LABORATORIO DE ANALISIS QUÍMICO

Taller: Validación de método de análisis

químico
Se toma como caso de estudio el método colorimétrico de determinación de
Cromo hexavalente del Standard Methods for the Examination of Water and
Wastewater. Edición 23 2017, el cual se considera como un método interno
del laboratorio el cual debe ser validado para su uso.

DISCUSIÓN GENERAL DEL MÉTODO. PRINCIPIO

Este procedimiento mide sólo cromo hexavalente, Cr (VI). Para la determinación de cromo
total, digiera con ácido la muestra (consulte la Sección 3030) y siga con una técnica de
análisis instrumental adecuada. El cromo hexavalente se determina colorimétricamente por
reacción con difenilcarbazida en solución ácida. Se produce un complejo de color rojo
violeta de composición desconocida. La reacción es muy sensible, la absortividad molar
basada en el cromo es de aproximadamente 40 000 L g- 1 cm-1 a 530 o 540 nm. NOTA: Los
datos de validación para 3500-Cr.B se desarrollaron a 540 nm.

TALLER DE VALIDACIÓN
1) Proponer un título para el método. Para ello considerar:
● Analito o mensurando.

● Tipo de matriz.

● En presencia de interferencias (si fuera necesario).

● Metodología, equipamiento, principio.

2) Según las características del método ¿qué alcance debería tener la validación?
¿Es un método interno, o sea desarrollado en el laboratorio?
Verificación – validación parcial – validación completa
3) Si se tratara de un método interno, es decir desarrollado en el laboratorio ¿cuáles
parámetros se deberían validar?
4) Establecer las condiciones por cumplir, es decir los criterios de aceptación (% de
recuperación, r2, %RSD, etc).
5) Realizar un análisis de los datos que se brindan a continuación, para la evaluación
de cada parámetro. Comparar los parámetros estadísticos obtenidos con las
condiciones establecidas previamente y toma de decisión sobre la validez del
procedimiento para el propósito establecido.
6) Elaborar el informe de validación completo. Para ello considerar:

● Carátula

● Fechas: inicio- finalización

● Analito/matriz
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● Técnica empleada

● Objetivo (de la validación)

● Alcance (del método: matriz, rango, interferencias, etc.)

● Referencias (normas, procedimientos, guías, etc)

● Participantes y responsabilidades en la validación “responsables”

● Lista de materiales y equipos (reactivos, materiales de referencias, muestras control,

etc., equipamiento e instrumentos)
● Condiciones ambientales

● Procedimiento de Ensayo

● Parámetros de validación a evaluar y criterios de aceptación

● Análisis de datos y Resultados obtenidos

● Estimación de incertidumbre

● Conclusión

● Anexos, registros, etc.

CONSIDERACIONES

● La Ley Provincial 11220 establece como límite de cromo total para la provisión de
agua potable (mgCr/L) obligatorio 0,05.
● El Código Alimentario Argentino establece para agua potable el nivel máximo máx.:
0,05 mg/L; y para agua mineral discrimina como contaminante al Cr (VI) con un nivel
máximo de 0,05 mg/L.
● Para linealidad el coeficiente de determinación r 2 los siguientes organismos establecen
como satisfactorio:

· USEPA r2 > 0,995

· FDA r2 > 0,999

● Resultados aceptables según la AOAC:

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DESARROLLO DE LOS PARÁMETROS PARA LA VALIDACIÓN

1) Selectividad
Se preparó una solución de agua destilada fortificada con Cr(VI) para una concentración
final de 0.15 mg/L de Cr(VI).
Teniendo en cuenta las interferencias del método, se tomaron porciones independientes de
esta solución que se enriquecieron a niveles de Fe que podrían encontrarse en agua para

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consumo para evaluar si en estas concentraciones de hierro el método es específico para

cromo hexavalente. No se evaluó la selectividad con respecto al molibdeno y al mercurio,
dado que estos metales generan interferencias a concentraciones muy por encima de las que
podríamos encontrar en aguas de consumo y superficiales.

(mg/L) Fe
M1 0
M2 50
M3 100
M4 200
M5 500

Al analizar las muestras los resultados de Cr(VI) fueron:

Cr (VI) (mg/L)
M1 0,152 0,149 0,146
M2 0,157 0,151 0,153
M3 0,151 0,149 0,143
M4 0,149 0,152 0,148
M5 0,146 0,143 0,149

2) Límite de detección y límite de cuantificación

Se realizaron 10 medidas de réplicas independientes de una muestra blanco (es decir que no
contiene cantidades detectables de Cr(VI)).

Los resultados fueron:

Réplicas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Cr(VI)
0,008 0,011 0,008 0,012 0,007 0,005 0,015 0,003 0,011 0,012
(mg/L)

3) Intervalo de trabajo y linealidad

El extremo inferior del intervalo está determinado por el límite de cuantificación. Se

midieron un blanco y 9 patrones de calibración, preparados por triplicado cada uno a
concentraciones espaciadas uniformemente.

réplica 1 réplica 2 réplica 3

Conc (mg/L)
Absorbancia
0,00 0,001 0,005 -0,002

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0,05 0,026 0,022 0,021

0,10 0,043 0,044 0,038
0,20 0,086 0,079 0,083
0,30 0,126 0,121 0,122
0,40 0,159 0,162 0,163
0,50 0,198 0,201 0,204
0,60 0,233 0,236 0,241
0,70 0,275 0,281 0,276
0,80 0,313 0,316 0,320

4) Veracidad

La veracidad se determinó mediante un análisis de recuperación, dado que no se contaba

con un material de referencia certificado en matriz. Se enriqueció una muestra “blanco” con
Cr(VI) para una concentración final en solución de 0.250 mg/L. Se prepararon 10 réplicas
de la muestra blanco y 10 de la muestra adicionada.
Cr(VI)
Muestras sin adicionar Muestras adicionadas
(mg/L)
1 0,015 0,260
2 0,017 0,257

3 0,020 0,253

4 0,021 0,256

5 0,014 0,263

6 0,019 0,267

7 0,025 0,263

8 0,013 0,275

9 0,025 0,268

10 0,017 0,260

5) Precisión: Repetibilidad y Precisión intermedia

Se tomó una muestra de rutina para el parámetro de precisión. Dado que el laboratorio
cuenta con un solo instrumento y un único analista, para este ensayo se analizó una misma
muestra de control, preparando 4 replicas independientes, en 4 días distintos:

Medida día 1 día 2 día 3 día 4

1 0,174 0,171 0,165 0,165
2 0,164 0,181 0,159 0,156

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3 0,169 0,182 0,164 0,171

4 0,175 0,172 0,161 0,159

Se recomienda aplicar un test de anova anidado para la resolución.

6) Robustez

Para el ensayo de robustez se realizó un análisis univariado considerando las variables

susceptibles a variaciones que podrían alterar el resultado.

Variables:

• Longitud de onda: 530, 533, 535, 538 y 540 nm

• pH de muestra: 1,4 - 1,7 -2,0 - 2,3 y 2,6.
• Tiempo de reacción: 5, 7, 10, 13 y 15 min.

Se prepararon soluciones estándar de 0,40 mg/L, por triplicado en condiciones según el

estudio de cada variable.

6.1) Longitud de onda: Se prepararon 3 estándares de concentración de Cr(VI) de 0,40

mg/L en las condiciones que indica el método, realizando las mediciones a distintas
longitudes de onda.

Long de onda
Rep 1 (mg/L) Rep 2 (mg/L) Rep 3 (mg/L)
(nm)
530 0,397 0,395 0,408
533 0,400 0,405 0,403
535 0,413 0,408 0,397
538 0,405 0,410 0,415
540 0,405 0,418 0,413

6.2) pH de muestra: Se prepararon soluciones estándar a 5 niveles de pH, cada uno se

preparó por triplicado, y de concentración de Cr (VI) de 0,40 mg/L. El resto de las variables
tanto en la preparación como en la medición se mantuvieron según indica el método.

pH Rep 1 (mg/L) Rep 2 (mg/L) Rep 3 (mg/L)

2,6 0,388 0,390 0,398

2,3 0,398 0,385 0,390
2,0 0,408 0,398 0,400
1,7 0,405 0,408 0,395
1,4 0,415 0,400 0,400

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6.3) Tiempo de reacción: Se prepararon soluciones estándar dejando reaccionar a distintos

tiempos. Cada tiempo se preparó por triplicado, y la concentración de Cr (VI) de los
estándares fue 0,40 mg/L. El resto de las variables tanto en la preparación como en la
medición se mantuvieron según indica el método.

Tiempo (min) Rep 1 (mg/L) Rep 2 (mg/L) Rep 3 (mg/L)

5 0,393 0,388 0,395

7 0,385 0,398 0,390
10 0,408 0,398 0,388
12 0,398 0,408 0,395
15 0,410 0,390 0,400

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