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1. Se infectaron dos cultivos idénticos de E. coli, uno con virus marcados con 32P y otro con
virus marcados con 35S.
2. Se obtuvieron los virus marcados radiactivamente solo en las bacterias infectadas con el virus
marcado con 32P. De hecho, el marcado 35S no penetró en las células huésped.
El experimento de Chase y Hershey demostró claramente que es el ADN del virus el que entra en la
célula huésped y lleva la información genética para la producción de nuevos virus.
En un cristal, las partículas están dispuestas en un patrón regular y repetitivo, lo que hace que la
difracción ocurra de manera regular.
➔ Se coloca un detector de rayos X cerca de la muestra para recoger los rayos dispersos.
➔ La muestra puede rotarse en tres dimensiones diferentes para investigar el patrón de
dispersión.
➔ Los patrones de difracción se pueden registrar utilizando películas de rayos X.
El ADN no puede cristalizarse, pero en 1950 Maurice Wilkins desarrolló un método para producir
conjuntos de moléculas de ADN lo suficientemente ordenadas como para obtener un patrón de
difracción en lugar de una dispersión aleatoria.
A partir de este patrón de difracción, Franklin pudo realizar una serie de deducciones sobre la
estructura del ADN:
➔ La cruz en el centro del patrón indicaba que la molécula tenía una forma helicoidal.
➔ El ángulo de la cruz mostraba el paso (inclinación del ángulo) de la hélice.
➔ La distancia entre las barras horizontales mostraba que los giros de la hélice estaban
separados por 3.4 nm.
El extremo 3' en el ADN tiene una desoxirribosa a la que podría unirse el fosfato de otro nucleótido.
El fosfato se uniría con el grupo OH en el C3 de la desoxirribosa. El extremo 5' en el ADN tiene un
fosfato que está unido al C5 de la desoxirribosa.
Durante la replicación, los nucleótidos se unen al extremo de una cadena de ADN mediante uno de
un grupo de enzimas llamadas polimerasas de ADN. Estas enzimas siempre añaden el fosfato de un
nucleótido libre a la desoxirribosa en el extremo 3' de la cadena. Por lo tanto, la dirección de la
replicación es de 5' a 3'.
Las dos hebras en una molécula de ADN son antiparalelas porque corren en direcciones opuestas.
Cada extremo de una doble hélice de ADN tiene una hebra con un extremo 3' y otra con un extremo
5'.
Debido a la estructura antiparalela del ADN, las dos hebras deben replicarse de diferentes maneras.
➔ En una hebra, las polimerasas de ADN pueden moverse en la misma dirección que el trabajo
de replicación, por lo que la replicación es continua → cadena líder.
➔ En la otra hebra, las polimerasas de ADN deben moverse en dirección opuesta al trabajo de
replicación, por lo que la replicación es discontinua → cadena retrasada.
2. La helicasa desenrolla la doble hélice del ADN y la divide en dos hebras de plantilla. Las
proteínas de unión de cadena simple mantienen las hebras separadas el tiempo suficiente
para permitir que la hebra de plantilla sea copiada.
3. La ADN polimerasa III agrega nucleótidos en dirección 5' a 3'. En la hebra líder, se mueve en
la misma.
4. La primasa agrega una longitud corta de ARN unido por apareamiento de bases a la hebra de
plantilla de ADN. Esto actúa como un iniciador, permitiendo que la ADN polimerasa se una y
comience la replicación.
5. La ADN polimerasa III inicia la replicación junto al iniciador de ARN y agrega nucleótidos en
dirección 5' a 3'. Por lo tanto, se aleja de la horquilla de replicación en la hebra rezagada.
6. Se forman fragmentos cortos de ADN entre los iniciadores de ARN en la hebra rezagada,
llamados fragmentos de Okazaki.
7. La ADN polimerasa I elimina el iniciador de ARN y lo reemplaza con ADN. Se deja una
abertura en el esqueleto de azúcar-fosfato de la molécula donde dos nucleótidos aún no
están conectados.
SECUENCIA DE SANGER
Frederick Sanger desarrolló un método de secuenciación de bases que Está basado en nucleótidos de
ácido desoxirribonucleico didesoxi (ddADN). Estos contienen dideoxiribosa en lugar de
desoxirribosa, por lo que no tienen un grupo OH en el átomo de carbono 3.
Si un didesoxinucleótido se encuentra al final de una cadena de ADN, no hay un sitio al cual otro
nucleótido pueda ser añadido mediante un enlace de 5' a 3'.
En la máquina de secuenciación, se mezclan copias de una sola cadena del ADN que se está
secuenciando con ADN polimerasa y nucleótidos normales de ADN, además de un menor número de
nucleótidos de ddADN. La replicación se repite cuatro veces, una vez con dideoxinucleótidos para
cada base, A, C, G y T.
Los fragmentos de ADN replicados que se producen varían en longitud dependiendo de qué tan lejos
llegó la replicación antes de que se terminara debido a la adición de un nucleótido de ddADN al final
de la cadena.
Los fragmentos se separan según su longitud mediante electroforesis en gel con cuatro carriles, uno
para cada base en el nucleótido de ddADN que terminó la replicación. Cada banda en el gel
representa una longitud de fragmento de ADN producido por la replicación. Todos los fragmentos de
la misma longitud terminan en la misma base, por lo que hay una banda en solo uno de los cuatro
carriles para cada longitud de fragmento. Esto permite deducir fácilmente la secuencia de bases del
ADN a partir del gel.
Regulación de la expresión génica: algunas secuencias de bases son sitios donde las proteínas
pueden unirse para promover o reprimir la transcripción de un gen adyacente.
Intrones: en muchos genes eucariotas, la secuencia codificante se interrumpe por una o más
secuencias no codificantes llamadas intrones. Estos intrones son eliminados del ARNm antes de su
traducción. Los intrones tienen numerosas funciones asociadas con el procesamiento del ARNm.
Telómeros: son secuencias repetitivas de bases en los extremos de los cromosomas. Cuando se
replica el ADN de un cromosoma eucariota, el extremo de la molécula no puede replicarse
completamente, por lo que se pierde una pequeña sección de la secuencia de bases. La presencia del
telómero evita que se pierdan partes importantes de genes en los extremos de los cromosomas cada
vez que se replica el ADN.
Genes para tRNA y rRNA: la transcripción de estos genes produce el ARN de transferencia utilizado
durante la traducción y también el ARN ribosomal que forma gran parte de la estructura del
ribosoma.
BIOINFORMÁTICA
Las secuencias de bases son el principal tipo de datos almacenados y analizados en bioinformática. Al
principio, la secuenciación solo era posible con fragmentos cortos de ADN, como genes individuales,
pero ahora se pueden secuenciar genomas completos y la cantidad de datos generados está
creciendo de manera exponencial.
Uno de los principales tipos de análisis en bioinformática es la localización de genes que codifican
polipéptidos dentro de los genomas. Esto se realiza utilizando computadoras para buscar ORFs
(marcos de lectura abierta).
REPETICIONES EN TÁNDEM
Dentro de los genomas de humanos y otras especies, existen regiones donde secciones adyacentes
de ADN tienen la misma secuencia de bases. Estas se llaman repeticiones en tándem. La longitud de
la secuencia repetida puede ser desde dos bases hasta 60 o más.
El número de repeticiones varía entre diferentes individuos con algunas repeticiones en tándem =
repeticiones en tándem de número variable. El perfil de ADN (huella dactilar) se basa en
repeticiones en tándem de número variable.
NUCLEOSOMAS
El ADN en eucariotas se asocia con proteínas para formar nucleosomas. Estas son estructuras
globulares que tienen un núcleo de ocho proteínas de histonas con ADN enrollado alrededor.
1. Proteína de histona llamada H1 une el ADN al núcleo
2. Una corta sección de ADN conector conecta un nucleosoma con el siguiente.
Las ocho histonas en el núcleo tienen colas N-terminales que se extienden hacia afuera desde el
nucleosoma. Durante la condensación de los cromosomas en las primeras etapas de la mitosis y la
meiosis, las colas de histonas en nucleosomas adyacentes se conectan y tiran de los nucleosomas
juntos. Esto es parte del proceso de superenrollamiento.
Durante la interfase, los cambios en los nucleosomas permiten que los cromosomas se
descondensen. Las colas N-terminales se modifican de manera reversible al agregar grupos acetilo o
metilo. Esto evita que los nucleosomas adyacentes se empaqueten juntos.
➔ La proteína de histona H1 se elimina, por lo que la unión del ADN al núcleo del nucleosoma
se afloja.
➔ El ADN entonces se asemeja a una cadena de cuentas.
➔ Donde ocurren estos cambios, permiten el acceso al ADN por enzimas polimerasas que
llevan a cabo la replicación y la transcripción.
Algunas secciones de cromosomas permanecen condensadas durante la interfase y los genes en
estas secciones, por lo tanto, no se transcriben.
Por lo tanto, los nucleosomas ayudan a regular la transcripción en eucariotas, al controlar qué
secciones de los cromosomas están condensadas o descondensadas durante la interfase.
El software de visualización molecular JMol se puede utilizar para analizar la asociación entre
proteínas y ADN dentro de los nucleosomas.
PROMOTORES Y TRANSCRIPCIÓN:
El control de la expresión génica involucra un promotor. Este es una secuencia de bases cercana al
inicio de un gen. Cada gen tiene un promotor, pero las secuencias de bases varían, lo que permite
que se transcriban genes particulares y no otros.
Las proteínas represoras pueden unirse al promotor y evitar la transcripción. En eucariotas las
proteínas llamadas factores de transcripción se unen al promotor, lo que permite que la ARN
polimerasa se una y luego inicie la transcripción. Se requieren varios factores de transcripción,
algunos de los cuales pueden necesitar ser activados por la unión de una hormona u otra señal
química.
IDENTIFICACIÓN DE POLISOMAS
Un polisoma es un grupo de ribosomas que se mueven a lo largo del mismo ARNm, traduciéndolo
simultáneamente. Solo en los procariotas puede comenzar la traducción antes de que termine la
transcripción.
Sin embargo, hay evidencia creciente de que el entorno puede desencadenar cambios heredables.
Una explicación implica pequeños marcadores químicos que se adhieren al ADN en el núcleo de una
célula para fijar el patrón de expresión génica. Estos marcadores generalmente se transmiten a las
células hijas formadas por mitosis y ayudan a establecer tejidos con patrones comunes de
diferenciación, pero se borran en su mayoría durante la formación de gametos. Sin embargo, un
pequeño porcentaje de marcadores persiste y se hereda por la descendencia.
METILACIÓN Y EPIGENÉTICA
La citosina en el ADN puede convertirse en metilcitosina mediante la adición de un grupo metilo
(-CH3). Este cambio es catalizado por una enzima y solo ocurre donde hay guanina en el lado 3' de la
citosina en la secuencia de bases.
2. Al nacer, los gemelos idénticos tienen un patrón de metilación muy similar, pero las
diferencias se acumulan durante sus vidas, presumiblemente debido a las diferencias
ambientales. Esto se refleja en la disminución de la similitud entre los gemelos idénticos a
medida que envejecen.
MODIFICACIÓN POST-TRANSCRIPCIONAL
Las células eucariotas modifican el ARNm después de la transcripción. Esto ocurre antes de que el
ARNm salga del núcleo. En muchos genes eucariotas, la secuencia codificante está interrumpida por
intrones. Estos intrones se eliminan del ARNm antes de que se traduzca.
Las partes restantes del ARNm son exones. Se empalman juntos para formar el ARNm maduro.
Algunos genes tienen muchos exones y se pueden empalmar diferentes combinaciones de ellos para
producir proteínas diferentes. Esto aumenta el número total de proteínas que un organismo puede
producir a partir de sus genes.
3.- TRADUCCIÓN
RNA DE TRANSFERENCIA
Todas las moléculas de ARN de transferencia tienen:
➔ Secciones de doble cadena con apareamiento de bases.
➔ Un tripleto de bases llamado anticodón, en un bucle de siete bases, además de otros dos
bucles.
➔ La secuencia de bases CCA en el extremo 3', que forma un sitio para la unión de un
aminoácido.
➔ Estas características permiten que todas las moléculas de ARN de transferencia se unan a
tres sitios en el ribosoma: los sitios A, P y E.
La secuencia de bases de las moléculas de ARN de transferencia varía y esto causa algunas
características variables en su estructura. Estas confieren a cada tipo de tRNA una forma
tridimensional distintiva y propiedades químicas características. Esto permite que el aminoácido
correcto se una al terminal 3' mediante una enzima llamada enzima activadora de tRNA.
Hay veinte enzimas activadoras de tRNA diferentes, una para cada uno de los veinte aminoácidos
diferentes. Cada una de estas enzimas une un aminoácido particular a todas las moléculas de tRNA
que tienen un anticodón correspondiente a ese aminoácido. Las enzimas activadoras de tRNA
reconocen estas moléculas de tRNA por su forma y propiedades químicas.
Las imágenes de las moléculas de tRNA, creadas utilizando software de visualización molecular como
JMol, pueden obtenerse del Banco de Datos de Proteínas AG y ser visualizadas con JMol.
RIBOSOMAS
Los ribosomas tienen una estructura compleja con las siguientes características:
➔ Las proteínas y las moléculas de ARN ribosómico (rRNA) forman parte de la estructura.
➔ Hay dos subunidades, una grande y otra pequeña.
➔ Hay un sitio de unión para el ARNm en la subunidad pequeña.
➔ Hay tres sitios de unión para el tRNA en la subunidad grande:
◆ Sitio A para el tRNA que transporta un aminoácido.
◆ Sitio P para el tRNA que lleva la cadena polipeptídica en crecimiento.
◆ Sitio E para el tRNA a punto de salir del ribosoma.
Imágenes mucho más precisas de la estructura del ribosoma se pueden crear utilizando software de
visualización molecular.
En el citoplasma, hay ribosomas libres que sintetizan proteínas principalmente para su uso dentro de
la célula. También hay ribosomas unidos a las membranas del retículo endoplásmico. Se les llama
ribosomas unidos y sintetizan proteínas para la secreción fuera de la célula o para su uso en los
lisosomas.
Los átomos de carbono individuales no se muestran, pero están presentes en cada punto donde las
líneas que indican los enlaces se encuentran. Los enlaces de hidrógeno pueden formarse entre los
grupos NH y C=O en un polipéptido si se acercan.
Debido a que los grupos que forman enlaces de hidrógeno están espaciados regularmente, las
hélices alfa y las láminas plegadas beta siempre tienen las mismas dimensiones. La formación de
hélices alfa y láminas plegadas beta estabilizadas por enlaces de hidrógeno es la estructura
secundaria de un polipéptido.
Los enlaces intramoleculares suelen formarse entre aminoácidos que están ampliamente separados
en la estructura primaria pero que se juntan durante el proceso de plegamiento. En las proteínas
solubles en agua, los aminoácidos no polares a menudo se encuentran en el centro, con
interacciones hidrofóbicas entre ellos. Los aminoácidos polares están en la superficie, donde se
enlazan entre sí y entran en contacto con el agua.
Se utilizan los mismos tipos de enlaces intramoleculares que en la estructura terciaria, incluyendo
enlaces iónicos, enlaces de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas y puentes disulfuro. En algunos
casos, las proteínas también contienen una estructura no polipéptida llamada grupo prostético. Por
ejemplo, cada polipéptido en la hemoglobina está unido a un grupo hemo, que no está compuesto
de aminoácidos. Las proteínas con un grupo prostético se llaman proteínas conjugadas.