R.

NAVARRO
B. MESTAS
MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUÍMICA G. SUCASACA
F. ROMERO

PRACTICA 12

FOTOSINTESIS
Es el proceso químico más importante de la biología. Incluye todos los procesos
por los que: a) la luz solar absorbida se utiliza para impulsar las biosíntesis; b) el CO2 es
reducido hasta glucosa por las plantas verdes y; c) el agua es oxidada para liberar
oxígeno. Por esta razón, el fenómeno global de la fotosíntesis se representa por la
siguiente ecuación:

G°'= +118000 cal/mol de CO2 reducido

El agua es el donador de electrones que se emplea para reducir el CO2 y el

fenómeno está acoplado al desprendimiento de oxígeno.

Este proceso se realiza en los cloroplastos, los cuales contiene los pigmentos que
absorben la luz y las enzimas necesarias. Los cloroplastos se asemejan a las
mitocondrias por poseer capas apiladas de membranas internas en las que las
transferencias de electrones se asocian con fosforilación; también tienen su propio DNA y
los sistemas para la síntesis de proteínas. Los cloroplastos elaboran glucosa y la
acumulan como almidón durante las horas de luz; las mitocondrias oxidan el piruvato
desde residuos de glucosa, especialmente durante la noche, para proporcionar energía a
la planta.

CENTROS DE REACCION. Para una eficaz absorción de la luz solar, los cloroplastos
contienen los carotenos y las clorofilas que tiene estructuras altamente resonantes. La
energía de excitación pasa desde un pigmento a otro hasta que llega a un centro de
reacción, donde los complejos de clorofila "a" se hallan asociados con otras proteínas
necesarias para la utilización de la energía. La clorofila "a" en el centro de reacción pierde
la energía de excitación y es oxidada por la transferencia de electrones hasta un aceptor.

FOTOFOSFORILACION CICLICA. En los centros de reacción tipo I los electrones

desplazados por fotooxidación son transferidos de nuevo desde sus receptores hasta la
clorofila oxidada. La transferencia se da a través de varios transportadores a la vez que
son utilizados para generar ATP. En este mecanismo, los electrones desplazados por la
luz absorbida son devueltos continuamente a la clorofila original pero la recombinación
ocurre por el aparato de fosforilación oxidativa.

PRODUCCION DE OXIGENO. Los electrones necesarios para llevar la clorofila oxidada

del PS I a su estado inicial, también pueden ser donados por el agua. Para que suceda
esto, la luz es absorbida por el PS II, en el que la clorofila oxidada después de la
eliminación de un electrón reaccionará con los iones hidroxilos del agua y liberará
oxígeno. Los electrones también se transfieren desde el PS II al PS I a través de parte del
aparato de fosforilación oxidativa, y en este caso se genera por lo menos un ATP por
cada par de electrones transferidos.

REDUCCION DE FERREDOXINA. El uso del agua como donador de electrones permite

a los electrones ser liberados del sistema para otros fines, dejando atrás el oxígeno. El
aceptor inmediato de los electrones liberados por el PS I es una sustancia reductora de
ferredoxina, la cual es reducida por la SRF y es utilizada en las plantas verdes para
reducir NADP hasta NADPH.

REDUCCION DEL DIOXIDO DE CARBONO. La glucosa se elabora a partir de CO2,

utilizando el NADPH y el ATP producidos en los procesos fotoquímicos. El CO2 es fijado

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por la combinación con ribulosa-1,5-difosfato, esta se escinde para formar dos moléculas
de 3-fosfoglicerato, las cuales se reducen con NADPH. La pentosa transportadora de CO2
se regenera por una reordenación de parte de las triosas fosfato obtenidas, y el
remanente sirve para formar glcosa-6-fosfato que será utilizada como combustible. La
secuencia completa constituye el Ciclo de Calvin, en el que el ATP se utiliza para
regenerar ribulosa difosfato y para formar 1,3-difosfoglicerato el que se reducirá a triosa
fosfato por el NADPH.

El funcionamiento del Ciclo de Calvin depende de la isomerización y epimerización

de las pentosas fosfato, a través de una reacción de transcetolasa en la que dos unidades
de carbono son transferidas vía tiamina pirofosfato desde un donador cetosa hasta un
donador aldosa.

RUTA DE HATCH-SLACK. Los cloroplastos están construidos de tal forma que la

velocidad del Ciclo de Calvin varía con la concentración de CO2 atmosférico. Una planta
que disminuye su pérdida de agua cerrando los estomas de las hojas, restringe también
el suministro de CO2, excepto algunas plantas evolucionadas que sobreviven en
condiciones secas y calurosas, y utilizan el ATP para concentrar el CO2. La ruta de Hatch-
Slack comprende la carboxilación de piruvato hasta oxalcetato a expensas de ATP en un
anillo externo de las células mesófílicas, seguido de la reducción hasta malato por NADH.
El malato se difunde en el interior de un anillo de células de la vaina, donde es
descarboxilado oxidativamente por NADP para formar piruvato y una elevada
concentración de CO2 para el ciclo de Calvin.

ALTERACION DE LA ATMOSFERA. La fotosíntesis es responsable de la oxido-

reducción, representada por la acumulación de compuestos de carbonos reducidos en los
sedimentos a expensas de carbonatos, y de la acumulación de oxígeno en la atmósfera a
expensas del agua. las alteraciones en el equilibrio de CO2 y O2 actualmente se
autocompensan, siendo el sistema tan masivo que las alteraciones catastróficas debidas
a la interferencia del hombre no son si no perturbaciones sencillas en la estequiometría
del sistema.

PARTE EXPERIMENTAL

EXPERIMENTO 1. AISLAMIENTO DE CLOROPLASTOS.

Los cloroplastos enteros y los cloroplastos desintegrados se preparan macerando

hojas u otro material vegetal en agua o solución hipertónica, los desechos celulares
groseros se remueven por filtración y los otros constituyentes protoplasmáticos por
centrifugación diferencial los procedimientos que se describen se basan en que los
cloroplastos intactos se obtienen utilizando solución hipertónica de sacarosa, en cambio
el uso de agua u otra solución hipotónica acompañada de trituración vigorosa provocan la
ruptura de los cloroplastos obteniéndose así los fragmentos de cloroplastos.

Los métodos descritos son satisfactorios para preparar suspensiones de

cloroplastos a partir de hojas de espinaca, tabaco y algunas otras especies y también a
partir de algunas algas.

Instrucciones Generales
Todas las operaciones se deben realizar a 0°C o a temperaturas cercanas a 0°C
(4°C). Se debe lavar varias veces las hojas recientemente colectadas o almacenadas en
el frío. Se les deja escurrir y se les coloca en una bolsa plástica en un cuarto frío durante
unas horas hasta que las hojas se hinchen. Luego se remueven los peciolos y las
levaduras y se secan las hojas entre papel filtro. Si se utilizan algas, estas deben ser
lavadas por filtración o centrifugación. Examine las suspensiones de cloroplastos bajo el
microscopio (400 a 1000x) antes de usarlas.

Material
Centrífuga

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Homogenizador de
cuchillas Tejido de nylon o
gasa Tubos de ensayo
Fiolas Sacarosa 0.5 M
Solución buffer fosfato de potasio (solución 0.1 M de KH2PO4 en sacarosa ajustada a pH
6.5)
Medio de sucrosa (solución de EDTA en solución buffer fosfato 10 mM, ajustada a pH 6.5)

Método de Trabajo
Ver el video https://www.youtube.com/watch?v=wK4DNZM4H9Q

En un mortero homogenice 10 g. de hojas de espinaca bien lavadas con 10 ml. de medio

de sucrosa. Filtrar el homogenizado verde a través de una doble capa de tejido de nylon o
gasa para remover las paredes celulares y fibras. Centrifugar el filtrado a 200 xg por 5 min,
para remover las partículas extrañas y las células intactas. Desechar el precipitado.

El sobrenadante se centrifuga a 600 xg por 12 min para sedimentar los cloroplastos.

Descartar el sobrenadante. El precipitado se resuspende con 20 ml de sucrosa 0.5 M fría
y se centrifuga de nuevo a 600 xg durante 12 min. Descartar el sobrenadante. El
sedimento así obtenido constituye los cloroplastos. Resuspenda los cloroplastos en 20 ml
de sucrosa u otro medio hipertónico (medio de reacción helado) agitándolo suavemente
con una varilla de vidrio y almacenándolo sobre hielo hasta cuando lo utilice (Figura 1).

Figura 1. Extracción de Cloroplastos. Fotos cortesía de Kevín Cervantes

Tuero

EXPERIMENTO 2. REACCION DE HILL

La síntesis de carbohidratos a partir de CO2 y agua se da en dos etapas, reacción

luminosa y reacción oscura. La reacción luminosa que se demuestra en este experimento
se efectúa solo en presencia de luz visible, que es absorbida por la clorofila de los
cloroplastos. Los electrones de la clorofila son llevados a niveles más altos de energía y
retornan al estado inicial por una serie de reacciones semejantes a las de la cadena
respiratoria mitocondrial. Durante este proceso de transporte de electrones se produce
ATP. Al mismo tiempo se producen equivalentes reductores en forma de NADPH2 y se
libera O2.

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La fotólisis del agua o "Reacción de Hill" se define como una reacción de oxido-
reducción dependiente de luz, catalizada por cloroplastos, fragmentos de cloroplastos, o
en algunos casos, células vegetales intactas, en la que el agua es el donador de hidrógeno,
se produce oxígeno, y alguna otra sustancia. El CO2 (reactivo oxidante de Hill es el
aceptor de hidrógenos. La reacción lleva el nombre de Robert Hill, quien fue el primero en
observar la reducción del oxalato férrico por cloroplastos iluminados (aislados). La
reacción de Hill se puede estudiar: a) siguiendo la evolución del oxígeno, b) por el cambio
de la concentración del ion hidrógeno, c) por el cambio del potencial de oxido-reducción; y
d) por la reducción de un oxidante.

En este experimento usamos el 2,6-diclorofenolindofenol como un aceptor artificial

de hidrógenos. La reducción del colorante no se efectúa en la oscuridad. Tampoco se
aprecia reducción cuando se usa cloroplastos hervidos.

La lenta oxidación espontánea del 2,6-diclorofenolindofenol permite usar una

cubeta abierta (de 1 cm. de trayectoria de luz y de 5 a 10 ml de capacidad), como un vaso
de reacción o un tubo de ensayo. Sobre la cubeta se enfoca un rayo de luz que proviene
de un foco de 100 watt. La cubeta de reacción, a su vez está sumergida e un baño de
agua a temperatura constante.

Material
Fotocolorímetr
o Tubos de
ensayo
Cubetas de
vidrio Focos de
100 watt
Mezcla de reacción (buffer fosfato de potasio 0.02 M pH 6.5, que contiene KCl 0.05%)
2,6-diclorofenolindofenol 0.1 M
Acido Ascórbico
Preparación de cloroplastos: diluya los cloroplastos enteros o fragmentados con la
mezcla de reacción hasta obtener una concentración de clorofila de
aproximadamente 5 mg/ml.

Método de Trabajo
Ver el siguiente video https://www.youtube.com/watch?v=JBQANaPMGao

Mezcle 1.0 ml de suspensión verdosa de cloroplastos con 4.0 ml de la solución de

2,6-diclorofenolidofenol. Prepare cuatro tubos de la misma forma. Coloque el primer tubo
en la oscuridad durante el experimento. Al segundo tubo añada suficiente ácido ascórbico
para reducir completamente el colorante y lea inmediatamente la extinción a 520 nm; esta
solución reducida nos da una lectura cero en el instrumento. Lea la extinción del tercer
tubo (lectura inicial) frente al al segundo tubo. Introduzca el cuarto tubo (tubo
experimental) en el baño de temperatura constante y dejar 5 min en la oscuridad para que
se establezca el equilibrio térmico. Para poner en marcha la reacción, se retorna el
aparato a la luz (frente al foco de 100 watt). Siga la reducción del colorante midiendo la
extinción de las muestras retiradas a intervalos convenientes hasta un tiempo de 30 min.
Al final del experimento, lea la extinción del tubo que guardó en la oscuridad (Figura 2).

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Figura 2. Preparación del sistema de trabajo para demosgtrar la reacción de Hill. Fotos cortesía
de Kevín Cervantes Tuero

La diferencia entre la lectura inicial y la lectura cero es proporcional al cambio de la

DO cuando todo el colorante está reducido. Puesto que se conoce la concentración del
colorante, calcule el número de micromoles de colorante reducido.

Con los valores de densidad óptica obtenidos durante los 30 min de

experimentación, haga una gráfica colocando los datos de densidad óptica en el eje vertical
y el tiempo en minutos en el eje horizontal.

DATOS EXPERIMENTALES

TUBO ABSORBANCIA
Oscuridad 1.5
Ácido Ascórbico 0.048
Medio Ambiente 1.5

Lecturas del tubo de ensayo expuesto a la luz

TIEMPO ABSORBANCIA
(minutos)
10 1.60
20 1.40
30 1.32

a b

Figura 3. Reacción de Hill. En a) se muestra el sistema de trabajo y en b) se observa

como el 2,6-diclorofenolindofenol se reduce con el tiempo. Fotos cortesía de Kevín
Cervantes Tuero

RESULTADOS

DISCUSIÓN

CONCLUSIÓN(
es)

BIBLIOGRAFÍA

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CUESTIONARIO
1. En la fosforilación cíclica, se calcula que deben pasar dos electrones por el ciclo para
bombardear los protones suficientes para generar un ATP. Suponiendo que el G para
la hidrólisis del ATP en las condiciones que se dan en el cloroplasto sea de
aproximadamente –50 kJ/mol, cual es el porcentaje de eficiencia de la fotofosforilación
cíclica, utilizando luz de 700 nm?.

2. El flujo de la energía solar que llega a la superficie de la tierra es de aproximadamente

7 kJ/cm2s. Supóngase que toda esta energía fuera utilizada por una hoja verde (10
cm2 de superficie), con la eficiencia máxima del 35%. Cuantos moles de hexosa podría
generar teóricamente la hoja en una hora?. Puede utilizar 600 nm como longitud de
ondamedia.

3. Supóngase que un investigador está realizando estudios en los que añade un donador
electrónico no fisiológico (2,6-diclorofenolindofenol) a una suspensión de cloroplastos.
La iluminación de los cloroplastos produce la oxidación del donador. Como podrá
determinar si interviene en ello el fotosistema I, el fotosistema II o ambos?.

4. Los siguientes datos, describen la cinética de la incorporación de CO2 por la enzima

rubisco en presencia de N2 y con O2 puro. Determine si el O2 es un inhibidor
competitivo o no competitivo.
[CO2] (mM) Con N2 Con O2
0.20 16.7 10
0.10 12.5 5.6
0.067 8.3 4.2
0.050 7.1 3.2

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