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Turbidimetria y Nefelometria

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SEP

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE MORELIA “José María Morelos y Pavón”

TURBIDIMETRÍA Y NEFELOMETRÍA Química analítica II Eliel Rafael Romero Gracia
INGENIERÍA BIOQUÍMICA
5st SEMESTRE MARÍA CRISTINA VIEYRA BRAVO No control: 09120036 Miércoles 04 de Mayo del 2011

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Contenido
INTRODUCCIÓN............................................................................................................................................................. 3 ¿Cómo diferenciar la turbidimetría y la nefelometría? ............................................................................ 5 DEFINICIONES ............................................................................................................................................................... 6 Turbidimetría ............................................................................................................................................................ 6 Nefelometría .............................................................................................................................................................. 6 Elección entre turbidimetría y nefelometría ................................................................................................ 7 TURBIDIMETRÍA ........................................................................................................................................................... 8 Dispersión de la radiación por partículas en disolución ......................................................................... 8 Turbidimetría fundamento .................................................................................................................................. 8 Turbidímetros ........................................................................................................................................................... 9 NEFELOMETRÍA ......................................................................................................................................................... 10 Procedimiento analítico .......................................................................................................................................... 11 Relación matemática ........................................................................................................................................... 12 Nefelómetro ............................................................................................................................................................ 13 TURBIDIMETRÍA VS NEFELOMETRÍA .............................................................................................................. 14 Tamaño de las partículas dispersantes........................................................................................................ 14 Selección de la longitud de onda..................................................................................................................... 14 Preparación de la muestra ................................................................................................................................ 14 APLICACIÓN ................................................................................................................................................................. 15 Imunoprecipitación.............................................................................................................................................. 15 Inmunodifusión radial ........................................................................................................................................ 15 Inmunodifusión doble o técnica de Ouchterlony..................................................................................... 16 CONCLUSIÓN ............................................................................................................................................................... 17 REFERENCIAS ............................................................................................................................................................. 17

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INTRODUCCIÓN
Los métodos ópticos de análisis cubren un amplio campo de aplicaciones debido a su rapidez, a la gran gama de instrumentación disponible y sus grandes posibilidades de automatización. Los métodos no espectroscópicos son aquellos en los que no hay intercambio de energía, sino cambios en la dirección o en las propiedades físicas de la radiación electromagnética La dispersión de radiación es un fenómeno fisicoquímico al incidir una radiación sobre una superficie sólida, líquida o gaseosa y ser dispersa en diferentes direcciones debido a la difracción y reflexión de la radiación por las distribución y orientación de las moléculas sobre las cual inside la radiación. Cuando un haz de luz choca con una partícula en suspensión parte de la luz se dispersa, parte de la luz se refleja y parte de la luz se absorbe. La dispersión de la luz depende de: la longitud de onda de la luz, del tamaño de la partícula y del índice de refracción de la partícula en relación con el medio que la rodea.

La dispersión de la luz se puede medir por turbidimetría o por nefelometría.

La turbidimetría mide la disminución de la luz transmitida a través de una suspensión de partículas utilizando para ello un espectrofotómetro (detector en la misma dirección del haz de luz, se mide A o T). Se suele utilizar para soluciones concentradas (para que haya una buena disminución de la luz transmitida) ejemplo:

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Determinación de proteínas totales en suero, LCR u orina (haciendo que las proteínas precipiten con TCA o ácido sulfosalicílico).

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La nefelometría: mide la luz dispersada en dirección distinta a la luz emitida (generalmente con ángulos que oscilan entre 15 y 90°). Utiliza como instrumento el nefelómetro en el que el detector se ubica con un ángulo que oscila entre 15 y 90° ejemplo:

-

A 90°). Se suele utilizar para concentraciones más diluidas.

La turbidimetría y la nefelometría tienen una gran variedad de aplicaciones y permite trabajar con muestras gaseosas, liquidas e incluso con sólidos transparentes. La formación de precipitados difíciles de filtrar, como por ejemplo los gelatinosos o los de tamaño de partícula muy pequeño, suelen proporciona suspensiones ideales para la aplicación de técnicas basadas en la dispersión de la luz que sustituye a las técnicas gravimétricas. Este tipo de aplicaciones son frecuentes en laboratorios analíticos, laboratorios clínicos y en plantas de procesos. Uno de los principales campos de aplicación reside en estudios de polución de aire y agua, donde

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las dos técnicas se usan para determinar la transparencia y controlar el tratamiento de aguas potables, efluentes de plantas de tratamiento de aguas y otros tipos de aguas ambientales. Las medidas de dispersión de la luz se utilizan también para determinar la concentración de humos, polvo, niebla, aerosoles, etc. A pesar de que los términos turbidimetría y nefelometría suelen restringirse a aquellas aplicaciones en las que se mide la concentración de partículas en suspensión existen también otros tipos de aplicaciones basados en las medidas de dispersión de la luz. Entre ellas podemos citar la determinación de la forma y tamaño de las partículas así como la de los pesos, moleculares (especialmente en el caso de polímeros).

¿Cómo diferenciar la turbidimetría y la nefelometría? Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensión de partículas sólidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia La turbidez es la propiedad óptica de una muestra que hace que la radiación sea dispersada y absorbida más que transmitida en línea recta a través de la muestra. La turbidez es ocasionada por la presencia de materia suspendida en un líquido. Hay dos métodos para medir la turbidez de una muestra, la turbidimetría y la nefelometría. Son dos técnicas complementarias que se utilizan para el análisis cuantitativo de disoluciones coloidales, emulsiones, humos o nieblas. La dispersión no supone la pérdida neta de potencia radiante, solo es afectada la dirección de la propagación, porque la intensidad de la radiación es la misma en cualquier ángulo. En la turbidimetría se compara la intensidad del rayo de luz que emerge con la del que llega a la disolución. En cambio, en la nefelometría la medida de la intensidad de luz se hace con un ángulo de 90º con respecto a la radiación incidente. El instrumento usado en la nefelometría, el nefelómetro se asemeja al fluorómetro. En cambio en turbidimetría se utiliza el turbidíemetro que es un fotómetro de filtro.

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DEFINICIONES
Turbidimetría Es un método en el que se mide la disminución de la potencia de la radiación transmitida debido a la dispersión. Se mide en un espectofotómetro UV/Vis. Para determinar la concentración del analito mediante este método aplicamos:

En donde T es la transmitancia medida transmitida, relación entre

, es la intensidad de la fuente de radiación

es la intensidad de la radiación de la fuente transmitida por un blanco. La y la concentración de las partículas dispersas es similar a la proporcionada

por la ley de Beer:

Siendo volumen;

la concentración de las partículas dispersantes expresada como masa por unidad de es la longitud del camino óptico y es una constante que depende de varios

factores: tamaño, forma de las partículas dispersantes y la longitud de onda.

Nefelometría Es un método para medir la intensidad de una radiación dispersa en un ángulo de 90 °C con respecto a la fuente. Se mide en un espectrofluorímetro. Para determinar la concentración de analito en este método aplicamos:

Donde

es una constante empírica del sistema,

es la intensidad de la fuente de radiación

incidente. El valor de

depende de una curva de calibración preparada, usando una serie de

patrones de concentración conocida.

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Elección entre turbidimetría y nefelometría La elección entre turbidimetría y nefelometría viene dada por dos factores: Intensidad de la radiación transmitida o dispersada con la intensidad de la radiación procedente de la fuente. Cuando la concentración de partículas dispersantes en la disolución es pequeña, será muy similar a . Por lo que la mejor elección cuando la muestra contiene pocas partículas dispersantes es la nefelometría. La turbidimetría es una buena técnica para cuando las muestras contienen grandes concentraciones de partículas dispersantes. Tamaño de las partículas dispersantes. En la nefelometría la intensidad de la radiación dispersada a 90°C es mayor si las partículas son bastante pequeñas para que se produzca una dispersión Rayleigh. Si las partículas son mayores la intensidad de la dispersión disminuirá a 90°C. En turbidimetría la señal consiste en la disminución relativa de la radiación transmitida, por lo que el tamaño de las partículas dispersantes es menos importante. Generalmente, nefelometría y turbidimetría se utilizan en el análisis de la calidad química del agua para determinar la claridad y para el control de los procesos de tratamiento. También se utilizan para la determinación de iones sulfato.

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TURBIDIMETRÍA
Dispersión de la radiación por partículas en disolución. Cuando un haz de luz monocromática, de longitud de onda no absorbible choca contra las partículas de una sustancia que está en suspensión, cambia la dirección de propagación del haz de luz (en realidad sólo cambian de dirección algunos fotones del haz). Este efecto es usado para determinar la presencia de un analito en suspensión ya que ese cambio de dirección del haz y de su intensidad depende de muchos factores que una vez relacionados y cuantificados permiten obtener los valores buscados. Cuando un haz de radiación monocromática de una longitud de onda determinada —λ“, es enfocada sobre un medio que contiene partículas de dimensiones menores a 3/2 —λ“, se observa dispersión de radiación en todas las direcciones del espacio. Si la partícula presenta mayores tamaños, la radiación puede ser reflejada o refractada. Existen dos tipos de dispersión: 1. Elástica: radiación es absorbida por el analito y reemitida sin cambios en la energía de la radiación. Es el caso de la dispersión Raileigh o las dispersiones de grandes partículas. 2. Inelástica: la radiación es absorbida y reemitida con cambios en su energía.

Turbidimetría fundamento La turbidimetría puede realizarse en espectrofotómetros de visible o violeta. Cuando la concentración de partículas en suspensión se mide por turbidimetría, la suspensión se pone en una cubeta similar a un tubo de ensayo, que permite realizar las medidas de las energía incidentes y transmitidas. La fuente de radiación más frecuentemente usadas es la lámpara de wolframio, pero pueden utilizarse otras fuentes de radiación visible. Si ponemos en la cubeta suspensiones coloreadas se debe usar un filtro para evitar que influya sobre los resultados dando valores excesivamente altos. Los Turbidímetros pueden incorporar cualquier detector que sea sensible a la longitud de onda transmitida.

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Existe una relación matemática determinada experimentalmente:

Donde: P: es la energía de la radiación transmitida. P´: es la energía de la radiación incidente. b: espesor de la cubeta. C: concentración de partículas disertantes por unidad de volumen. f : constante que depende del tamaño partícula y longitud de onda.

Si aplicamos logaritmos, el término – logaritmo se le denomina como deducido de la expresión anterior, y tomando

, es lo que se conoce como turbidez. Si a ese ; entonces, como una constante, tenemos que:

, sabiendo que T= It/Io=P/P`

Turbidímetros Casi todas las medidas turbidimetricas se realizan con colorímetros o espectrofotómetros ordinarios. También pueden usarse instrumentos visuales sencillos, tales como el trubidímetro Parr o el colorímetro Duboscq. La presente imagen representa el esquema de un trubidímetro, el Du Pont Modelo 430. Este turbidímetro, que es mucho más sensible que los Turbidímetros ordinarios para concentraciones bajas de materia en suspensión, se basa en el hecho de que la dispersión provoca un cambio en el plano de polarización de la luz.

Diagrama esquemático de un trubidímetro Du Pont modelo 430.

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El haz incidente se convierte en luz polarizada en un plano mediante el polarizador primario. Después de atravesar la muestra el haz se divide en dos, mediante un espejo semi-plateado, y se detecta con dos fototubos separados. Cuando la disolución de la muestra no tiene partículas en suspensión, la fotocélula 1 da una respuesta máxima y la fotocélula 2 da una respuesta mínima nula. La relación entre la señal 2 y la señal 1 es una media de la concentración de las partículas en suspensión. Al aumentar la concentración de las partículas en suspensión en la muestra, aumenta la señal de la fotocélula 2 y disminuye la de la fotocélula 1 y por esto la razón de las dos señales permite una medida sensible de la turbidez. Este sistema de doble haz minimiza el problema debido a la absorción por las partículas de la disolución pero tiene el inconveniente de que no puede usarse cuando la disolución contiene sustancias ópticamente activas. Este instrumento puede usarse tanto para muestras individuales como para control en continuo de corrientes de fluidos.

NEFELOMETRÍA
Se basa en la detección de los complejos Ag-Ab, por la refracción que dichos complejos producen sobre rayos de luz que se hacen pasar por el tubo con el antígeno y el anticuerpo correspondiente. Habitualmente se utilizan rayos láser y se establece una relación entre la cantidad de luz que llega y la cantidad de complejos formados. La nefelometría es un procedimiento analítico que se basa en la dispersión de la radiación que atraviesan las partículas de materia. Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensión de partículas sólidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia. La dispersión no supone la pérdida neta de potencia radiante, solo es afectada la dirección de la propagación, porque la intensidad de la radiación es la misma en cualquier ángulo. La intensidad depende de: el número de partículas suspendidas, su tamaño, su forma, los índices refractivos de la partícula y del medio dispersante, y la longitud de onda de la radiación dispersada. La relación entre variables y es más factible un tratamiento teórico, pero debido a su complejidad raras veces se aplica a problemas analíticos específicos.

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El procedimiento generalmente es empírico y sólo se consideran 3 factores: 1. La concentración: Mayor sea el número de partículas, mayor es la dispersión. 2. Tamaño de la partícula: Factores como el pH, la velocidad y orden de la mezcla, concentración de los reactivos, duración del estado de reposo y la fuerza iónica. 3. Longitud de onda: Generalmente las muestras se iluminan con luz blanca, pero si están coloreadas, se debe escoger una porción del espectro electromagnético en la que la absorción del medio se reduzca al mínimo. En las muestras se agregan agentes tensoactivos (como gelatina), para prevenir la coagulación del coloide. Sólo se obtienen datos confiables si se controlan escrupulosamente las variables que afectan el tamaño de partículas.

Procedimiento analítico Se basa en la dispersión de la radiación que atraviesan las partículas de materia. Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensión de partículas sólidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia. La dispersión no supone la pérdida neta de potencia radiante, solo es afectada la dirección de la propagación, porque la intensidad de la radiación es la misma en cualquier ángulo. La intensidad depende de: el número de partículas sus pendidas, su tamaño, su forma, los índices refractivos de la partícula y del medio dispersante, y la longitud de onda de la radiación dispersada. Cuando la concentración de una suspensión de partícula es baja es preferible medirla por este método. En este caso la suspensión se coloca en una cubeta colocada como se muestra en la figura siguiente.

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Fuente

Filtro

Cubeta

Detecto r

El instrumento permite la medida de la intensidad de la dispersión S, la cual está relacionada con la concentración. Las fuentes de radiación que se utilizan son de láser helio-neón, lámparas de halógenos y lámparas de xenón, siendo el más frecuente el primero.

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Este consiste en un tubo largo y estrecho en el cual se introduce una mezcla de gas formada por 7 partes de helio y 1 parte de neón al que se le aplica un voltaje para producir una descarga eléctrica. Relación matemática La relación matemática entre la intensidad de dispersión, S y la concentración de partículas suspendidas es raramente utilizada es suficiente con saber que existe una relación lineal entre ellas a bajas concentraciones. Sin embargo la relación matemática que cumplen es

Donde: C: es la concentración en% : es la radiación dispersada : es la radicación de la fuente incidente : es una constante | Fuente C Cu S Tf C: filtro Cu: cubeta (v. superior) Cr: colector de radiaciones negro Tf: tubo fotomultiplicador El valor del ángulo oscila entre 30 y 70, su valor depende de la aplicación específica seleccionada. P Ángulo Cr

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Nefelómetro Un nefelómetro es un instrumento para medir partículas suspendidas en un líquido. Esto lo hace empleando una fotocelda colocada en un ángulo de 90° con respecto a una fuente luminosa. La densidad de partículas es entonces una función de la luz reflejada por las partículas a la fotocelda. Cuanta más luz se refleje en una determinada densidad de partículas depende de las propiedades de las partículas como su forma, color y reflectividad. Estableciendo a una correlación de trabajo entre turbidez y sólidos suspendidos (que más útil, pero generalmente una más difícil de cuantificación de partículas) debe ser establecido independientemente para cada situación. A los nefelómetros usados en las pruebas de calidad del agua, comúnmente se les llaman turbidímetros. Sin embargo, pueden haber diferencias entre los modelos de turbidímetros, dependiendo del arreglo geométrico de la fuente luminosa con respecto a la fotocelda. Un turbímetro nefelométrico siempre monitorea la luz reflejada por las partículas y no la atenuación debida a la turbidez.

Nefelómetro C-102 Este nefelómetro realiza un análisis de agua casi completo: cloro libre y total, bromo, pH, hierro, yodo y ácido cianúrico. En el modo de medición de turbiedad puede elegir entre los valores de calibración dados o los valores definidos por el usuario. Por medio del reloj de tiempo real integrado puede recuperar presionando la tecla los últimos datos de calibración. En el rango de medición de turbiedad se puede poner un punto de calibración libre entre 0,0 y 50,0 NTU (NTU Nephelometric Turbidity Unit = FTU Formazin Turbidity Unit / Ratio 1:1). La turbiedad se mide con el método USEPA.

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TURBIDIMETRÍA VS NEFELOMETRÍA
Tamaño de las partículas dispersantes Para nefelometría, la intensidad de la radicación dispersada a 90° será mayor cuanto menos sea el tamaño de las partículas. Para partículas mayores, la intensidad de la dispersión a 90° disminuye. Cuando se usa una fuente de radicación de UV/VIS, el tamaño de partícula optimo para nefelometría es de 0.1 a 1 µm. para turbidimetría, fenómeno menos dependiente de la λ, en cambio el tamaño de las partículas es menos importante; en este caso la señal es la disminución relativa de la radiación trasmitida. De hecho, las medidas turbidimetricas son aun posibles cuando el tamaño de las partículas dispersantes producen un aumento de la reflexión y refracción (aunque la relación lineal entre la señal y la concentración de las partículas dispersantes no puede mantenerse mucho más).

Selección de la longitud de onda Con esta selección se minimiza las posibles interferencias 1. Turbidimetria: como se mide la radiación trasmitida a través de la muestra, es necesario evitar la absorción de la radiación por la muestra. 2. Nefelometría: la absorción de la radiación incidente no es un problema excepto su induce fluorescencia en la muestra. Sin una muestra fluorescente no hay necesidad de selección de λ, y puede usarse una fuente de luz blanca.

Preparación de la muestra La intensidad de la radiación dispersada está influenciada por la forma y tamaño de las partículas. Para un análisis cuantitativo es necesario, por lo tanto mantener la distribución de las partículas uniformemente en la muestra y los patrones. La mayoría de los métodos de turbidimetría y nefelometría depende de la formación de partículas por precipitación.

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APLICACIÓN
Imunoprecipitación La imunoprecipitación cuantificada por turbidimetría o nefelometría se emplea hoy en ls laboratorios de autoinmunidad para determinar el factor reumátide. Tanto en los reactivos como en el suero pueden existir partículas que produzcan una dispersión de luz no deseada ej. lipoproteínas, quilomicrones También puede interferir la suciedad. · La intensidad de la luz dispersada. Las proteínas suelen tener un pico de absorción en el ultravioleta y los cromógenos del suero entre 400-425nm; por todo ello se suele trabajar a frecuencias que oscilen entre 320-380nm y 500-600nm. Muy frecuentemente, para cuantificar proteínas concretas, se utilizan anticuerpos que reaccionan con dichas proteínas de la muestra, en este caso se habla de inmunoturbidimetría e inmunonefelometría. Cuando se ponen en contacto un Ag y un Ac específico contra ese antígeno ambos reaccionan y forman un complejo Ag-Ac. Inicialmente los complejos se forman rápidamente pero, existe una segunda fase de crecimiento de complejos más lenta y, es precisamente en ésta fase en la que aparece la dispersión de la luz. Así, en la inmunoturbidimetría e inmunonefelometría se mide la dispersión de la luz provocada por los complejos Ag-Ac. En ocasiones los Ac se unen a bolitas de látex para aumentar el tamaño de los complejos (inmuno-análisis potenciados). La inmunoprecipitacion, se utilizan partículas de látex recubiertas con IgG. Existen muchos equipos comerciales para como analizadores automáticos de bioquímica o nefelómetros automáticos, y sus métodos están estandarizados con calibradores que se basan en preparaciones de referencia.

Inmunodifusión radial En este caso se añade un antisuero específico a la agarosa que, a su vez, se vierte sobre placas. Se forman pozos en el gel y se colocan en ellos estándares de proteínas y problemas (antígenos). El antígeno difunde en el gel durante varias horas y va reaccionando con el Ac. En la zona de equivalencia se produce un anillo de precipitación

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Inmunodifusión doble o técnica de Ouchterlony Se forman pozos en el gel de agarosa, generalmente en patrón de roseta. Sedepositan antisueros específicos en los pozos centrales y los estándares de proteínas y los problemas en los pozos circundantes. Al difundir las muestras en el gel, donde el anticuerpo y el antígeno alcanzan la equivalencia, se forman bandas de precipitados insolubles. La posición y forma de la banda se determinan según la concentración del antígeno y del anticuerpo, y sus tamaños. La distancia de las bandas con respecto al anticuerpo es directamente proporcional a la cantidad de antígeno presente. Determinación de proteínas en orina y de anticuerpos en suero

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CONCLUSIÓN
Los métodos ópticos de análisis cubren un amplio campo de aplicaciones dentro de las Técnicas basadas en la dispersión de radiación tenemos la turbidimetría y la nefelometría. Las cueles nos regularmente utilizadas en control de calidad, pero gracias al avances de diversas maquinarias, nos es posible poder aplicar estos métodos de análisis dentro de otras ramas científicas, ya sean salud o investigación. Estas dos técnicas están basadas generalmente en la formación de un precipitado, del cual se parte para el análisis. Ambas técnicas permiten la descripción y análisis óptico una muestra. Y el uso de estas técnicas de investigación depende de las necesidades del investigador. Las diferencias entre las dos técnicas son especificas y permiten le análisis desde dos campo de la óptica muy importante dentro de los laboratorios. La turbidimetría y la nefelometría se acoplan para un mejor enfoque del análisis.

REFERENCIAS
      L. Hernández, C. González, Introducción al Análisis Instrumental. Editorial: Ariel Ciencia (2002) R. Matissek, F.M. Schnepel, G. Steiner, Análisis de los Alimentos. Editorial Acribia. S.A McPherson RA, Pincus MR, eds. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 21st ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier; 2006. http://webs2002.uab.es/ipividori/qca%20analii/T7.pdf Florkin, M. y Stotz, E., Comprehensive Bichemistry, Vol 3, Methods for the Study of Molecules, Amsterdam, Elservier, 1963. Van Holde, K. E., Physical Biochemistry, Englewood Cilffs; N. J., Preentice Hall, 1971.

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