van

Leeuwenhoek, de Holanda; Hooke y N. Grew, de Inglaterra. Leeuwenhoek
fabric un microscopio simple (17) (fig. 2-1) y Hooke utiliz un microscopio
compuesto. Los instrumentos empleados por Leeuwenhoek eran superiores a
aquellos utilizados por Hooke, en parte debido a que se desconoca el efecto de
las aberraciones de las lentes y como corregirlas. El microscopio compuesto de
Hooke sumaba los defectos de los dos juegos de lentes (objetivo y ocular),
dificultando la observacin, de manera que en la historia de la microscopa fue
Leeuwenhoek quien realiz la mayor cantidad de descubrimientos con su
microscopio simple.

Sin embargo, el microscopio compuesto sera el instrumento con ms futuro. El

instrumento de Hooke del ao 1665 tena las partes bsicas, dos lentes (una que
aumentaba la imagen de la otra), una estructura mecnica, mecanismos de
enfoque y un frasco esfrico para concentrar la luz (fig. 2-2). Mejoras
considerables se han realizado desde entonces.

Aunque algunos fabricantes como Culpeper y Cuff crearon microscopios

apropiados y mejorados por modelos con bases en trpode y la conocida base
en herradura; no obstante, el verdadero microscopio til apareci con la
invencin de las lentes acromticas, desarrolladas en Inglaterra por Chester
Moore Hall en 1729. El desarrollo de los instrumentos de ptica es inseparable
del de la industria del vidrio y la fabricacin de las lentes (61). Sin embargo, an
era difcil fabricar lentes acromticas poderosas y a finales del siglo XVIII Jan y
Harmanus van Deyl lo lograron e iniciaron la comercializacin de objetivos
acromticos. Las lentes con mayores aperturas numricas fueron realizadas
alrededor de 1890. Un fabricante famoso de microscopios de calidad superior
era la firma de Powell y de Lealand, quienes elaboraron objetivos de alto poder,
apocromticos y de inmersin con una apertura numrica de 1,50.

Otros creadores fueron Ross y Smith. Karl Zeiss Jena realiz objetivos de
inmersin diseados por Ernst Abbe quien fue el fundador de la teora ptica de
las lentes del microscopio y desarroll el diseo de las mismas basado en un
procedimiento matemtico riguroso (62). A finales del siglo XIX los microscopios
de campo claro fueron modificados para obtener campo oscuro y polarizacin,
detalles que permitieron incrementar el contraste.

A principios del siglo XX la fabricacin de microscopios se concentr en Alemania

y en los aos sucesivos se desarroll la fluorescencia, contraste de fase,
interferencia, holografa, luz ultravioleta, rayos X, mtodos con electrones y
protones, microscopios computarizados para la observacin, cuantificacin y
anlisis tridimensional. Estos instrumentos abrieron muchas posibilidades en el
campo de la microscopa.

Los fabricantes (Leitz, Zeiss, Olympus, y otros) respondieron a muchas

necesidades, haciendo microscopios ms efectivos, de uso universal, capaces
de utilizar el tipo de radiacin (luz visible o no) que revele de la mejor manera
posible la naturaleza del espcimen y convierta detalles invisibles de la imagen
en un patrn visible que pueda ser analizado.
Figura 2-1.-Microscopio de Leeuwenhoek. La lente est instalada entre dos
placas de bronce. Lo que se quiere observar se coloca en la punta de un tornillo,
de manera que se puede regular en forma precisa la distancia entre el objeto y
la lente; el observador tiene que acercar el ojo al instrumento y mirar a travs de
la lente. Modificado de imgenes. Ministerio de Educacin y Ciencia. Espaa
(60).
Figura 2-2.-Microscopio utilizado por Hooke. Tomado de Lanfranconi, M. Historia
de la Microscopa. (18).

2.2.-Partes del microscopio compuesto moderno

El microscopio compuesto de uso comn tambin se conoce con el nombre

microscopio ptico en base a que sus propiedades derivan del empleo de lentes
pticas. Est constituido por cuatro grupos de dispositivos o sistemas articulados
de tal manera que garantizan un funcionamiento ptimo y ergonmico (19) (ver
fig. 2-3):

Sistema mecnico: Conjunto de piezas que sirven de soporte a las lentes y

dems elementos (pie o base, columna, mecanismo de enfoque, platina,
revolver, tubo).

Sistema ptico: Conjunto de lentes responsables del poder de aumento y

resolucin (objetivos y ocular)

Sistema de Iluminacin: Elementos que producen las radiaciones (luz visible o

no) y transmiten, reflejan y regulan tanto la intensidad como la cantidad de rayos
que van a incidir sobre el espcimen (lmpara o fuente de iluminacin, espejo,
condensador y diafragma).

Accesorios: Son aditivos que permiten extender las capacidades del

instrumento (cmaras fotogrficas, de video, computadoras, accesorios para
dibujar, entre otros).
Figura 2-3.-Microscopio compuesto moderno con sus partes. Modificado de
District School Board of Niagara (63)

2.3.-Sistema mecnico del microscopio

La parte mecnica del microscopio tambin se denomina montura y es de forma

y dimensiones muy variables, dependiendo del fabricante y el precio del
instrumento.

De manera general se describen modelos grandes, medianos y pequeos o

porttiles. Los modelos grandes poseen todos los aditamentos que garantizan
un trabajo profesional y permiten el intercambio de piezas y accesorios para
realizar los trabajos ms variados y su costo es el ms elevado. Los modelos
medianos no convienen a todo tipo de investigacin pero son ms prcticos
puesto que su precio es menor gracias a su construccin ms simple. Los
microscopios porttiles responden a necesidades ms restringidas y producen
aumentos menores, conviniendo para observaciones someras.

Toda montura, por complicada que sea posee los siguientes elementos: pie o
base, mecanismo de enfoque, la platina, el revlver y el tubo del ocular.

2.3.1- Pie o base

Generalmente en herradura o en Y, aunque tambin puede ser rectangular, con

un peso considerable que garantiza la estabilidad del instrumento. La base aloja
la fuente de iluminacin y puede contener un mecanismo para regular la
intensidad luminosa.

Sirve de soporte a una columna o brazo sobre el cual reposa el resto del aparato.
La columna puede ser inclinada; en su parte ms inferior se dispone el
condensador y la parte superior posee una cremallera que permite desplazar en
sentido vertical el condensador, la platina o el revlver y el tubo. Las ventajas
que procura el microscopio inclinado son mltiples y la posicin es ms
confortable para el observador (actividad que es muy incmoda cuando el tubo
del microscopio es vertical).

2.3.2.-Mecanismo de enfoque

Se logra desplazando en sentido vertical ya sea la platina donde se coloca el

espcimen o ya sea el revlver donde estn colocados los objetivos, de modo
que se pueda centrar el punto focal del objetivo que se est utilizando es ese
momento. Se logra mediante dos mecanismos, primero uno rpido del tornillo
macromtrico y segundo, otro lento del tornillo micromtrico.

La cremallera que permite el movimiento rpido del tornillo macromtrico posee

dientes que se engranan y producen un movimiento tosco para lograr un enfoque
aproximado. Se utiliza para enfocar con los objetivos de poco aumento y para
subirlos rpidamente con la finalidad de colocar o retirar de la platina el
preparado histolgico.

El tornillo micromtrico por el contrario posee una graduacin tal que cada
divisin de la rosca permite un movimiento vertical imperceptible en el orden de
0,001 mm. Esta disposicin permite evaluar de manera aproximada el espesor
de los objetos, considerando el nmero de vueltas que realiza el tornillo al
enfocar su parte ms superficial y luego la ms profunda.

El movimiento del tornillo micromtrico tiene una extensin de 5mm

aproximadamente y est limitado. Permite un enfoque fino y se utiliza con los
objetivos de mayor aumento (11).

2.3.3.-La platina

Es el soporte horizontal donde se colocan las preparaciones histolgicas.

Presenta en el centro un orificio circular por donde pasa el rayo de luz producido
por la fuente luminosa y proveniente del condensador. Generalmente es de
forma cuadrada y posee un sistema de fijacin e inmovilizacin de la lmina
porta-objeto compuesto por pinzas o una pieza articulada que esta fija a otro
dispositivo, el carro.

Este dispositivo permite el examen metdico y completo de la preparacin al

proporcionar un desplazamiento hacia adelante o hacia atrs y de derecha a
izquierda y viceversa.

Otra pieza, el vernier (denominado as gracias al nombre de su inventor en 1631),

tambin llamado nonius, consiste en dos pequeas reglas graduadas en
milmetros cuya finalidad es la de obtener coordenadas aproximadas que sirven
de referencia para localizar una estructura determinada en la preparacin. En la
prctica, el uso del vernier no es frecuente, se hace un poco complicado anotar
las cifras y ms difcil an colocarlas en las reglas y localizar la estructura en
cuestin. Adems, estas cifras solo son vlidas para el microscopio en el cual se
obtuvieron. Hay otros procedimientos ms simples para tal fin (11, 64).

2.3.4.-El revlver

Considerado como un accesorio del tubo. Es un implemento muy importante que

permite el intercambio rpido de objetivos mediante un movimiento de rotacin.
El revlver est constituido por una semi-esfera que posee una serie de anillos
en los cuales van atornillados los objetivos. Esta pieza gira alrededor de un eje
que est colocado en la parte inferior del tubo. Puede ser de diversas formas y
de igual manera, alojar un nmero variable de objetivos (dos, tres, cuatro o ms).
2.3.5.-El tubo

Soporta la porcin ptica del microscopio. Es un cilindro hueco de longitud

variable, cuyo interior est pintado de negro mate y posee un diafragma para
impedir la formacin de reflejos y facilitar la observacin. El tubo puede ser doble
y alojar dos lentes oculares (microscopio binocular). En los modelos de
microscopios grandes destinados a la microfotografa, hay un tercer tubo
accesorio, generalmente ms largo y vertical que sirve para conectar una cmara
fotogrfica sin necesidad de lente ocular.

2.4.-Sistema ptico del microscopio

Los microscopios modernos estn diseados para proporcionar imgenes

aumentadas y ntidas de los especmenes que se observan. Los componentes
pticos estn colocados en una base estable que permite un intercambio rpido
y un alineamiento preciso. El sistema ptico est constituido por dos juegos de
lentes: El objetivo y el ocular.

2.4.1.-Los objetivos

Representan el componente ptico ms importante del microscopio. Su principal

funcin consiste en colectar la luz proveniente del espcimen y proyectar una
imagen ntida, real, invertida y aumentada hacia el cuerpo del microscopio.

Constituyen un sistema ptico formado por una o varias lentes, las cuales deben
estar centradas y los ejes pticos de cada una deben coincidir exactamente para
formar el eje ptico del sistema. Sus lentes estn hechas a partir de cristales
(espatos, fluorita, entre otros) con un alto grado de calidad y funcionamiento; su
precio depende del poder de aumento, resolucin y de la correccin de las
aberraciones. Muchos fabricantes elaboran objetivos que pueden ser
intercambiados y empleados en microscopios de otras marcas comerciales.

Clasificacin:
Tomando en cuenta el grado de correccin de las aberraciones hay dos
categoras de objetivos para el microscopio, los objetivos acromticos y los
objetivos apocromticos. En cada categora se distinguen an dos grupos, los
objetivos secos y los objetivos de inmersin (64, 65, 66):
 Objetivos acromticos: Presentan correccin cromtica para la luz azul y roja.
Correccin de esfericidad para el verde. Dan mejores resultados con filtro de luz
de color verde y son ideales para microfotografa blanco y negro. Se asume que
un objetivo es acromtico cuando no posee ninguna denominacin.

Objetivos semi-apocromticos: Elaborados a partir de cristales de fluorita.

Corrigen para el azul, el rojo y en cierto grado para el verde. La correccin de
esfericidad es para dos colores, el verde y el azul. Dan buenos resultados con
luz blanca y estn mejor diseados para la microfotografa en colores.

Objetivos apocromticos: Poseen el ms alto nivel de correccin de

aberraciones y por ello, son ms costosos. Presentan correccin cromtica para
cuatro colores (azul oscuro, azul, rojo y verde); correccin de esfericidad para
dos o tres colores. Son los mejores objetivos para microfotografa y video a color.
Debido a su alto grado de correccin, estos objetivos poseen mayores aperturas
numricas que los acromticos y las fluoritas. Esto puede ser un inconveniente
puesto que el campo de observacin se presenta un poco curvo.

Los tres tipos de objetivos proyectan imgenes con cierta distorsin que se
manifiesta como curvaturas y al ser corregidos para este defecto se denominan
plan-acromticos, plan-fluoritas o plan-apocromticos.

Objetivos secos y objetivos de inmersin:

Estos objetivos difieren entre s por la naturaleza del medio interpuesto entre el
cubre-objeto de la lmina histolgica y la lente frontal del objetivo. En los
objetivos secos el medio interpuesto es el aire cuyo ndice de refraccin (n=1) es
muy diferente del ndice del vidrio porta y cubre-objeto (n=1,5). Por el contrario,
en los objetivos denominados de inmersin el medio que separa al cubre-objeto
de la lente frontal del objetivo es un lquido cuyo ndice de refraccin es lo ms
prximo al del vidrio. Este lquido puede ser agua destilada (n=1,33) o mejor an
aceite de cedro, que posee un ndice de refraccin (n=1,515) casi idntico al del
vidrio.

La ventaja de los objetivos de inmersin consiste en la disminucin o eliminacin

de la refraccin de los rayos luminosos entre el aire y el objetivo, en
consecuencia la luminosidad de la imagen est aumentada, mientras que en los
objetivos secos, est disminuida. El empleo de la inmersin aumenta el ngulo
de apertura del objetivo y permite mayor resolucin gracias a la captura de una
mayor cantidad de rayos luminosos refractados (11, 64) y solo puede utilizarse
con objetivos de mayor aumento.

ptica finita y ptica infinita:

La microscopia de luz o fotnica ha experimentado cambios radicales en sus

sistemas pticos en los ltimos aos. El tubo que soporta tanto el revlver por
un extremo, como el ocular por el otro, se confeccionaba con una determinada
longitud y los fabricantes elaboraban objetivos que funcionaban para esa
longitud (longitud finita) que fue estandarizada a 160mm y en algunos casos
(Leitz) a 170mm. En muchos modelos de microscopios modernos el tubo no es
rectilneo y los rayos de luz transmitidos desde el objetivo hacia el ocular son
desviados por prismas, especialmente en los microscopios trinoculares para
fotografa. Emplear objetivos diseados para una determinada longitud de tubo
en otro microscopio que no corresponda produce incremento en las aberraciones
de esfericidad, ocasionado por una longitud de tubo diferente.

Los microscopios modernos poseen un ensamble complejo de lentes, espejos y

prismas que transmiten la luz desde el objetivo al ocular y actualmente casi todos
los fabricantes estn elaborando microscopios que puedan aceptar objetivos
diseados para realizar una correccin infinita. Tales objetivos proyectan una
imagen al infinito la cual es captada por otra lente que se introduce en el tubo y
que a su vez la proyecta al punto focal del ocular. Los objetivos con esta
correccin poseen el smbolo infinito grabado en la parte externa. Los sistemas
corregidos al infinito son significativos porque corrigen la aparicin de imgenes
fantasma que con frecuencia se observa en microscopios anteriores, no obstante
estos nuevos modelos son de mayor tamao (66) (fig. 2-4).
Figura 2-4.-Esquema que muestra el principio de los objetivos con correccin al
infinito. Modificado de Microscope objetives. Olympus Microscopy Resource
Center (66).

Estructura de los objetivos:

Generalmente es un tubo cilndrico que contiene en su interior un revestimiento

anti-reflejos y las diversas lentes colocadas en serie y alineadas (fig. 2-5). En la
parte externa posee grabadas las especificaciones y caractersticas.
Figura 2-5.-Tipos de objetivos. (a) Objetivo acromtico que contiene una lente
frontal y dos pares internos, (b) objetivo semi-apocromtico o fluorita, con cuatro
pares de lentes y (c) objetivo apocromtico que contiene un triplete, dos pares,
un menisco y una lente esfrica frontal. Modificado de Davison M, Abramowitz
M. Optical Microscopy (15).

Nomenclatura de los objetivos:

La identificacin de las propiedades individuales de los objetivos es posible

gracias a la nomenclatura grabada en la parte exterior y contiene todas las
especificaciones necesarias para su uso apropiado (11, 15). La minuciosa
informacin, generalmente en el idioma ingls, puede contener :

Nombre del fabricante: Casa comercial

Aumento linear: Con un rango que puede ir desde 0,5x hasta 200x

Correcciones pticas: Achro, Achromat (acromticos); Fluar, Neofluar (semi-

apocromticos); Apo (apocromticos); Plan, Plano (corrige curvatura de campo);
ICS (infinity corrected system), UIS (universal infinity system); N, NPL (normal
field o view plan); CF, CFI (chrome-free, chrome free infinity) y muchas otras
especificaciones cuya nomenclatura depende del fabricante.

Apertura numrica: Es un valor que indica el ngulo de apertura del cono

luminoso.
 Longitud del tubo: Longitud que separa al objetivo del ocular, usualmente en
milmetros (160, 170, 220) o con el smbolo (8) para objetivos con correccin
infinita.

Espesor del cubre-objeto a emplear: Ha sido estandarizada a 0,17mm pero hay

diversos espesores lo cual produce aberraciones. Algunos objetivos poseen un
collar de correccin en las lentes internas para realizar la correccin y se
denominan CR, Corr, w/corr, o pueden tener una escala graduada mvil para el
ajuste.

Distancia focal: Distancia entre el punto focal y la lente frontal del objetivo,
expresada en milmetros.

Propiedades pticas especiales: En caso de objetivos que en ciertas

condiciones tienen resultados ptimos (para luz polarizada, contraste de fase,
entre otros).

Rosca del objetivo: La mayora de objetivos estn estandarizados de acuerdo

a la Royal Microscopy Society para garantizar una compatibilidad universal y se
designan con las siglas RMS, sin embargo, algunos fabricantes tiene sus propias
dimensiones. El dimetro general es de 20mm, pero los objetivos Leica y Nikon
son de rosca ms amplia y slo funcionan en sus microscopios. M25 y M32
designan roscas de 25 y 32 mm respectivamente.

Medio de inmersin: Algunos objetivos ameritan el uso de medios de inmersin

y para ello se emplea un cdigo de colores o las abreviaciones Oil, Oel (aceite);
HI (homogeneous immersion); W, Water, Wasser (agua) y Gly (glicerol).

Cdigo de colores: Algunos fabricantes marcan sus objetivos con anillos de

colores para facilitar la identificacin del aumento (ver tabla 4-1).
Figura 2-6.-Nomenclatura del objetivo. Las propiedades pticas especiales en
este objetivo denotan que puede emplearse en Interferencia de contraste
diferencial (DIC differential interference contrast) y la H significa que puede
emplearse en microscopios con platina caliente (heating stage). Modificado de
Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. (15).

Cdigo de color
Medio de inmersin
de inmersin

Negro Aceite

Naranja Glicerol

Blanco Agua

Rojo Especial o multiuso

Cdigo de color
Aumento
de aumento
 Negro 1x, 2.5x

Marrn 2x, 2.5x

Rojo 4x, 5x

Amarillo 10x

Verde 16x, 20x

Azul turquesa 25x, 32x

Azul celeste 40x, 50x

Azul cobalto 60x, 63x

Blanco, crema 100x, 250x, 200x

Tabla 2-1.-Cdigos de color en los objetivos microscpicos. Modificado de

Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. (15).

2.4.2.-El ocular

El ocular (del latn oculus = el ojo) est formado por lentes que generalmente son
separadas por un diafragma, montadas en las extremidades de un cilindro que
va introducido en la parte superior del tubo. El ocular sirve para observar la
imagen real e invertida que produce el objetivo, ejerciendo dos funciones:

Aumenta la imagen y la transforma en una imagen virtual, derecha con respecto

a la imagen del objetivo, pero aun invertida, con respecto al objeto.
Posteriormente el ojo endereza la imagen.

Aplana y aclara el campo ptico o plano circular en el que aparece el objeto.

La lente superior se denomina lente ocular y es la que produce el aumento de la

imagen real del objetivo; la lente inferior tambin se denomina colectora y es la
que aplana y aclara el campo (fig. 2-7).

Clasificacin:
 Oculares de Huygens: Empleados con los objetivos acromticos y formados
por dos lentes plano-convexas cuya convexidad est dirigida hacia el objetivo y
el diafragma se ubica entre ambas. Tambin denominado ocular negativo porque
la imagen se forma entre las dos lentes. Muy comn en modelos de microscopios
antiguos (11).

Oculares de Ramsden: Conocido como ocular positivo, formado por varias

lentes unidas entre s y colocadas por encima del diafragma. Generalmente
corrigen aberraciones y funcionan de manera ptima con los objetivos corregidos
al infinito (15).

Oculares compensadores: Son oculares que corrigen la diferencia de aumento

para los diversos colores (diferencia cromtica de aumento) que se aprecia en
los objetivos apocromticos. No tiene buen rendimiento con objetivos
acromticos secos.

Oculares de proyeccin: Posee una lente que permite la proyeccin de la

imagen en una pantalla colocada a cierta distancia del ocular, ideal para dibujar
o para exhibicin (11).

Oculares aplanticos: Tienen la propiedad de formar un campo perfectamente

plano y el poder de resolucin es igual tanto en el centro como en la periferia del
campo ptico (11).

Oculares peri-planticos: Aplanan la curvatura de campo que se produce con

objetivos de mayor aumento. Son semejantes a los oculares de tipo Huygens
pero con una doble lente ocular (11).
Figura 2-7.-Modelos de oculares. (a) Ocular de Huygens, (b) ocular
compensador y (c) ocular de Ramsden. Los oculares negativos (a y b) poseen el
diafragma entre las dos lentes (colectora y ocular) y los oculares positivos
poseen el diafragma por debajo de las lentes (c). Modificado de Digit Life (67).

Uno de los diseos de oculares ms avanzados es el ocular Periplan (38) (fig. 2-

8) que contiene siete lentes que corrigen las aberraciones cromticas, la
curvatura de campo y su empleo ptimo es en combinacin con objetivos de gran
poder de aumento.

Figura 2-8.-Diagrama de la constitucin del ocular Periplan. Es un ocular

negativo. Modificado de M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus
Microscopy Resource Center (15).

Los modelos de microscopios ms simples poseen un solo ocular (mono-

oculares), sin embargo hay microscopios binoculares y algunos modelos ms
modernos son trinoculares, especiales para la microfotografa. Los binoculares
tienen los objetivos dispuestos con una inclinacin de 45 para realizar la
observacin cmodamente.
Campo del microscopio:

Se denomina campo del microscopio al crculo visible que se observa en el

ocular. Tambin podemos definirlo como la porcin del plano visible observado
a travs de las lentes. Si el aumento es mayor, el campo disminuye, lo cual quiere
decir que el campo es inversamente proporcional al aumento del microscopio.
La forma del campo est determinada por el diafragma fijo del ocular, que
generalmente es de forma circular, no obstante el campo puede ser cuadrado y
esta forma es muy til al realizar estudios de coprologa o hematologa, en donde
se requiere reconstruir la totalidad del campo de observacin de la preparacin,
lo cual se dificulta con un campo circular clsico al quedar zonas superpuestas
(11).

El ocular produce un aumento adicional a la imagen proporcionada por el

objetivo. El valor de este aumento est inscrito en la superficie del ocular y
generalmente es de 10x, 12.5x, 15x, 20x o 25x. Otro valor es el nmero de campo
que consiste en el dimetro en milmetros de la apertura fija del diafragma, la
cual puede variar desde 18mm hasta 26.5mm.

Los oculares modernos poseen otro tipo de inscripciones que denotan sus
caractersticas:
UW: Ultra wide, en oculares que poseen un campo visual muy amplio.

H: Para un alto punto focal del observador que usa lentes durante la
observacin microscpica.

K, C, comp: Para oculares compensadores.

Plan-comp: Objetivos que corrigen curvatura de campo y dan campos planos.

Otra de las aplicaciones del ocular consiste en la cuantificacin o medicin de

estructuras del espcimen en estudio. En ciertos casos es relevante conocer el
nmero, tamao o dimensiones de las clulas y dems elementos del tejido.

Usualmente se coloca en el plano de la apertura fija del diafragma una pieza

circular de vidrio con una escala o gradilla (fig. 4-9), la cual aparece enfocada y
superpuesta a la imagen del espcimen al encontrarse en el plano de formacin
de la misma. Los oculares para la medicin poseen un mecanismo de enfoque
mediante rotacin. Se debe calibrar la escala de medicin del ocular con cada
objetivo que se use (15). En la actualidad se puede emplear algn software de
computacin para realizar mediciones sobre las imgenes digitales y obtener
datos muy precisos, no obstante, el mtodo ms econmico y de uso ms
generalizado es la medicin con los oculares.

En ocasiones se coloca en el diafragma del ocular una estructura filamentosa

(alambre, pestaa, cerda) denominada sealador, con la finalidad de indicar de
manera especfica alguna estructura en particular en el campo de observacin.
El sealador se aprecia como una lnea oscura que parte del borde del campo
hacia el centro del mismo.

Muchos oculares modernos poseen una copa de goma cuya finalidad es, por una
parte colocar los ojos a la distancia correcta de observacin y por otra, impedir
la formacin de reflejos luminosos que dificulten la visualizacin. Algunos
microscopios binoculares poseen un mecanismo de enfoque del ocular que
ajusta las dioptras en caso que el observador posea una disminucin de su
agudeza visual. El ajuste se realiza por separado tanto para el ojo derecho como
para el izquierdo; de igual manera se ajustan a la distancia interpupilar del
observador (usualmente entre 55 y 75 mm).

Figura 4-9.-Microfotografa de un frotis de sangre perifrica en la que se observa

un campo rectangular con una escala de divisiones precisas, que en este caso
son en el orden de 1/10 mm. Para determinar el tamao de una clula se cuenta
el nmero de divisiones que ocupa y la cifra se divide entre el aumento del
objetivo empleado, dando como resultado un valor que corresponde al tamao
de la misma. Si la clula mide 7 divisiones, corresponde a 7/10mm; si el aumento
del objetivo es 100x, se divide 0.7mm:100 = 0.007mm = 7m. Tomado de Kapitza
H G. (1997). Microscopy from the very begining. 2 ed. (13).

2.5.-Sistema de iluminacin

El sistema de iluminacin est constituido por las partes del microscopio que
producen o captan, reflejan y regulan la intensidad de la luz que se utiliza para
la observacin microscpica. Uno de los aspectos crticos a considerar en la
microscopa ptica es la fuente de luz que se emplea para iluminar el espcimen.
Si la muestra es iluminada de manera inadecuada, la calidad de la imagen que
se obtiene se ver afectada, aun cuando se disponga de un excelente sistema
ptico. La iluminacin ptima debe ser brillante, sin resplandores y en lo posible
debe dispersarse de manera uniforme en el campo de observacin.

Si se emplea luz visible (fotones) es usual que al microscopio se le denomine

fotnico. En sus inicios, la microscopa se practicaba con iluminacin por
reflexin; se utilizaba un espejo que se orientaba para recoger la luz solar o en
su defecto, luz artificial (la luz de una vela, mechero a gas, lmparas de aceite o
petrleo) y la desviaba hacia la preparacin. Este mtodo se mantuvo durante
mucho tiempo, en parte debido al lento perfeccionamiento de las bombillas
incandescentes, que consisten en un globo de cristal en el que se ha hecho el
vaco y dentro del cual va colocado un hilo de metal (platino, carbn, tungsteno,
entre otros) que al paso de una corriente elctrica se pone incandescente y sirve
para alumbrar (50).

Con el uso de la bombilla elctrica se suprime este espejo y los microscopios

pueden utilizarse en cualquier lugar. Sin embargo, algunos modelos de
microscopios actuales, desde los ms sencillos y econmicos hasta los ms
sofisticados, an poseen un espejo que sirve para desviar la luz producida por la
bombilla, en el caso que sta no se encuentre alineada con la platina.

El sistema de iluminacin est constituido por la fuente de luz, el condensador y

un diafragma o iris. Como regla general, el sistema de iluminacin est colocado
debajo de la platina y la finalidad es de iluminar mediante luz transmitida. En la
mayora de los casos el estudio de las preparaciones histolgicas se hace por
transiluminacin. En otros casos muy especficos se emplea el mtodo de luz
reflejada, en el cual se ilumina la superficie del espcimen mediante epi-
iluminacin (ver captulo 3). La fuente de luz emite una radiacin que es recogida
por un dispositivo denominado condensador, que a su vez forma un cono
luminoso necesario para la visualizacin con objetivos de mayor aumento.

2.5.1.-Fuentes de luz

Aparte de la luz solar, empleada en microscopios sencillos con espejo, existen

numerosas fuentes de iluminacin artificial, tanto para la observacin rutinaria
como para la microfotografa. La luz artificial presenta numerosas ventajas tales
como la constancia, la uniformidad y la intensidad; adems es muy favorable
para los mayores aumentos. Existen varios tipos de fuentes de luz artificial:

Bombillas de tungsteno y halgenas: La mayora de microscopios de luz estn

dotados de lmparas de este tipo cuyo poder oscila entre 10W y 100W. Se
emplean como fuentes principales o accesorias. Estas lmparas son radiadores
trmicos que emiten una luz continua en un espectro comprendido entre 300
1200 nm. Estn constituidas por un bulbo de cristal relleno de un gas inerte y un
filamento de tungsteno que es activado por una corriente elctrica produciendo
una importante cantidad de luz y calor. Varan mucho en tamao, diseo y forma
(68). Producen una luz blanca pero incrementan la intensidad del azul al rojo. La
luz puede ser muy brillante para la observacin y se reduce con filtros que
disminuyen la intensidad, denominados filtros de densidad neutra, disminuyendo
la intensidad sin alterar los colores. Tambin se emplean filtros de colores que
compensen el color rojo, de manera que se pueda observar la imagen del
espcimen sobre un fondo iluminado neutro, blanco y claro. El vidrio azul corrige
el tinte amarillo que tiene la luz incandescente y se obtiene una luz suave y
agradable que aumenta la definicin.

Lmparas de arco elctrico: Son lmparas que pueden contener gases (vapor
de mercurio, xenn o circonio) y son empleadas para proveer una luz
monocromtica con filtros apropiados, ideal para microfotografa en blanco y
negro o a colores. Tambin se utilizan en microscopios especiales
(fluorescencia).

Lser: En los ltimos aos se ha incrementado el uso de lser (Light

Amplification by Stimulated Emission of Radiation, Amplificacin de Luz por
Emisin Estimulada de Radiacin) (42), que consiste en un dispositivo que
genera un haz de luz con caractersticas de tamao, coherencia, forma y pureza
controladas. El lser de argn es uno de los ms utilizados, cuya emisin est
en el orden de 488-514 nm. Su costo es muy elevado y se emplea principalmente
en microscopa confocal.

LED: De las siglas en ingls Light-Emitting Diode (diodo emisor de luz) es un

dispositivo emisor de luz con caractersticas muy prximas a la luz
monocromtica (espectro reducido). La luz se produce cuando una corriente
elctrica pasa a travs del material semiconductor (arseniuro de galio-aluminio)
del que estn hechos (69). Se utilizan en una amplia gama de artefactos y
lmparas. En comparacin con las bombillas incandescentes, son ms
interesantes porque permiten ahorro de energa con un mayor rendimiento
lumnico. Para microscopa se emplean LED de larga duracin que proveen una
luz muy brillante y fra; esto ltimo es una gran ventaja, puesto que no genera
calor y la observacin es ms cmoda para el usuario. En la actualidad se
producen combinaciones de diodos que emiten una luz blanca.

2.5.2.-Condensador

Es un dispositivo que tiene por finalidad formar conos luminosos grandes, con
aperturas mayores, necesarios para ver con los objetivos de mayor aumento. El
trmino condensador puede considerarse inadecuado, ya que no produce una
condensacin de los rayos luminosos, por el contrario, produce un aumento de
la seccin del cono luminoso (11) que a su vez forma una imagen ms clara.

El condensador est conformado por una o varias lentes situadas debajo de la

platina del microscopio, colocadas entre la fuente de luz y el espcimen. El
primer condensador que se fabric en 1838 (por Dujardin) posea tres lentes
acromticas. Al igual que en los objetivos, las lentes del condensador poseen
poder de aumento y tambin producen aberraciones, sin embargo, stas tambin
pueden corregirse.
Tipos de condensadores de acuerdo al grado de correccin de aberraciones
pticas (15):
Condensador de Abbe: Es el ms simple, sin correccin de aberraciones y el
ms econmico. Compuesto de dos o ms lentes. Puede llegar a tener una
apertura numrica de 1.4 en modelos de tres lentes. Se emplea para observacin
de rutina y con objetivos de modesta apertura numrica y amplificacin. Una de
las ventajas es el amplio cono de iluminacin que puede producir.

Aplantico: Corrige aberraciones de esfericidad.

Acromtico: Corrige aberraciones cromticas. Contiene tres o cuatro lentes

corregidas para el azul y el rojo. Este condensador es til para observaciones de
rutina con objetivos secos y para microfotografa (blanco y negro o color).

Aplantico-Acromtico: Poseen el ms alto nivel de correccin y es el

condensador de eleccin para microfotografa a color con luz blanca. Puede
contener ocho lentes y su uso es ptimo con inmersin y objetivos de mayor
aumento.

El cono de luz que produce el condensador debe ajustarse de manera apropiada

para optimizar la intensidad y el ngulo de apertura. Cada vez que se cambia un
objetivo se debe realizar un ajuste para obtener el cono de luz conveniente a la
apertura numrica del nuevo objetivo. A menudo no es prctico utilizar el mismo
condensador para un amplio rango de objetivos (2x hasta 100x). Para objetivos
de bajo poder de aumento (menor a 10x) algunos condensadores poseen una
lente frontal adicional que es abatible. La altura del condensador es regulada
mediante un mecanismo activado con un tornillo que lo baja o lo sube,
acercndolo o no a la platina donde est colocado el espcimen (fig. 2-10).

Adems de los condensadores empleados en los microscopios de campo claro,

existe una variedad de modelos de condensadores especializados que se
utilizan en diferentes aplicaciones, cuya finalidad principal es el incremento del
contraste entre los detalles de la estructura del espcimen. Se han desarrollado
condensadores especiales para microscopa de campo oscuro, contraste de
fase, luz polarizada, contraste de interferencia diferencial.
Figura 2-10.-Condensador tipo Abbe y objetivo adaptado. Se observa un
condensador con dos lentes y el trazado del haz de luz en un microscopio
fotnico. El medio de inmersin, en este caso aceite, se puede colocar tanto
entre la lente frontal del condensador y el preparado histolgico como entre el
preparado y la lente frontal del objetivo. Modificado de Davison M, Abramowitz
M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center (15).

2.5.3.-Diafragma o iris

Es un dispositivo que se coloca inmediatamente debajo de la platina. Debe

permitir cambios en la apertura y con dimetros variables cuya finalidad es la de
obtener conos luminosos cada vez ms estrechos y eliminar los rayos de luz
sobrantes. Los primeros diafragmas consistan en un disco de metal con
agujeros de diferente dimetro, el cual se rotaba segn la necesidad. Estos
discos fueron substituidos por el iris, otro dispositivo ms elaborado y con un
diseo que le permite cambiar de dimetro. La apertura del diafragma se regula
en relacin con el tipo de objetivo que se est utilizando. El diafragma o iris est
pintado de negro con la finalidad de eliminar los rayos de luz reflejada que
pueden interferir con la iluminacin del objeto. (11, 70, 71). (fig. 4-11).
Figura 2-11.-Iris con mecanismo para variar la apertura. Tomado de Cross M,
Cole M. Modern Microscope (70).

2.5.4.-Iluminacin Khler

La iluminacin es una variable crtica que hay que considerar al poner en

funcionamiento el microscopio. Con frecuencia el uso incorrecto de la
iluminacin, an en equipos sofisticados, conduce a la obtencin de imgenes
defectuosas. El espcimen debe ser iluminado mediante una fuente de luz
artificial, la cual puede producir artificios en la imagen que se observa.

En el ao 1893, el profesor August Khler propuso un mtodo de iluminacin

para optimizar la observacin microscpica y la microfotografa (15), que permite
aprovechar al mximo las capacidades de las lentes (objetivos) iluminando la
muestra en estudio con un campo de luz uniforme cuyo dimetro sea igual al del
rea de captura del objetivo. Los microscopios modernos estn diseados para
aplicar la iluminacin Khler y los requerimientos son (figs. 2-12 y 2-13):

Condensador que sube y baja para enfocar el cono de luz.

Bombilla con lente colectora.

Dos diafragmas, un diafragma de campo situado a nivel de la lmpara y un

diafragma de apertura, colocado debajo del condensador.
Figura 2-12.-Iluminacin Khler. Se debe iluminar el espcimen siguiendo el
esquema. La lmpara posee un filamento (S) incandescente cuya luz es captada
por la lente colectora L1 y regulada por el diafragma de campo D1. La imagen S
del filamento de la lmpara es proyectada al plano del segundo diafragma D2.
Este primer paso se realiza con D1 completamente abierto. La altura del
condensador L2 se regula de manera que su punto focal est en el plano D2. La
imagen del diafragma de campo D1 es proyectada en el plano de la preparacin
por el condensador. Tomado de Estudio de diafragmas de campo y apertura.
Microscopio (72).

El condensador se desplaza verticalmente hasta obtener una imagen ntida del

diafragma de campo. La iluminacin ideal se consigue cundo el condensador
se encuentra lo ms cerca de la preparacin. El diafragma de campo regula el
dimetro de la apertura de la iluminacin y al cerrarlo se incrementan los
contrastes (15). Una vez ajustada la iluminacin Khler no se debe regular la
intensidad de la luz o el brillo bajando el condensador o cerrando la apertura de
diafragma-iris, por el contrario, se regula la intensidad de la lmpara mediante
un ajuste de voltaje.
Figura 2-13.-Trayectoria de la luz en la iluminacin Khler. Modificado de
Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource
Center (15).

2.6.-Formacin de la imagen en el microscopio compuesto

Con la finalidad de facilitar la comprensin de la propiedad de aumento que

tienen las lentes y en consecuencia el microscopio para observar objetos
minsculos, es necesario conocer algunos aspectos del fenmeno de la visin.
El ojo humano est constituido de tal manera que slo puede tener una visin
clara cuando los rayos luminosos incidentes son paralelos o ligeramente
divergentes, debido a que la retina requiere la participacin del cristalino para
enfocar los rayos en su superficie.

El lmite para visin cercana es la mnima distancia a la cual se puede observar

claramente un objeto; varia de un individuo a otro y se estima entre 15 y 25 cm
(6 y 10 pulgadas respectivamente), depende de la edad y otros factores. El valor
considerado normal es de 25 cm. El tamao aparente de un objeto depende del
ngulo formado por dos lneas proyectadas desde el centro del ojo a las
extremidades de dicho objeto (fig. 2-14)

Figura 2-14. Las lneas dibujadas desde el ojo a A y R forman un ngulo, el cual
es dos veces ms grande que el ngulo de las lneas O-W. De igual manera, la
distancia del ojo a la flecha OW es dos veces la distancia del ojo a la flecha AR.
La flecha en AR aparece dos veces ms grande que la flecha en OW. Las
proporciones se mantienen al alejar o acercar la flecha. Tomado de Hogg J. The
Microscope: Its History, Construction and Applications (73).

Este ngulo as formado se conoce como ngulo de visin o ngulo visual (73).
La utilidad de una lente convexa interpuesta entre el ojo y un objeto cercano
consiste en la reduccin de la divergencia de los rayos luminosos emanados del
objeto, de manera que puedan entrar al ojo en un estado de moderada
divergencia, como si emanaran de un objeto situado ms all del lmite de visin
cercana y en consecuencia se forma la imagen en la retina (fig. 2-15).
Figura 2-15. Diagrama que representa una lente bi-convexa cercana al ojo y a
una flecha pequea (objeto en estudio) cuyos conos dibujados representan parte
de los rayos de luz divergentes emanados de varios puntos. Los rayos emanados
del objeto muy cercano, al incidir en la pupila, son an tan divergentes que no
permiten formar una imagen enfocada en la retina; pero al pasar primero por la
lente son desviados para formar lneas casi paralelas que si pueden ser captadas
por el ojo si ste est a su vez muy cercano a la lente. Tomado de Hogg J. The
Microscope: Its History, Construction and Applications (73).

Esos rayos luminosos emanados del objeto cercano y desviados por la lente son
recibidos por el ojo como si fuesen emanados directamente por una flecha
(objeto) ms grande, aparentemente situada en el lmite de visin cercana del
observador (aprox. 25 cm del ojo). La diferencia de tamao entre la flecha real y
la flecha imaginaria estar determinada por el poder de aumento de la lente. La
imagen formada no es real, no puede ser proyectada en una pantalla o recogida
en una placa fotogrfica; es una imagen mental. Por esta razn la imagen se
denomina virtual y la distancia desde la lente hasta la imagen formada se
denomina distancia focal virtual (74,75).

Al interponer una lente bi-convexa entre un objeto y el ojo se incrementa el

ngulo de visin y en consecuencia el objeto se ver ms grande (fig. 2-16)
Figura 2-16. Sin la lente colocada en fg el ojo ver la flecha con el ngulo
formado por las lneas punteadas b y c, formando la imagen bc. Los rayos bf y
cg emanados de las extremidades de la flecha son refractados por la lente hacia
el ojo en direccin f y g, los cuales crean un ngulo visual mayor que hace que
la fecha se vea ms grande (d-e). Tomado de Hogg J. The Microscope: Its
History, Construction and Applications (73).

Lo que se conoce sobre las propiedades de las lentes permitir comprender el

principio del microscopio compuesto, denominado as, en oposicin a la lupa
(microscopio simple) en base a que est conformado por dos sistemas de lentes,
los cuales deben estar centrados, es decir, tener el mismo eje ptico. El primer
sistema, cercano al objeto en estudio, se denomina objetivo, posee una distancia
focal muy corta y es posible colocar el objeto un poco ms all de su punto focal
para obtener una imagen real, invertida y aumentada.

El sistema de lentes a travs del cual el observador examina se denomina ocular

y funciona como una lupa que aumenta la imagen real producida por el objetivo.
La distancia entre el ocular y el objetivo debe ser calculada de manera que la
imagen real obtenida por el objetivo se forme entre el ocular y su punto focal (11).
El aumento del microscopio depender en principio de la longitud focal del
objetivo. Mientras ms pequea sea esta longitud y el objeto se acerque al
objetivo, ms grande ser la imagen real. El aumento tambin depende de la
distancia focal del ocular y mientras ms corta sea esta, mayor ser el aumento
(fig. 2-17).

Figura 2-17. Esquema simplificado que muestra el trayecto que siguen los rayos
emanados del espcimen en estudio y su paso a travs de las lentes objetivo y
ocular para la formacin de las imgenes. La flecha ab corresponde al
espcimen, que est colocado un poco por delante del foco (f) del objetivo, el
cual forma una imagen real, aumentada e invertida en ab. Esta imagen se forma
por dentro del foco (f ) de la lente ocular. El ojo del observador percibir a travs
del ocular la imagen virtual, aumentada y derecha ab de la imagen real
ab. Modificado de Langueron M. Prcis de Microscopie (11).

2.7.-Accesorios del microscopio

Habindose familiarizado con la estructura y funcionamiento del microscopio

compuesto, hay que considerar aquellos accesorios que conducen a una
excelente prctica microscpica y que facilitan el trabajo, hacindolo ms rpido
y efectivo o ampliando las capacidades del instrumento. Dentro de las
actividades o posibilidades se pueden citar:
 Medir y cuantificar: Consiste en la micrometra (morfometra) aproximada de los
especmenes observados al microscopio. Para cuantificar longitudes, cantidades
(conteo de clulas, ncleos, partculas), ngulos. Se emplean oculares de
medicin con retculos o gradillas en combinacin con micrmetros
especializados, lminas calibradas, cmaras de conteo y el vernier. En la
actualidad se han desarrollado instrumentos para morfometra que emplean
tecnologa digital y los datos obtenidos pueden ser transmitidos a un computador,
permitiendo as la automatizacin, el almacenamiento de los datos y la obtencin
de variables estadsticas a partir de ellos.

Dibujar: Dibujar las preparaciones microscpicas es una actividad de las ms

completas y precisas que permite obtener una representacin fiel del espcimen
en estudio tal y como el observador la percibe y representa la suma de detalles
que se observan al cambiar el plano de enfoque, obtenindose la sensacin de
relieve y profundidad. Se emplean las cmaras claras y otros dispositivos para
dibujar que estn concebidos con una serie de espejos y prismas que hacen
coincidir en la retina o en una pantalla tanto el campo observado como el plano
en el cual se debe dibujar. Se sigue sobre una hoja de papel el contorno de la
imagen observada al mismo tiempo que se dibuja con un lpiz.

Fotografiar: Una manera de preservar lo observado al microscopio es mediante

la microfotografa. Las imgenes obtenidas se archivan y se emplean en
publicaciones cientficas y presentaciones con fines docentes y banco de datos.
Se necesitan adaptadores para conectar la cmara a un tubo semejante al tubo
del ocular en microscopios trinoculares. Se emplean desde las cmaras
fotogrficas clsicas hasta las cmaras digitales especializadas para acoplar al
microscopio y las cmaras fotogrficas digitales de uso comn. Actualmente la
fotografa clsica resulta complicada, costosa, de resultados menos atractivos y
ha sido desplazada por la fotografa digital que es de ms fcil y prctica
ejecucin. Con las cmaras digitales de alta resolucin se obtienen resultados
muy satisfactorios e inmediatos que pueden ser archivados en el computador
para su posterior anlisis y procesamiento.
 Filmar: La captura de imgenes en movimiento se realiza mediante cmaras de
video (digitales o no) que registran la actividad de especmenes vivos, clulas en
cultivo, cmaras de perfusin, dispositivos con motor y automatizados, entre
otros, para la demostracin y anlisis de procesos fisiolgicos en
videomicroscopa.

Incrementar el contraste: Para facilitar la observacin de especmenes con una

estructura particular y clulas vivas se emplean filtros, condensadores y otros
dispositivos que transforman al microscopio de campo claro en un instrumento
para tal fin, logrndose la microscopia fotnica especial (campo oscuro,
contraste de fases, polarizacin, entre otras).

Procesamiento de imgenes: Con el empleo del computador y de software

especializados para captura, administracin y procesamiento de las
microfotografas, en la actualidad se ha llegado a nuevos niveles en facilidad de
uso y sofisticacin que simplifican la investigacin cientfica (76, 77).

2.8.-Tipos de microscopios

Existen diversas clases de microscopios, segn la conformacin, la naturaleza

de los sistemas de luz y otros elementos utilizados para obtener las imgenes.

El microscopio ptico puede ser monocular, binocular, trinocular (para

microfotografa). En los microscopios binoculares la observacin se hace con los
dos ojos y esto permite una observacin ms cmoda y se percibe una mayor
nitidez de los detalles en la imagen. Se fabrican en diferentes tamaos
incluyendo microscopios pequeos porttiles o de viaje. Dentro de los tipos de
microscopios se describen:

Microscopio vertical: Es el microscopio convencional, perfeccionado a partir de

los modelos antiguos, que posee la fuente de luz ubicada en la base, por debajo
de la platina. Es el microscopio de uso ms comn.

Microscopio invertido: La estructura del microscopio es invertida en

comparacin al microscopio convencional. La fuente de luz est ubicada por
encima de la platina y el principio de funcionamiento y formacin de la imagen
es el mismo que el del microscopio tradicional. Utilizado principalmente para
cultivos celulares (clulas vivas) sin una preparacin previa y para monitorear
actividades (crecimiento, comportamiento) (fig. 2-18).

Figura 2-18.-Microscopio invertido con el revlver y objetivos por debajo de la

platina. La fuente de luz se ubica en la parte superior. Tomado de Instrumental
Pasteur. Microscopio Olympus. (78).

Microscopio estereoscpico: Este tipo de microscopio proporciona una imagen

estereoscpica, en tres dimensiones (3D) del espcimen. Se fundamenta en la
visin binocular convencional, en la que los dos ojos observan el espcimen con
ngulos levemente distintos. El microscopio estereoscpico debe ser binocular.
Se utiliza para observar especmenes de gran tamao, sin corte o preparacin
previa puesto que emplea luz incidente y no funciona por trans-iluminacin. Es
ideal para realizar microdiseccion (fig. 2-19).
Figura 2-19.-Microscopio estereoscpico. Tomado de Kosmos Scientific de
Mxico (79).

Microscopio quirrgico: Es un microscopio que se emplea en microciruga.

Proporciona un campo muy bien iluminado y un aumento de las estructuras
anatmicas, facilitndole al cirujano una mayor visibilidad de los tejidos sanos y
patolgicos que sern manipulados ms cuidadosamente y con menores
posibilidades de lesin. Algunos modelos ms sofisticados tienen piezas
automatizadas robticas. Se utiliza principalmente en intervenciones quirrgicas
en las que se amerite una minuciosa diseccin, como por ejemplo del crneo y
cerebro o del globo ocular (fig. 2-20) (80, 81).
Figura 2-20.-Cirujano empleando microscopio quirrgico. Tomado de Cerrn, V
(80).

Microscopios fotnicos especiales: Ciertos especmenes, principalmente las

clulas vivas o muestras no coloreadas, al ser observados en el microscopio
comn de campo claro, muestran un muy pobre contraste de sus estructuras y
no aportan datos relevantes, a pesar del poder de resolucin de los objetivos
empleados. Para ello se han creado microscopios con ciertas particularidades
que permiten la observacin de ese tipo de especmenes con un incremento muy
satisfactorio del contraste. Entre ellos se citan:

Microscopio de campo oscuro.

Microscopio de luz ultravioleta.

Microscopio de fluorescencia.

Microscopio de polarizacin.

Microscopio de contraste de fases.

Microscopios interferenciales.
 CAPTULO III
EL MICROSCOPIO ELECTRNICO.

Es conveniente que el estudiante de Medicina conozca las bases tericas de la

formacin de la imagen en el microscopio electrnico. Este conocimiento es
necesario para comprender tanto el funcionamiento del instrumento, como para
la interpretacin correcta de las micrografas electrnicas, as como tambin para
la preparacin de los especmenes.

Las clulas estn constituidas a partir de sustancias qumicas orgnicas e

inorgnicas las cuales se organizan en diversos niveles para formar la estructura
de los organoides celulares (membranas, mitocondrias, ncleo, citoesqueleto,
entre otros) y permitir las funciones celulares. El poder de resolucin del
microscopio ptico o fotnico es de 0,2m, y este hecho limita la observacin y
el estudio de la organizacin de los compuestos qumicos celulares y los
organoides. La microscopa electrnica es el nico mtodo que hace posible la
toma de imgenes directas de esas estructuras a niveles supramoleculares;
detalles que tambin son denominados con el trmino de ultraestructura celular.
El lmite o poder de resolucin terico del microscopio electrnico es de 0,2nm y
esto es en parte posible gracias a un tratamiento especial al que se somete el
tejido que va a ser examinado.

Desde el ao 1878 se conoca que el poder de resolucin del microscopio

fotnico estaba limitado en parte por la longitud de onda de la luz utilizada,
pudiendo ser mejorado mediante objetivos de inmersin o el empleo de luz
ultravioleta (19).

La posibilidad de lograr un mayor poder de resolucin no se vislumbr hasta que

se realizaron dos descubrimientos cientficos que fueron decisivos (20):

1. El descubrimiento de las propiedades de los electrones libres, en 1924.

2. El hallazgo de la analoga entre el efecto de una resistencia magntica sobre

un haz de electrones libres y el efecto de las lentes convergentes sobre un rayo
de luz, en 1926.

A partir del hecho que la longitud de onda de los electrones en movimiento es

menor que la longitud de onda de la luz visible, se concibi la idea que las
partculas ms pequeas (como la ultraestructura celular) podran ser
observadas con un haz de electrones enfocado con lentes electromagnticas.

El primer microscopio electrnico fue construido y mostrado pblicamente en el

ao 1931 por Max Knoll y Ernst Ruska (estudiante de tesis doctoral), quienes
trabajaban en el High Tension Laboratory of the Technical University
(Technische Hochschule), Berln, Alemania. Ellos presentaron dos publicaciones
referentes al instrumento, a la ptica de los electrones y otros conceptos. En el
ao 1933 presentaron otro modelo de microscopio electrnico ms
perfeccionado (20). Sin embargo, a pesar de los hechos, algunos atribuyen a
Reinhold Rdenberg la invencin del microscopio electrnico debido a que fue
la primera persona que registr la patente de invencin, pero curiosamente l no
aport nada al desarrollo del instrumento. Cuando Rdenberg introdujo la
primera patente ya Knoll y Ruska haban construido el primer microscopio
electrnico.

El venezolano Humberto Fernndez-Morn (nacido en Maracaibo (Edo. Zulia) el

18.2.1924 y fallecido en Estocolmo, Suecia, el 17.3.1999) contribuy al
desarrollo de la tcnica de la microscopa electrnica y sus aplicaciones en
biologa, medicina y ciencia de los materiales. Fue quien por primera vez utiliza
el concepto de crioultramicrotoma, invent el crio-microscopio electrnico y la
cuchilla de diamante para el corte ultrafino de materiales biolgicos y metales;
as como tambin tcnicas para microscopa electrnica (lentes
superconductoras a temperatura de helio lquido en microscopios electrnicos,
filamentos de punta, porta-especmenes para nitrgeno y helio lquidos).
Fernndez-Morn mostr las primeras micrografas electrnicas que revelaban
la complejidad de la estructura de las membranas mitocondriales, defini la
partcula submitocondrial en la superficie de las membranas de las crestas
mitocondriales (denominadas partculas elementales o partculas de Fernndez-
Morn, actualmente conocidas como ATPasa) (22).

El electrn libre: Haz de electrones.

En el ao 1897, J. J. Thompson (82) detect al electrn y lo defini como la

primera partcula elemental, lo que quiere decir que no puede ser dividida en
constituyentes ms pequeos. El tomo est compuesto por tres tipos de
partculas, los protones, neutrones y electrones. Los protones y neutrones
conforman el ncleo del tomo y los electrones giran en una nube alrededor del
ncleo. Los electrones se representan con la letra e-; poseen una masa en
reposo de 9,1 10-31 kg y tienen una carga elctrica negativa (-1,6 10-19
coulomb). Son determinantes en las uniones de los tomos entre s y su
movimiento produce una corriente elctrica. En condiciones especiales pueden
ser separados de los tomos de ciertos metales. La energa cintica y el
movimiento de los electrones se incrementan con la temperatura a causa del
aumento en la vibracin de los iones, los cuales chocan con los electrones y los
aceleran. Si la temperatura aumenta, algunos electrones pueden adquirir
suficiente velocidad y en consecuencia se despegan, abandonando la superficie
del metal. La pieza de metal (que debe ser como un alambre fino) se puede
calentar haciendo pasar una corriente elctrica.

En una cmara al vacio, el filamento se carga con un potencial negativo (ctodo)

y se aplica un fuerte campo electrosttico entre el alambre y otra superficie
adyacente positiva (nodo). Al aplicar electricidad, los electrones acelerados se
desprenden del ctodo hacia el nodo. La velocidad a la cual los electrones
viajan depender de la fuerza del campo magntico entre el ctodo y el nodo.
El nmero de electrones que se desprendern depender de la temperatura a la
cual es calentado el alambre, la cual a su vez depende de la cantidad de corriente
que pasa por el mismo (14). De esta manera se forma un haz de electrones libres
colimados (paralelos entre s) que viajan a gran velocidad en un alto vaco.

Si hay molculas de aire presentes entre el ctodo y el nodo, los electrones

libres chocarn con las molculas de gas del aire y sern detenidos o
dispersados por esas colisiones. En el vacio los electrones viajan en lnea recta
y si no son afectados por campos electrostticos o magnticos, la velocidad ser
constante. El dimetro del haz puede variar dependiendo de varios factores (83):

El haz tiene tendencia a ensancharse, debido a que los electrones se repelen

por su carga elctrica. Cuanto ms elevada sea la intensidad del haz (y por lo
tanto el nmero de electrones), mayor ser la seccin transversal del mismo (y
su dimetro).
 Para obtener un haz muy fino hay que corregir la divergencia caracterstica del
haz. La lente electromagntica permite la concentracin del haz al crear un
campo magntico (cuando pasa una corriente elctrica por una bobina formada
por un hilo de material conductor). Este campo concentra y aproxima los
electrones y se reduce el dimetro del haz.

Debido a que se estudian elementos de dimensiones atmicas, es necesario,

como en la descripcin de la luz visible, emplear la definicin cuntica de la
naturaleza de los electrones. Hay que considerar al electrn como onda en
ciertas condiciones y como partcula en otras. La colisin de dos electrones se
comprende mejor al imaginar a cada electrn como una partcula; sin embargo,
al estudiar fenmenos tales como la difraccin, los electrones deben ser
considerados como ondas.

3.2.-Tcnicas de microscopa electrnica

El principio de la microscopa electrnica es muy similar al de la microscopia de

luz y se han desarrollado dos principales tcnicas (14):

1. Microscopa electrnica de transmisin: Se observa a travs del espcimen

(trans- iluminacin). El espcimen se corta en lminas ultrafinas (en el orden de
nanmetros) que se colocan en una rejilla de cobre, la cual es bombardeada con
un haz de electrones enfocado. Una silueta del espcimen se proyecta en una
pantalla fluorescente o placa fotogrfica situada por debajo del mismo. La
resolucin puede ser de 0,2nm.

2. Microscopa electrnica de barrido: Se observa la superficie de un espcimen

slido (epi-iluminacin). Se puede lograr una resolucin de 10nm y un aumento
hasta de 20.000x. Se producen imgenes muy interesantes en 3D
(tridimensionales) gracias a una mayor profundidad de campo. Se escanea la
superficie del espcimen con un haz de electrones (primarios) y los electrones
que rebotan (secundarios) son recogidos por un detector. La seal se observa
en un monitor de televisin. Los tomos del espcimen producen rayos X que
tambin son detectados.

3.2.1.-Diseo del microscopio electrnico de transmisin

A partir del modelo construido por Knoll y Ruska en 1931 (fig.3-1), varias casas
comerciales (RCA, Siemens, GE, entre otras) han producido diversos modelos
de microscopios electrnicos modernos, pero todos ellos basados en el modelo
original.
Conformacin del microscopio electrnico de transmisin:

Una cmara al vaco, el cual es generado por una bomba.

Una columna donde se genera y viaja el haz de electrones.

Un sistema ptico que forma una imagen en una pantalla fluorescente o en una
placa fotogrfica.

Circuito electrnico estabilizador de voltaje.

Como se vio anteriormente, el haz de electrones se obtiene calentando el

filamento del ctodo; los electrones se aceleran aplicando un voltaje entre el
ctodo y el nodo. El ctodo posee un potencial altamente negativo.

El sistema ptico consiste en un condensador que concentra y dirige el haz de

electrones hacia el espcimen; una lente objetivo y otra lente proyectora, las
cuales en conjunto producen una imagen aumentada que se proyecta en una
pantalla fluorescente o una pelcula fotogrfica.

El espcimen se coloca en un dispositivo que permite moverlo en dos

direcciones, en un plano perpendicular al plano del eje del microscopio. La
columna posee un sistema de vaciado conectado a bombas de difusin o
bombas mecnicas que crean el vacio.

El alto voltaje negativo aplicado al ctodo es producido por un circuito elctrico

de alto voltaje y las corrientes aplicadas a las lentes son producidas por circuitos
de bajo voltaje. Las bombas de difusin e incluso las lentes (en ciertos modelos
de microscopios) son enfriadas mediante un mecanismo de circulacin de agua
(14).
Figura 3-1.-El primer microscopio electrnico desarrollado por Knoll y Ruska
(1931). (1) Tubo de descarga, (2) ctodo, (3) vlvula, (4) espacio para lente
electrosttica (opcional), (5) lente magntica objetivo, (6) lente de proyeccin, (7)
columna de alto vaco, (8) salida a la bomba de vaco, (9) caja de Faraday para
medir la corriente del haz de electrones, (10) pantalla fluorescente o placa
fotogrfica, (11) vlvula para medir el vaco, (12) apertura del nodo, (13)
aperturas o diafragmas, (14) vlvula de vaco, (15) ventana de observacin, (16)
pantalla fluorescente removible para observacin, (17) cmara. Ntese que este
primer modelo carece de condensador. Modificado de Freundlich M. (1963) (20).

Elementos que conforman el microscopio electrnico de transmisin:

Emisor de electrones:
Al igual que en el microscopio fotnico, la fuente de irradiacin es pequea, a
partir de la cual se genera un estrecho haz de electrones. El haz de electrones
de alta energa puede obtenerse de varias maneras (84):

- Por emisin termoinica: Es la forma ms comn y se realiza a partir de un

delgado filamento de tungsteno dispuesto en forma de V. El metal debe
calentarse a una muy alta temperatura mediante una corriente elctrica (muy alto
voltaje) para acelerar a un nmero importante de electrones que se
desprendern de la punta de la V. Los electrones que se liberan tienden a formar
una nube prxima a la superficie del metal y con la aplicacin de un campo
elctrico entre el filamento (ctodo) y una porcin de la columna (nodo) los
electrones son acelerados. Otros materiales pueden ser empleados en la
confeccin del ctodo, tales como oxido de bario, platino, lantano, entre otros
(fig. 3-2).

-Por emisin de campo: Se aplica un fuerte campo elctrico (109 Vm) para
extraer los electrones del filamento de metal (tungsteno). La temperatura es
mucho menor que en la emisin termoinica. Se obtiene un haz de electrones
de mayor intensidad y se requiere de un vaco absoluto.

Figura 3-2.-Filamento de hexaboride de lantano LaB6. Tomada de The Electron

Gun. Electron Microscopy (85).

Condensador:

Con la introduccin del condensador, conformado por una lente

electromagntica, el haz de electrones puede ser enfocado de manera ms
precisa en el espcimen. La lente est colocada aproximadamente a media
distancia entre el ctodo y el plano del objeto (equivalente a la platina en el
microscopio fotnico). En algunos microscopios se coloca un doble condensador
con la finalidad de lograr mayor resolucin y aumento; de esta manera se reduce
el riesgo de dao trmico y contaminacin del espcimen. En la bsqueda de un
mayor aumento, es necesario emplear un haz de electrones ms potente e
intenso, lo cual literalmente quema el espcimen, de all que la observacin deba
hacerse rpidamente para que el tiempo de exposicin a los electrones sea corto
(14).

Sistema ptico:

Un microscopio electrnico de transmisin funciona de manera anloga al

microscopio de luz. En lugar de un haz de fotones, se emplea un haz de
electrones aumentado y enfocado ya sea por lentes elctricas (electrostticas) o
magnticas (electromagnticas). Un electrn al moverse por un campo
magntico cambia su direccin y se desplaza en ngulo recto con respecto a la
direccin del campo magntico. El grado de desviacin es inversamente
proporcional a la fuerza del campo y a la carga del electrn. De igual manera, un
electrn que se mueve en un campo elctrico tambin cambia su direccin.
Como resultado de la atraccin entre una placa de carga positiva y la carga
negativa del electrn, ste ltimo es desviado hacia la placa. En consecuencia,
hay dos vas para desviar los electrones con la finalidad de utilizarlos de manera
anloga a un rayo de luz y producir una imagen aumentada de un objeto. Esto
se logra mediante un campo elctrico o mediante un campo electromagntico.
Ambos tipos de campos seran empleados como lentes.

Los tipos de lentes empleadas en el microscopio electrnico obedecen entonces

a dos modelos, las lentes electrostticas y las lentes electromagnticas. Durante
aos los fabricantes se han debatido entre ambos tipos de lentes, con la finalidad
de demostrar cual lente era la ms eficiente y daba mejores resultados. Los
modelos electromagnticos demostraron ser superiores (86).

Lentes electromagnticas y aberraciones:

De manera simplificada se puede decir que las lentes electromagnticas son

electroimanes que estn formados por un solenoide o bobina muy bien
comprimida, constituida por un material conductor filamentoso, por el cual pasa
una corriente elctrica constante. El solenoide est alojado dentro de un
contenedor de metal en forma de anillo, el cual posee una hendidura o ranura en
su cara interna (fig. 3-3). El flujo magntico y las lneas de fuerza se concentran
en la ranura y en el centro del anillo.

Propiedades de las lentes electromagnticas: Las propiedades de las lentes son

(14):
Cada campo magntico posee una simetra axial y acta como una lente para
los electrones.

Todas las lentes electromagnticas son positivas.

La velocidad de los electrones no se ve afectada.

La imagen formada est rotada e invertida en relacin al objeto.

Aberraciones: Las mismas aberraciones que afectan las lentes pticas de cristal
afectan la formacin de las imgenes en las lentes electromagnticas (14):

Aberracin de esfericidad: Es la ms importante en la microscopa electrnica

y es el factor que ms limita el poder de resolucin.

Distorsin: Cambios en la imagen de la forma de los objetos (en barril, en

almohadilla y distorsin espiral).

Curvatura de campo.

Astigmatismo.

Aberraciones cromticas: Originadas por variaciones en la velocidad de los

electrones, los cuales pueden abandonar el ctodo emisor a diferentes
velocidades, las cuales pueden ser modificadas al ser sometidos a la aceleracin
por la diferencia de voltaje.

Otras: producidas por la rotacin de los electrones al pasar por el campo

magntico.
Figura 3-3.-Comparacin entre una lente electromagntica y una lente de cristal.
En la primera (izquierda) en corte longitudinal, una bobina de cobre (material
conductor) est aislada en una cubierta de metal que posee una ranura en la
cara interna (N-S). En la parte superior, la lnea azul representa el objeto y en la
parte inferior, la imagen del mismo obtenida por la lente. En amarillo se muestra
el trayecto de electrones y fotones, dependiendo del tipo de lente. Modificado de
Matter. Electromagnetic Lenses (87).

La mayora de microscopios electrnicos emplean lentes electromagnticas.

Una razn de peso es que las lentes electrostticas, en comparacin a las
magnticas, son ms sensibles a la calidad del vaco y limpieza de los
componentes; de igual manera, en las primeras, algunas aberraciones son ms
severas y requieren de campos electrostticos muy poderosos los cuales pueden
ocasionar alteraciones elctricas dentro de la columna del microscopio,
afectando el haz de electrones.

El sistema ptico se emplea para producir una imagen del espcimen.

Generalmente se colocan tres lentes (fig. 3-4):

- Lente objetivo: Es la ms importante, pues determina el poder resolutivo del

microscopio.
- Lente intermedia.
- Lente de proyeccin: En algunos casos es doble. La funcin de esta lente es la
de producir el aumento final.

Platina:

Cumple una funcin similar a la platina en el microscopio fotnico garantizando

el intercambio de especmenes y el movimiento preciso del mismo durante la
observacin. En el microscopio electrnico de transmisin la platina es un
dispositivo extrable en el cual se coloca la rejilla de cobre sobre la cual se ha
depositado el corte ultrafino del tejido. La platina debe conservarse muy limpia,
de lo contrario se ver afectado el movimiento de la muestra, entorpeciendo la
observacin.

Pantalla o visor y la cmara fotogrfica:

La imagen se proyecta en una pantalla fluorescente en la cual la energa cintica

de los electrones se transforma en luz gracias a la fluorescencia. La pantalla
consiste en una superficie revestida de una capa de cristales de sulfato de zinc.
Cada cristal es una unidad que emana luz cuando sobre ella inciden electrones
y en consecuencia la resolucin de la pantalla depender de la talla de los
cristales (14).

Las imgenes pueden grabarse en una pelcula fotogrfica. Al igual que los
fotones, los electrones al incidir sobre la emulsin fotogrfica producen cambios
en los cristales de bromuro de plata, obtenindose un negativo en blanco y
negro, que una vez revelado por mtodos clsicos fotogrficos puede ser
copiado en papel. De esta manera se obtiene la microfotografa (micrografa)
electrnica.

Sistema de vaco:

Los electrones al chocar con las molculas de aire se dispersan y luego de

repetidas colisiones son detenidos. Esta dispersin puede arruinar las
posibilidades de obtener imgenes bien definidas. Es por ello que el haz de
electrones empleado en la microscopia electrnica debe viajar en un espacio al
vaco, es decir, bien evacuado y sin molculas de aire. La diferencia de alto
voltaje entre el ctodo y el nodo podra ocasionar descargas si existiera un
nmero suficiente de molculas de gas que facilitaran la ionizacin en este
espacio. De all que es necesario mantener una baja presin de gas en la cmara
donde se encuentra el filamento emisor de electrones, lo cual a su vez alarga el
tiempo de vida til del mismo al prevenir la oxidacin del filamento de tungsteno.
Un vaco deficiente se identifica gracias a las descargas producidas.

La presin del aire en la columna del microscopio debe estar entre 10-4 a 10-5
mm Hg. Esto es considerado como alto vaco y se produce mediante el uso de
bombas mecnicas que extraen el aire del interior de la columna del microscopio.
Las bombas pueden ser de difusin en las cuales las molculas de aire difunden
en vapor de aceite y de mercurio (14).

Figura 3-4.-Izquierda: Modelo Philips moderno acoplado a una computadora.

Derecha: Primer microscopio Electrnico de Transmisin del occidente del pas,
utilizado por el Dr. Julio M. Sosa en la Universidad de Los Andes. Tomado de
The Electron Gun. Electron Microscopy. (85) y Oficina de Prensa Universidad de
Los Andes. Centro Latinoamericano y del Caribe para la Investigacin sobre la
Enseanza de la Ciencia (Celciec) y (88) respectivamente.

3.2.2.-Diseo del microscopio electrnico de barrido

Los cortes finos de tejido no muestran el arreglo tridimensional de los

constituyentes celulares y aunque la tercera dimensin puede ser reconstruida a
partir de cortes seriados, es un mtodo largo y pesado. El microscopio
electrnico de barrido permite la visualizacin de las muestras en 3D y el haz de
electrones no atraviesa la muestra, por el contrario, incide sobre la superficie de
la misma y los electrones secundarios son captados por un detector y la seal
es enviada a una pantalla de televisin. La profundidad de campo obtenida por
este microscopio es considerable; la imagen es constituida de zonas brillantes y
zonas oscuras que dan un aspecto tridimensional. Sin embargo, solamente la
superficie puede ser observada. La tcnica se emplea para estudiar clulas
intactas y tejidos (21).

Componentes bsicos del microscopio electrnico de barrido (fig. 4-5):

Sistema de alto vaco.

El filamento emisor de electrones (ctodo).

Lentes (electromagnticas, electrostticas o superconductoras).

Generador del escaneo: El haz de electrones es desplazado por la superficie

del espcimen de una manera predeterminada.

Detector de electrones secundarios.

Pantalla de televisin.
Figura 3-5.-Diagrama esquemtico que muestra los componentes
fundamentales del microscopio electrnico de barrido. Modificado de Nixon W.
The General Principles of Scanning Electron Microscopy (89).

El haz de electrones o electrones primarios, al incidir en la superficie de la

muestra genera electrones secundarios, los cuales se originan del espcimen y
son colectados por un detector de electrones. Adems de electrones
secundarios, tambin se producen rayos X, infra-rojos, y ultravioleta (89).

El espcimen es colocado en una platina portaobjeto y puede ser desplazado o

rotado en varias direcciones, permitiendo un amplio rango de posibilidades de
observacin.

Otros accesorios pueden aadirse al microscopio, tales como computadoras

para anlisis directo, impresoras, videocmaras, circuito cerrado de televisin,
entre otros (fig. 3-6).
Figura 3-6.-Microscopio electrnico de barrido. A la izquierda se aprecia el
microscopio propiamente dicho, notablemente la columna y la cmara en la cual
se coloca el espcimen. A la derecha los monitores acoplados para la
observacin de las imgenes en 3D. Tomado de The Science and Education
Resource Center , Charleton College (90).

3.3.- Formacin de la imagen en los microscopios electrnicos

Los pasos bsicos de la formacin de la imagen en el microscopio electrnico,

tanto de transmisin como de barrido son (figs. 3-7, 3-8 y 3-9):

1. Un haz de electrones se forma en el ctodo y es acelerado hacia el espcimen

gracias a un potencial elctrico positivo.

2. El haz de electrones es enfocado mediante el empleo de lentes

electromagnticas.

3. En la muestra irradiada ocurren interacciones las cuales afectan el haz de

electrones.

4. Las interacciones y efectos son detectadas y transformadas en una imagen.

5. La imagen es formada en un dispositivo (pantalla fluorescente, monitor de

televisin, placa fotogrfica).
Figura 3-7.-Representacin esquemtica del sistema ptico del microscopio
electrnico de transmisin, en el cual se aprecia un proceso de aumento en tres
etapas y la formacin de la imagen. Modificado de Sjstrand F. (1967). Electron
Microscopy of Cells and Tissues. Vol. 1, Instrumentation and Techniques (14).
Figura 3-8.-Esquema que muestra de manera simplificada la formacin de la
imagen en el microscopio electrnico de transmisin. Modificada de Electron
Microscopy (23).

Figura 3-9.-Esquema que muestra de manera simplificada la formacin de la

imagen en el microscopio electrnico de barrido. Modificada de Electron
Microscopy (23).

3.4.-Poder de resolucin: Aumentos

El poder de resolucin est determinado en parte por la longitud de onda de la

radiacin empleada para iluminar el espcimen y es inversamente proporcional
a la misma, es decir, a menor longitud de onda, mayor poder de resolucin. El
haz de electrones puede tener longitudes de onda variables, las cuales influyen
en el lmite de resolucin que a su vez depender del voltaje empleado para
acelerar los electrones (tabla 3-1).
 Voltaje de Limite de resolucin
Longitud de onda ()
Aceleracin (kV) terico ()

10 0.122 (0.122nm) 3.7 (0.37nm)

20 0.086 (0.0086nm) 2.9 (0.29nm)

50 0.054 (0.0054nm) 2.1 (0.21nm)

100 0.037 (0.0037nm) 1.7 (0.17nm)

200 0.025 (0.0025nm) 1.3 (0.13nm)

500 0.014 (0.0014nm) 0.9 (0.9nm)

1000 0.009 (0.0009nm) 0.7 (0.07nm)

Tabla 5-1.-Relacin del voltaje de aceleracin, la longitud de onda del haz de

electrones y el poder de resolucin en el microscopio electrnico de transmisin
expresadas en kilovoltios (kV), angstroms () y nanmetros (nm). Modificado de
Sjstrand F. (1967). Electron Microscopy of Cells and Tissues. Vol. 1,
Instrumentation and Techniques (14).

Con el microscopio electrnico se puede alcanzar una resolucin de

aproximadamente 40.000 veces ms que el poder de resolucin del microscopio
de luz y 2 x 106 veces el poder de resolucin del ojo humano.

5.4.1.-Aumentos en el microscopio electrnico

En el microscopio fotnico para obtener imgenes a mayores aumentos,

simplemente se cambia el objetivo. En el microscopio electrnico esto no es
posible y el aumento se obtiene modificando el haz de electrones y el voltaje de
la lente proyectora, puesto que el aumento de la lente objetivo es fijo. Por
ejemplo, para observar a mayores aumentos es necesario utilizar una mayor e
intensa radiacin de electrones y modificar la distancia focal de la lente
proyectora, pero disminuyendo a su vez el dimetro del haz, con un tiempo de
exposicin del espcimen sumamente corto. Al intensificar el haz de electrones
se incrementa tambin la temperatura y se puede quemar la muestra que se
observa. Al aumentar la potencia del haz se reduce el tamao del rea que se
observa y el campo visual representa reas muy diminutas en el objeto. Para un
aumento de aproximadamente 80.000x, el dimetro del rea del campo visual es
menor a un micrn (1m). Esta rea diminuta que se observa ocupar todo el
dimetro de la pantalla de observacin o de la placa fotogrfica. De manera
inversa, para observar a menores aumentos, el haz de electrones posee un
mayor dimetro y el rea de observacin a su vez tambin es mayor; en
consecuencia, a mayor dimetro del haz de electrones, menor aumento y a
menor dimetro del haz, mayor aumento (14).

5.5.-Preparacin de los especmenes. Contraste. Aplicaciones

5.5.1.-Microscopa electrnica de transmisin

La resolucin que se puede lograr con el microscopio electrnico depende del

espesor del corte del tejido y de factores que determinen el contraste. Si el corte
es grueso se enmascaran los detalles finos, los cuales se hacen cada vez ms
imperceptibles y oscuros debido a la superposicin de elementos que se
presentan en los diversos planos de profundidad. De all que es imperativo el
empleo de cortes ultrafinos.

De manera resumida, los pasos necesarios en el procesamiento del tejido antes

de ser observado al microscopio electrnico de transmisin son los siguientes
(14, 21, 23):

1. Fijacin: El tejido debe ser fijado, endurecido y preservado con tetraxido de

osmio (OsO4) y glutaraldehdo, con un cuidadoso manejo del pH (con cacodilato
de sodio), para mantener las membranas y las protenas celulares en una malla
tridimensional resistente. Los aldehdos crean puentes cruzados entre s y
enlaces covalentes con los grupos amino que estn libres en las protenas. De
esta manera se previene la degradacin oxidativa por la muerte del espcimen.

2. Contraste: Las organelas y estructuras de inters deben ser electrn-densas

y contrastar con el fondo (background). La electrondensidad se incrementa con
el nmero atmico de los elementos y solo tomos pesados crean contraste. Se
contrasta con tetraxido de osmio, acetato de uranilo o citrato de plomo.

3. Deshidratacin: El espcimen va a estar en el vaco y no puede contener agua,

pues esta se evaporar y dispersar los electrones. El agua se elimina mediante
alcoholes en grado creciente de concentracin.

4. Inclusin: El espcimen deshidratado se coloca en xido de propileno y

resinas epxicas o acrlicas, las cuales se endurecen y forman un bloque slido
de plstico muy duro.

5. Corte: Se emplea un ultramicrtomo que permite rebanar el tejido en cortes

ultrafinos con una cuchilla de diamante, logrando cortes del orden de los 100 nm.
Los electrones tiene un bajo poder de penetracin y no es conveniente usar
cortes gruesos.

6. Observacin y toma de micrografas.

Algunas aplicaciones del Microscopio electrnico de transmisin:

Estudios de ultraestructura de tejidos vegetales, animales y humanos (91,92,

93).

Realizacin de estudios de histoqumica e inmunohistoqumica para

identificar compuestos especficos.

Reconocimiento de virus y sus caractersticas ultraestructurales.

Estudios de citoqumica.

Estudios de estructuras moleculares.

Determinacin de estructura cristalina en minerales, metales y otros materiales.

Estudio de fases y zonas cristalinas en polmeros.

 Determinacin del tamao de partculas.

Cambios estructurales de materiales sometidos a diferentes tratamientos.

5.5.2.-Microscopa electrnica de barrido

La preparacin de los especmenes difiere un poco de la preparacin para el

microscopio electrnico de transmisin, pues el microscopio electrnico de
barrido muestra imgenes en tres dimensiones (3D) en aumentos de hasta
20.000x y una resolucin que puede llegar a los 5nm.

Preparacin de la muestra (21, 23):

1. Fijacin: Segn mtodos estndar de fijacin.

2. Deshidratacin: Mediante varios mtodos, pero uno de los ms utilizados es

el de deshidratacin por punto crtico en CO2, en el cual el agua pasa
rpidamente de estado lquido a vapor sin ebullicin. La deshidratacin por
alcohol produce artificios en el espcimen y no es utilizada.

3. Corte: Algunos especmenes no ameritan ser rebanados, pues se observar

la superficie del mismo.

4. Contraste: El espcimen deshidratado es revestido por una capa de grafito o

de oro.

5. Observacin y toma de microfotografas.

Algunas aplicaciones del Microscopio electrnico de barrido:

Morfologa de clulas y tejidos animales, humanos o vegetales (91).

Morfologa interna de clulas y tejidos.

Morfologa superficial de minerales.

Formas de cristalizacin de minerales.

Cambios morfolgicos de materiales sometidos a tratamientos qumicos.

 Estudio de molculas.

Reconocimiento de fsiles.

5.6.-Microfotografa electrnica: Interpretacin de las imgenes

Al observar y estudiar las microfotografas electrnicas se debe ser muy

cuidadoso en la interpretacin de las imgenes de la ultraestructura celular.
Muchas interrogantes han persistido en la mente de los microscopistas, quienes
han tratado de explicar y buscar respuestas a ellas. Durante muchos aos se ha
planteado la duda si en realidad lo que se observa en las micrografas
electrnicas de transmisin corresponde a la realidad, o si por el contrario, es el
aspecto de los elementos celulares modificados por las sustancias y mtodos
empleados en el procesamiento del tejido (artificios de tcnica); o debidos a la
muerte celular y sus efectos en el citoplasma, notablemente en los lisosomas.
Estas dudas sobre los artificios de tcnica han podido disiparse (en parte)
mediante el uso de controles negativos y al comparar entre s las micrografas
de microscopa de luz, electrnica de transmisin y de barrido. Con el empleo de
tcnicas ms recientes como inmunofluorescencia y microscopa confocal
muchas estructuras presentes en la clula han sido estudiadas, corroborando su
aspecto morfolgico observado previamente en las micrografas electrnicas.
El contraste observado en las microfotografas electrnicas de transmisin
depende de ciertas propiedades del espcimen, del sistema ptico del
microscopio y de las condiciones de iluminacin y reproduccin fotogrfica.
Las regiones del espcimen que contienen metales pesados empleados en la
obtencin del preparado, aparecen como regiones oscuras (electron-densas)
debido al poder que poseen los tomos del metal pesado en dispersar los
electrones que inciden sobre la muestra. Las regiones del espcimen (por
ejemplo cristales) que poseen una mayor densidad aparecern ms oscuras que
las regiones vecinas amorfas (fig. 5-10). A mayor cantidad de metal depositado,
mayor electrondensidad, lo cual permite un marcado contraste, el cual es
revelado en una amplia gama que va desde el negro, pasando por los tonos de
gris hasta llegar al blanco; esto ltimo representa las zonas en las que no se
deposit el metal. Variaciones en el espesor del espcimen afectan la
interpretacin debido a la superposicin de elementos; a mayor espesor, mayor
contraste, de all que el espesor del corte debe ser mnimo (alrededor de 100
nanmetros). Los cortes son colocados en una rejilla (portaobjeto) de cobre
revestida de una pelcula plstica y este material puede incrementar la
granulosidad en la imagen y puede interferir seriamente con el contraste de la
microfotografa (14).
Las microfotografas electrnicas de barrido muestran una imagen 3D
(tridimensional) del espcimen analizado. En la micrografa las zonas ms
oscuras corresponden a los planos ms profundos y las zonas ms claras a los
planos ms superficiales del espcimen, a partir de los cuales se origin una
mayor cantidad de electrones secundarios. Al componerse la imagen de zonas
claras y oscuras se puede apreciar el relieve y las depresiones, que en conjunto,
conformarn el aspecto tridimensional (fig. 5-11).

Figura 5-10.- Microfotografa electrnica de una mitocondria al Microscopio

electrnico de transmisin. Las zonas ms oscuras son denominadas electron-
densas y las zonas claras son denominadas electron-lcidas. Ntese la variada
electrondensidad, la cual depende del grado de afinidad de las estructuras por
los metales empleados para el contraste. Aumento 60.000x. Tomada de
Raisman, J., Gonzlez A. Hipertextos en el rea de biologa. Microscopa
electrnica (94).

Figura 5-11.- Microfotografa electrnica de un glomrulo renal al Microscopio

electrnico de barrido. La imagen obtenida se observa en tres dimensiones,
donde la profundidad de campo permite visualizar los diversos relieves. Aumento
1.200x. Tomada de Raisman, J., Gonzlez A. Hipertextos en el rea de biologa.
Microscopa electrnica (94).

5.7.-Semejanzas y diferencias entre la microscopa electrnica y la microscopia

de luz

5.7.1.-Semejanzas (fig. 5-12):

Diseo y funciones de sus elementos.

En relacin al sistema de iluminacin: La radiacin empleada incide

directamente sobre la muestra en estudio. Est conformado por una fuente
emisora de la radiacin y un condensador que enfoca el rayo sobre el preparado
histolgico.
 El espcimen se coloca entre el sistema de iluminacin y los objetivos o
sistemas de formacin de la imagen.

En relacin al sistema ptico: Las lentes acopladas producen una imagen

aumentada del espcimen en estudio. Conformado por una lente objetivo que
forma una imagen intermedia y la lente proyectora (ocular, en el caso del
microscopio fotnico) que a su vez aumenta la imagen intermedia para formar la
imagen aumentada final.

Pueden convertir la radiacin empleada en una imagen permanente

(microfotografa).

5.7.2.-Diferencias: Tabla 5-2

Elemento Microscopio fotnico Microscopio electrnico

De cristal o vidrio, con Magnticas, a partir de

distancias focales metales magnticos,
fijas alambre de cobre enrollado,
LENTES
cuya distancia focal vara en
relacin con la corriente que
pasa por la bobina de cobre

Se consigue El aumento del objetivo es

cambiando los fijo (distancia focal) mientras

AUMENTO objetivos, rotando el que la distancia focal de la

revlver lente proyectora vara para
lograr los aumentos

Pequea, por lo que

PROFUNDIDAD Mayor, por lo que se puede
se pueden ver
DE CAMPO ver enfocado todo el espesor
diferentes planos de
 enfoque al mover el del corte ultrafino del
tornillo micromtrico espcimen

Haz de luz: fotones.

Haz de electrones.
Generalmente
FUENTE DE LA Ubicada siempre en lo alto
situada por debajo del
RADIACIN del instrumento, por encima
espcimen (aunque
del espcimen
hay excepciones)

Imprescindible, para facilitar

ALTO VACO No es necesario el desplazamiento de los
electrones

RESOLUCIN 0,2 m 0,2nm

Tabla 5-2.-Comparacin entre las caractersticas generales de los microscopios

de luz y microscopios electrnicos.
Figura 5-12.-Comparacin de tres tipos de microscopios y sus caractersticas
ms resaltantes. Tomado de Gartner, L., Hiatt, J. (2002). Texto Atlas de
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