INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Departamento de Bioquímica Laboratorio de

Métodos de Análisis

“DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR

EL MÉTODO DE ÁCIDO BICINCONÍNICO
(BCA) Y BRADFORD”

un método
Alumno: HERNANDEZ VILCHIS KENIA PAMELA

Grupo 4IM2 Sección: III

Docente de práctica:

HERNÁNDEZ LÓPEZ FRANCISCO CARMELO

Fechas:

Realizado: 2 y 4 de Marzo 2020

Entrega: 11 de Marzo de 2020

Departamento de
Bioquímica, ENCB - Santo Tomas

IPN, Ciudad de México, México.

FUNDAMENTO

Las técnicas colorimétricas se basan en la medida de la absorción de radiación en

la zona visible por sustancias coloreadas. En principio todos los sistemas que
cuantifican el color a partir de tres variables poseen aspectos colorimétricos:
Luminancia, Longitud y Pureza

Las técnicas colorimétricas suministran información cualitativa y cuantitativa sobre

sustancias en disolución. El colorímetro es un instrumento diseñado para dirigir un
haz de luz paralela monocromática a través de una muestra líquida y medir la
intensidad del haz luminoso emergente.

Determinación de proteínas por el método de acido bicinconinico:

Es una sal sódica, capaz de formar un complejo púrpura intenso con iones Cu1+ en
medio alcalino. Este reactivo forma la base de un método analítico capaz de
monitorizar el ión cuproso producido en una reacción entre las proteínas con Cu 2+
en medio alcalino (reacción de Biuret).

Determinación de proteínas por el método de acido bicinconinico:

Se basa en la unión de un colorante, Comassie G-250 a las proteínas. El

colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y otra naranja.

Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante

con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre.
OBJETIVO

 Efectuar un método colorimétrico para cuantificación de proteínas a través

de una curva tipo, mediante dos técnicas: Acido bicinconinico (BCA) y
Bradford.
 Establecer el grado de exactitud y precisión entre los dos métodos: BCA y
Bradford realizados mediante pruebas estadísticas.
 Analizar las posibles sustancias no proteicas que actúan como
interferencias en los dos métodos.
 Comprender importancia espectrofotométrica en los métodos
colorimétricos.

RESULTADOS Y CÁLCULOS

RESULTADOS DE METODO DE BCA

CURVA DE CALIBRACIÓN BCA

Tabla 1. Curva de calibración de hemoglobina realizada por el método de BCA.

Volumen de Concentración de Absorbancia

No. De tubo solución estándar albúmina (µg/ml) 562 nm
de albúmina (µl) Serie a Serie b
1 100 2 0.043 0.055
2 200 4 0.095 0.134
3 300 6 0.158 0.173
4 400 8 0.246 0.271
5 500 10 0.262 0.279
Gráfica 1. Curva tipo de hemoglobina. Método del BCA.

Curva tipo de hemoglobina.

0.35
y = 0.0293x + 0.0069
0.3 R² = 0.9548
Absorbanicia 562nm

0.25

0.2 y = 0.0295x - 0.0159 Series1

R² = 0.9714
0.15 Series2

0.1 Lineal (Series2)

Lineal (Series2)
0.05

0
0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0
[Proteina] (µg/mL)
Calculo de la concentración de hemoglobina presente en cada uno de los tubos, a
partir de una solución de proteína de 20 µg/mL:

Ejemplo para Tubo 3:

Calculo para obtener concentración de albúmina en tubo 3:

Utilizando la fórmula de

Donde:

C1= Concentración de solución de proteína (20 µg/ml)

V1= Volumen tomado de la solución para el tubo 3(300 µl= 0.3 ml)

V2= Volumen total que tiene el tubo (1000 µl= 1ml)

Despejando y sustituyendo los valores para obtener la concentración de

hemoglobina en el tubo 3(C2):

ANÁLISIS ESTADÍSTICO (BCA)

Se toma el tubo 3 de referencia debido a que es un punto intermedio donde es

más seguro que se cumple la ley de Bouger y Beer.

Tabla 2. Replicas para análisis estadístico en la determinación de hemoglobina por el método BCA.

No. De tubo Absorbancia 562 nm Concentración (µg/ ml)

1 0.212 7.725423729
2 0.212 7.725423729
3 0.193 7.081355932
4 0.177 6.538983051
5 0.192 7.047457627
6 0.193 7.081355932
7 0.170 6.301694915
8 0.170 6.301694915
9 0.197 7.216949153
10 0.198 7.250847458
 Tabla 3. Resultados del análisis estadístico para el método de BCA.

S s2 %CV IC de μ

7.0271 0.4856 0.2359 6.9108 0.3473

Calculo de Coeficiente de Variación (%CV) e intervalo de confianza (IC de μ).

El valor de t es obtenido a partir de tablas, usando NC= 95% y 9 grados de libertad.

(6.6800-7.3741)

Debido a que el coeficiente correlación de la serie a fue 0.97 que es el más

cercano a 0.99,esta fue la serie que se tomó ya que es la que presenta una mejor
relación de concentración con respecto a la absorbancia.

Calculo para la concentración de hemoglobina en cada una de las réplicas:

Usando la ecuación de la recta con coeficiente de correlación más cercano a 0.99

de la grafica 1:

y = 0.0295x - 0.0159
R² = 0.9714

Despejamos la concentración que está dada por la variable X, obteniendo:

Ejemplo para tubo 5 dando como resultado de A=0.192:

 Calculo de Exactitud:

100 -

100 –

Calculo de precisión.

100 - %CV= 100 –6.9108= 93.0892

ANÁLISIS DE SUSTANCIAS NO PROTEICAS EN EL MÉTODO DE BCA

Tabla 4. Datos obtenidos para el análisis de posibles interferencias en determinación de

albúmina por el método de BCA.

No. De Sustancia no proteica Absorbancia Concentración Tipo de interferencia

tubo a 562 nm de hemoglobina
µg/ mL
1 Fenol 0.2% 1.298 43.461017 Positiva
2 Detergente comercial 0.2% 0.219 7.9627119 Positiva

3 SDS 0.2% 0.199 7.2847458 No es interferencia

4 Mercaptoetanol 1% 1.881 64.301695 Positiva
5 EDTA 30 mM 0.106 4.1322034 Negativa

Para obtener la Concentración de hemoglobina µg/mL en cada uno de los tubos se

utilizó nuevamente la ecuación de la recta obtenida a partir de la curva de
calibración.

Despejando y sustituyendo la absorbancia obtenida para cada interferencia, se

tiene una concentración diferente en cada tubo.

Ejemplo para tubo 3 (SDS 0.2%):

Para conocer que tipo de interferencia se presenta se hace uso del intervalo de
confianza para μ. (Calculo presente anteriormente)

Se obtuvo un dando un significado analítico a esto, se

refiere que dentro de los valores de 6.6800-7.3741 µg/ mL de hemoglobina, no se
considera como una interferencia. Mientras que, valores inferiores serán
considerados interferencias negativas y valores superiores, se consideran
interferencias positivas.

RESULTADOS DE METODO DE BRADFORD

CURVA DE CALIBRACIÓN (METODO DE BRADFORD)

Tabla 5. Curva de calibración de hemoglobina realizada por el método de Bradford.

Volumen de Concentración de Absorbancia

No. De tubo solución estándar hemoglobina 595 nm
de hemoglobina (µg/ml) Serie a Serie b
(µl)
1 100 2 -0.012 0.122
2 200 4 0.21 0.21
3 300 6 0.314 0.265
4 400 8 0.172 0.333
5 500 10 0.382 0.398

Gráfica 2. Curva tipo de hemoglobina. Método del Bradford.

Curva tipo de hemoglobina. Método del Bradford.

0.45
0.4 y = 0.0338x + 0.0631
R² = 0.9951
0.35
0.3
y = 0.0375x - 0.0118
0.25 Series1
R² = 0.6176
A595

0.2 Series2
0.15 Lineal (Series1)
0.1 Lineal (Series2)
0.05
0
0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0
-0.05
Concentración (µg/mL)
Calculo de la concentración de hemoglobina presente en cada uno de los tubos, a
partir de una solución de proteína de 20 µg/mL:

Ejemplo para Tubo 2:

Calculo para obtener concentración de albúmina en tubo 2:

Utilizando la fórmula de

Donde:

C1= Concentración de solución de proteína (20 µg/ml)

V1= Volumen tomado de la solución para el tubo 2(200 µl= 0.2 ml)

V2= Volumen total que tiene el tubo (1000 µl= 1ml)

Despejando y sustituyendo los valores para obtener la concentración de

hemoglobina en el tubo 2(C2):

ANÁLISIS ESTADÍSTICO (BRADFORD)

Se toma el tubo 3 de referencia debido a que es un punto intermedio donde es

más seguro que se cumple la ley de Bouger y Beer.

Tabla 6. Replicas para análisis estadístico en la determinación de hemoglobina por el método Bradford.

No. De tubo Absorbancia 595 nm Concentración (µg/ ml)

1 0.198 3.99112426
2 0.247 5.440828402
3 0.259 5.795857988
4 0.267 6.032544379
5 0.292 6.772189349
6 0.262 5.884615385
7 0.262 5.884615385
8 0.280 6.417159763
9 0.279 6.387573964
10 0.286 6.594674556
 Tabla 7. Resultados del análisis estadístico para el método de BCA.

S s2 %CV IC de μ

5.9201 0.7501 0.5628 12.6720 0.5366

Calculo de Coeficiente de Variación (%CV) e intervalo de confianza (IC de μ).

El valor de t es obtenido a partir de tablas, usando NC= 95% y 9 grados de libertad.

(6.4866-7.5587)

Debido a que el coeficiente correlación de la serie B fue 0.9951, fue la serie que se
tomó ya que es la que presenta una mejor relación de concentración con respecto
a la absorbancia.

Calculo para la concentración de hemoglobina en cada una de las réplicas:

Usando la ecuación de la recta con coeficiente de correlación igual a 0.9951 de la

grafica 1:

y = 0.0338x + 0.0631
R² = 0.9951
Despejamos la concentración que está dada por la variable X, obteniendo:

Ejemplo para tubo 7 dando como resultado de A=0.262:

 Calculo de Exactitud:

100 -

100 –

Calculo de precisión.

100 - %CV= 100 –12.6720= 87.328

ANÁLISIS DE SUSTANCIAS NO PROTEICAS EN EL MÉTODO DE

BRADFORD.

Tabla 8. Datos obtenidos para el análisis de posibles interferencias en determinación de

hemoglobina por el método de Bradford.

No. De Sustancia no proteica Absorbancia Concentración Tipo de interferencia

tubo a 595 nm de hemoglobina
µg/ mL
1 Fenol 0.2% 0.268 6.0621302 No es interferencia
2 Detergente comercial 0.2% Negativa
0.154 2.6893491
3 SDS 0.2% 0.092 0.8550296 Negativa
4 Mercaptoetanol 1% 0.24 5.2337278 Negativa
5 EDTA 6 mM 0.233 5.0266272 Negativa

Para obtener la Concentración de hemoglobina µg/mL en cada uno de los tubos se

utilizó nuevamente la ecuación de la recta obtenida a partir de la curva de
calibración.

Despejando y sustituyendo la absorbancia obtenida para cada interferencia, se

tiene una concentración diferente en cada tubo.

Ejemplo para tubo 5 (EDTA 6mM):

Para conocer que tipo de interferencia se presenta se hace uso del intervalo de
confianza para μ. (Calculo mostrado anteriormente)

Se obtuvo un dando un significado analítico a esto, se

refiere que dentro de los valores de 6.4866-7.5587µg/ mL de hemoglobina, no se
considera como una interferencia. Mientras que, valores inferiores serán
considerados interferencias negativas y valores superiores, se consideran
interferencias positivas.

COMPARACION ESTADISTICA DE LOS DOS METODOS (BCA VS

BRADFORD)

Prueba de T student para datos pareados diferencias en términos de la

exactitud (por medio de medias aritméticas)

Tabla 9. Comparación estadística para determinar diferencias significantes en exactitud entre

BCA y Bradford

Bradford BCA ǀ Brad - BCAǀ

Réplica
(µg/mL) (µg/mL)
(Di)

1 3.9911 7.7254 3.73 6.7860

2 5.4408 7.7254 2.28 1.3340

3 5.7958 7.0813 1.28 0.0240

4 6.0325 6.5389 0.50 0.3906

5 6.7721 7.0474 0.27 0.7310

6 5.8846 7.0813 1.19 0.0042

7 5.8846 6.3016 0.41 0.5112

8 6.4171 6.3016 0.11 1.0302

9 6.3875 7.2169 0.83 0.0870

10 6.5946 7.2508 0.65 0.2256

11.25 11.1238
Para el cálculo de t calculada se utilizaron datos obtenidos a partir de la tabla 9. La
cual muestra los valores de concentración de hemoglobina obtenidos en el análisis
estadístico con el método de BCA y Bradford.

1. Planteamiento de la hipótesis:

Ho: BCA= Bradford

Ha: BCA Bradford

2. Criterio de rechazo:

Ho se rechaza si: t calculada t crítica ó t calculada -t critica

3. Cálculo de valor de t critica, a partir de lo siguiente:

 Nivel de confianza (NC) es de 95%

 Grados de libertad (gl) (calculados como) n-1= 10-1=9
(Donde n representa el numero de replicas)

Utilizando una tabla (distribución de t) localizando el Nivel de Confianza y grado

de libertad, establecidos se tiene:

t critica= 2.262

4. Cálculo de t calculada

t calculada = Di*

Calculo de SD

t calculada =

t calculada= 3.2021

5. Conclusión. Analizando la t calculada y la t critica, se tiene que:

3.2021 2.262

Esto significa que t calculada es mayor que el valor de t critica; por lo tanto, se rechaza
la hipótesis nula. Esto implica que el método de BCA y Bradford presentan
diferencias significativas en exactitud.
Prueba de F fisher en términos de la precisión (por medio de varianza)

1. Planteamiento de la hipótesis:
Ho: S2 BCA= S2 Bradford

Ha: S2 BCA S2 Bradford

2. Criterio de rechazo:
Ho se rechaza si F calculada F critica
3. Cálculo de valor de F critica a partir de la siguiente información:
NC= 95%
Para el cálculo de grado de libertad, se considera la formula para Fcalculada,
debido a que el valor tiene que ser mayor a 1.

S2 a es, en este caso, la varianza obtenida por el método de Bradford (Tabla 6)

con valor de 0.7501
S2 b será la varianza del método de BCA (Tabla 3), con un valor de 0.4856.
A partir de esta información los grados de libertad se obtienen considerando el
número de datos menos 1 en el numerador y en el denominador. En este caso
será de 9.
Con base en tablas del valor de F con un nivel de confianza del 95%, se tiene:
F critica= 4.026
4. Cálculo de F calculada:

F calculada= 2.3863
5. Conclusión.
Analizando los valores obtenidos de F calculada y F critica:

2.3863 ≤4.026

Esto significa que la Fcalculada es menor que la Fcritica, lo cual indica que la
hipótesis nula se acepta. Por consiguiente, se puede concluir la precisión del
método de BCA y el método de Bradford son estadísticamente iguales.
DISCUSIÓN
CURVA DE CALIBRACIÓN

Primero se realizó una curva de calibración. Para el método de BCA (véase tabla
1), se observa que tanto la serie a como la b, presentan el mismo comportamiento
en absorbancia, se asemejan muchos sus resultados, sin embargo no es el
mismo, a pesar de tener presente la misma concentración de proteína
(hemoglobina). Debido a esto, se tomó en cuenta el coeficiente de correlación, el
cual nos permite confirmar la linealidad (basado en el cumplimiento de la ley de
Bouger-Beer) en base a esto se obtuvo que para la serie (b) el coeficiente de
correlación fue de 0.9548 mientras que para la serie (a) el resultado fue de 0.9714,
de esta manera, se tomó la serie (a) porque su coeficiente de correlación se
acercaba mas a 0.99 siendo este el que debía obtenerse, con el coeficiente de
correlación de la serie (a) la concentración de la proteína esta en tu intervalo de 2
a 10µg/mL. (De manera bibliográfica la ley de Bouger y Beer para el método de
BCA se cumple en un rango de concentración de la proteína de 0.5-10 µg/mL) La
causa por la que no se pudo obtener un coeficiente de correlación lo más cercano
a 0.99 principalmente se debe al analista, pues durante el desarrollo experimental
se usan micropipetas, las cuales pueden presentar burbujas, residuos de solución
en la punta, entre otros, este tipo de errores son los sistemáticos donde conozco la
causa y puedo evitarlos.

Por otro lado, en la curva de calibración de Bradford (véase tabla 5) en la serie (a)
como primera lectura de absorbancia donde se encuentra 2µg/ml de hemoglobina
se obtuvo un valor negativo, lo cual podría asumirse que se trata del blanco, sin
embargo, al obtener un valor de coeficiente de correlación de 0.67 se descarta y
se toma la serie b donde se obtuvo un r=0.9954. Lo que nos indica la linealidad de
la recta y se asimila que se cumple la ley de Bouger y Beer en un intervalo de
concentraciones de proteína de 2 a 10µg/mL. Donde bibliográficamente está se
cumple en un rango de concentración de 1-15 µg/mL, por lo tanto las
concentraciones que se trabajaron, están dentro del rango de linealidad.

Las concentraciones de la proteína provocan desviaciones reales, (desviaciones a

la ley de Bouger y Beer), sin embargo como se trabajo con concentraciones dentro
del intervalo bibliográfico, se dice con más certeza que los errores en las lecturas
de absorbancia se dieron por errores sistemáticos pertenecientes al analista.

De la ecuación de la recta de la curva de calibración se tomó la pendiente para

poder evaluar la sensibilidad del método, la cual se toma como una capacidad de
respuesta representa la variación de las lecturas de absorbancia detectadas por el
espectrofotómetro al variar la concentración del analito. Al evaluar la pendiente de
ambos métodos: BCA=0.0295 y Bradford=0.0338 se concluye que el método con
mejor sensibilidad es el de Bradford, debido a que ocurre una relación entre los
dos métodos, si la pendiente es mayor es porque pequeños cambios en la
concentración de hemoglobina me genera grandes cambios en la absorbancia,
mientras que si la pendiente es menor ocurre debido a grandes cambios en la
concentración me generan pequeños cambios en la absorbancia. En este caso
Bradford al presentar la mayor pendiente es más sensible.

ANALISIS ESTADÍSTICO.

Se realizó un análisis estadístico tomando de referencia el tubo 3, la cual tiene una

concentración de hemoglobina de 6µg/mL como referencia. Se obtuvieron distintos
parámetros los cuales sirven para calcular exactitud y precisión de ambos
métodos. Para el método de BCA se obtuvo una exactitud=96.1285 mientras que
en precisión fue de 93.0892. La precisión es determinada con el %CV, obteniendo
6.9108% y bibliográficamente un CV > 20% se considera poco preciso.

Para el método de Bradford el cual nos basamos de igual manera en el tubo 3,

donde es mas seguro que se cumpla la ley de Bouger y Beer, se tiene una
concentración de referencia de 6µg/mL, obteniendo como resultado en un intervalo
de 5 a 6µg/mL mayormente. Obteniendo una exactitud=98.6683 y una
precisión=87.327.

Comparando ambos métodos, se obtuvo mejor exactitud en el método de Bradford

pero mejor precisión en el método de BCA. Estos cambios de exactitud y precisión
se relacionan con el analista, si hablamos de exactitud, se refiere al analista que
realizó la curva de calibración, mientras que si se trata de la precisión se atribuye
al analista que realizó el análisis estadístico.

Posteriormente se realizaron pruebas estadísticas partiendo de alguna hipótesis.

Los resultados obtenidos para la prueba de t-student, nos basamos n el parámetro
de la media el cual nos va a indicar si el grado de exactitud entre ambos métodos
es igual o presenta diferencias significativas, en este caso si se presentó
diferencias significativas en la exactitud de ambos métodos.

Otra prueba estadística que igual partió de una hipótesis fue la F-fisher la cual se
basa en medir las diferencias en términos de la precisión de los métodos mediante
el parámetro de desviaciones o varianzas. Obteniendo que no había diferencias
significativas y que los dos métodos presentan misma exactitud.

EFECTO DE SUSTANCIAS NO PROTEICAS

En las interferencias presentes de sustancias no proteicas para el método de BCA

(Tabla 4).
El fenol 0.2%, se presentó como una interferencia positiva debido a que es un
agente reductor e interfiere con el ión cuproso en la formación del complejo
colorido y de igual forma en la coloración.

El Mercaptoetanol 1%, se encontró como una interferencia positiva sin embargo

bibliográficamente se encontró que esta sustancia comienza a ser interferencia en
una concentración 1Mm. Sin embargo sucede lo mismo que con el fenol, interfiere
en la formación del complejo colorido.

El SDS 0.2% se obtiene que no es interferencia ya que la concentración de

hemoglobina estuvo dentro del intervalo de confianza, bibliográficamente esta
sustancia se considera interferencia a partir de una concentración de 5%. Sin
embargo este tiene afinidad por las proteínas y si su concentración fuera mas alta,
provocaría la desnaturalización de estás.

El EDTA 30mM observa que es una interferencia negativa, se observa que de las
5 sustancias es la que presenta menor lectura de absorbancia debido a que está
actuando como un agente quelante donde atrapa los iones Cu, los cuales se
hacen presentes en la formación del complejo colorido, por lo tanto, al ser
atrapados evitan la interacción con el cromógeno y la proteína y desfavorecen la
formación del complejo colorido.

Para el Detergente comercial 0.2%, se obtuvo una interferencia positiva, sin

embargo no se encuentra muy lejos del intervalo de confianza designado, esto es
debido a que en su composición química se encuentra EDTA, sin embargo es a
cantidades relativamente bajas por lo que no debería presentar interferencia, en
este caso se tendría que considerar el intervalo de confianza, mediante el análisis
estadístico.

Para el método de Bradford, las sustancias que fueron clasificadas como

interferencias basándonos en el intervalo de confianza y en la concentración de
estas. (Vease tabla 8).

El fenol 0.2% se obtiene que no es una interferencia, de esta manera se observa

que el intervalo de confianza del análisis estadístico esta correcto, pues el fenol
comienza a ser una interferencia a partir de una concentración de 5%.

Posteriormente las otras sustancias no proteicas como Detergente comercial

0.2%, EDTA 30Mm y SDS 0.2%, se presentaron como interferencias negativas,
debido al comportamiento alcalino que presentan.

Por otro lado el método de Bradford no se ve afectado bibliográficamente por el

Mercaptoetanol 0.002% sin embargo el resultado fue interferencia negativa lo cual
podrías deberse a un error en nuestro análisis estadístico que acompaña al nivel
de confianza.

Una comparación general entre estos dos métodos para el análisis de la

hemoglobina, es que el método de BCA se usan reactivos los cuales son más
estables, conforme al tiempo, es un método más sensible y es más tolerante a
sustancias no proteicas, sin embargo se trata de un método caro. Por otro lado el
método de Bradford es más sencillo, mas barato, y más rápido, sin embargo no
presenta tan buena sensibilidad como el de BCA, pero soporta más a sustancias
proteicas

CONCLUSIONES
 En el método de BCA se obtuvo un coeficiente de correlación de 0.9714,
por lo que no presenta una buena linealidad, mientras que en el método de
Bradford el coeficiente de correlación obtenido fue de 0.9954, concluyendo
que si presenta linealidad.
 En la comparación de ambos métodos por pruebas estadísticas, se obtuvo
que tanto BCA como Bradford presentan diferencias significativas en la
exactitud, mientras que la precisión de ambos métodos es
estadísticamente igual.
 El método de Bradford es más sensible en comparación con el de BCA
debido a la pendiente.
 Los métodos difieren en las sustancias no proteicas que afectan a cada uno
de ellos.

BIBLIOGRAFÍAS
 Lemus J. M. y Cortez A. L. (2015). “Bioquímica general: Fundamentos y
análisis de laboratorio”. Universidad Técnica de Machala. Ecuador. pp 34-
35.
 Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H.,
Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J., and Klenk,
D. C. (1985). Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analyt.
Biochem. 150, 76–85
 (Valores de concentración de proteínas para el método de BCA que entran
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 P.K.Smith, R.I.Krohn, G.T.Hermanson y cols. 1985. Measurement of protein
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Primero se realizó una curva de calibración. Para el método de BCA (véase tabla 1), se observa que tanto la serie a como la b,
presentan el mismo comportamiento en absorbancia, se asemejan muchos sus resultados, sin embargo no es el mismo, a
pesar de tener presente la misma concentración de proteína (hemoglobina). Debido a esto, se tomó en cuenta el coeficiente
de correlación, el cual nos permite confirmar la linealidad (basado en el cumplimiento de la ley de Bouger-Beer) en base a
esto se obtuvo que para la serie (b) el coeficiente de correlación fue de 0.9548 mientras que para la serie (a) el resultado fue
de 0.9714, de esta manera, se tomó la serie (a) porque su coeficiente de correlación se acercaba mas a 0.99 siendo este el que
debía obtenerse, con el coeficiente de correlación de la serie (a) la concentración de la proteína esta en tu intervalo de 2 a
10µg/mL. (De manera bibliográfica la ley de Bouger y Beer para el método de BCA se cumple en un rango de concentración de
la proteína de 0.5-10 µg/mL) La causa por la que no se pudo obtener un coeficiente de correlación lo más cercano a 0.99
principalmente se debe al analista, pues durante el desarrollo experimental se usan micropipetas, las cuales pueden
presentar burbujas, residuos de solución en la punta, entre otros, este tipo de errores son los sistemáticos donde conozco la
causa y puedo evitarlos. Por otro lado, en la curva de calibración de Bradford (véase tabla 5) en la serie (a) como primera
lectura de absorbancia donde se encuentra 2µg/ml de hemoglobina se obtuvo un valor negativo, lo cual podría asumirse que
se trata del blanco, sin embargo, al obtener un valor de coeficiente de correlación de 0.67 se descarta y se toma la serie b
donde se obtuvo un r=0.9954. Lo que nos indica la linealidad de la recta y se asimila que se cumple la ley de Bouger y Beer en
un intervalo de concentraciones de proteína de 2 a 10µg/mL. Donde bibliográficamente está se cumple en un rango de
concentración de 1-15 µg/mL, por lo tanto las concentraciones que se trabajaron, están dentro del rango de linealidad. Las
concentraciones de la proteína provocan desviaciones reales, (desviaciones a la ley de Bouger y Beer), sin embargo como se
trabajo con concentraciones dentro del intervalo bibliográfico, se dice con más certeza que los errores en las lecturas de
absorbancia se dieron por errores sistemáticos pertenecientes al analista. De la ecuación de la recta de la curva de
calibración se tomó la pendiente para poder evaluar la sensibilidad del método, la cual se toma como una capacidad de
respuesta representa la variación de las lecturas de absorbancia detectadas por el espectrofotómetro al variar la
concentración del analito. Al evaluar la pendiente de ambos métodos: BCA=0.0295 y Bradford=0.0338 se concluye que el
método con mejor sensibilidad es el de Bradford, debido a que ocurre una relación entre los dos métodos, si la pendiente es
mayor es porque pequeños cambios en la concentración de hemoglobina me genera grandes cambios en la absorbancia,
mientras que si la pendiente es menor ocurre debido a grandes cambios en la concentración me generan pequeños cambios
en la absorbancia. En este caso Bradford al presentar la mayor pendiente es más sensible. ANALISIS ESTADÍSTICO. Se realizó
un análisis estadístico tomando de referencia el tubo 3, la cual tiene una concentración de hemoglobina de 6µg/mL como
referencia. Se obtuvieron distintos parámetros los cuales sirven para calcular exactitud y precisión de ambos métodos. Para
el método de BCA se obtuvo una exactitud=96.1285 mientras que en precisión fue de 93.0892. La precisión es determinada
con el %CV, obteniendo 6.9108% y bibliográficamente un CV > 20% se considera poco preciso. Para el método de Bradford el
cual nos basamos de igual manera en el tubo 3, donde es mas seguro que se cumpla la ley de Bouger y Beer, se tiene una
concentración de referencia de 6µg/mL, obteniendo como resultado en un intervalo de 5 a 6µg/mL mayormente. Obteniendo
una exactitud=98.6683 y una precisión=87.327. Comparando ambos métodos, se obtuvo mejor exactitud en el método de
Bradford pero mejor precisión en el método de BCA. Estos cambios de exactitud y precisión se relacionan con el analista, si
hablamos de exactitud, se refiere al analista que realizó la curva de calibración, mientras que si se trata de la precisión se
atribuye al analista que realizó el análisis estadístico. Posteriormente se realizaron pruebas estadísticas partiendo de alguna
hipótesis. Los resultados obtenidos para la prueba de t-student, nos basamos n el parámetro de la media el cual nos va a
indicar si el grado de exactitud entre ambos métodos es igual o presenta diferencias significativas, en este caso si se presentó
indicar si el grado de exactitud entre ambos métodos es igual o presenta diferencias significativas, en este caso si se presentó
diferencias significativas en la exactitud de ambos métodos. Otra prueba estadística que igual partió de una hipótesis fue la F-
fisher la cual se basa en medir las diferencias en términos de la precisión de los métodos mediante el parámetro de
desviaciones o varianzas. Obteniendo que no había diferencias significativas y que los dos métodos presentan misma
exactitud.

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Realizar un seguimiento de los cambios en Word - Word 20% se considera poco preciso. Para el método de
Bradford el cual nos basamos de igual manera en el tubo 3, donde es mas seguro que se cumpla la ley de
Bouger y Beer, se tiene una concentración de referencia de 6µg/mL, obteniendo como resultado en un
intervalo de 5 a 6µg/mL mayormente. Obteniendo una exactitud=98.6683 y una precisión=87.327.
Comparando ambos métodos, se obtuvo mejor exactitud en el método de Bradford pero mejor precisión
en el método de BCA. Estos cambios de exactitud y precisión se relacionan con el analista, si hablamos de
exactitud, se refiere al analista que realizó la curva de calibración, mientras que si se trata de la precisión
se atribuye al analista que realizó el análisis estadístico. Posteriormente se realizaron pruebas estadísticas
partiendo de alguna hipótesis. Los resultados obtenidos para la prueba de t-student, nos basamos n el
parámetro de la media el cual nos va a indicar si el grado de exactitud entre ambos métodos es igual o
presenta diferencias significativas, en este caso si se presentó diferencias significativas en la exactitud de 5%
ambos métodos. Otra prueba estadística que igual partió de una hipótesis fue la F-fisher la cual se basa en
medir las diferencias en términos de la precisión de los métodos mediante el parámetro de desviaciones o
varianzas. Obteniendo que no había diferencias significativas y que los dos métodos presentan misma
exactitud. ">Compare text
nota: si la característica control de cambios no está disponible, es posible que deba desactivar la protección
del documento.sin embargo, desactivar la característica no quita los cambios realizados de los que ya se ha
hecho un seguimiento.
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EFECTO DE SUSTANCIAS NO PROTEICAS En las interferencias presentes de sustancias no proteicas para el método de BCA
(Tabla 4). El fenol 0.2%, se presentó como una interferencia positiva debido a que es un agente reductor e interfiere con el ión
cuproso en la formación del complejo colorido y de igual forma en la coloración. El Mercaptoetanol 1%, se encontró como
una interferencia positiva sin embargo bibliográficamente se encontró que esta sustancia comienza a ser interferencia en una
concentración 1Mm. Sin embargo sucede lo mismo que con el fenol, interfiere en la formación del complejo colorido. El SDS
0.2% se obtiene que no es interferencia ya que la concentración de hemoglobina estuvo dentro del intervalo de confianza,
bibliográficamente esta sustancia se considera interferencia a partir de una concentración de 5%. Sin embargo este tiene
afinidad por las proteínas y si su concentración fuera mas alta, provocaría la desnaturalización de estás. El EDTA 30mM
observa que es una interferencia negativa, este valor bibliográficamente se encuentra correcto, pues para que pueda ser
presentado como una interferencia se necesita una concentración de 10mM. Se observa que de las 5 sustancias es la que
presenta menor lectura de absorbancia debido a que está actuando como un agente quelante donde atrapa los iones Cu, los
cuales se hacen presentes en la formación del complejo colorido, por lo tanto, al ser atrapados evitan la interacción con el
cromógeno y la proteína y desfavorecen la formación del complejo colorido. Para el Detergente comercial 0.2%, se obtuvo
una interferencia positiva, sin embargo no se encuentra muy lejos del intervalo de confianza designado, esto es debido a que
en su composición química se encuentra EDTA, sin embargo es a cantidades relativamente bajas por lo que no debería
presentar interferencia, en este caso se tendría que considerar el intervalo de confianza, mediante el análisis estadístico. Para
el método de Bradford, las sustancias que fueron clasificadas como interferencias basándonos en el intervalo de confianza y
en la concentración de estas. (Vease tabla 8). El fenol 0.2% se obtiene que no es una interferencia, de esta manera se observa
que el intervalo de confianza del análisis estadístico esta correcto, pues el fenol comienza a ser una interferencia a partir de
una concentración de 5%. Posteriormente las otras sustancias no proteicas como Detergente comercial 0.2%, EDTA 30Mm y
SDS 0.2%, se presentaron como interferencias negativas, debido al comportamiento alcalino que presentan. Por otro lado el
método de Bradford no se ve afectado bibliográficamente por el Mercaptoetanol 0.002% sin embargo el resultado fue
interferencia negativa lo cual podrías deberse a un error en nuestro análisis estadístico que acompaña al nivel de confianza.
Una comparación general entre estos dos métodos para el análisis de la hemoglobina, es que el método de BCA se usan
reactivos los cuales son más estables, conforme al tiempo, es un método más sensible y es más tolerante a sustancias no
proteicas, sin embargo se trata de un método caro. Por otro lado el método de Bradford es más sencillo, mas barato, y más
rápido, sin embargo no presenta tan buena sensibilidad como el de BCA, pero soporta más a sustancias proteicas

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