"Año del Bicentenario del Perú: 200 años de Independencia"

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTIN

FACULTAD DE AGRONOMIA

ESCUELA PROFESIONAL DE AGRONOMÍA

PRACTICA 10

“FOTOSINTESIS”

AUTOR:

Mamani Qquelcca Fernando

CURSO:

Bioquímica

DOCENTE:

Blga. Georgina Sucasaca Monzon

GRUPO:

“R”

Majes-Arequipa-Perú 2021
PRACTICA 10 FOTOSÍNTESIS

Es el proceso químico más importante de la biología. Incluye todos los procesos por los que: a) la
luz solar absorbida se utiliza para impulsar las biosíntesis; b) el CO2 es reducidohasta glucosa por
las plantas verdes y; c) el agua es oxidada para liberar oxígeno. Por esta razón, el fenómeno global
de la fotosíntesis se representa por la siguiente ecuación:
Energía solar
2H2O + CO2 (CH2O) + H2O + O2
Clorofila
G°'= +118000 cal/mol de CO2 reducido

El agua es el donador de electrones que se emplea para reducir el CO2 y el fenómeno está acoplado
al desprendimiento de oxígeno.

Este proceso se realiza en los cloroplastos, los cuales contiene los pigmentos que absorben la luz
y las enzimas necesarias. Los cloroplastos se asemejan a las mitocondrias por poseer capas apiladas
de membranas internas en las que las transferencias de electrones se asocian con fosforilación;
también tienen su propio DNA y los sistemas para la síntesis de proteínas. Los cloroplastos
elaboran glucosa y la acumulan como almidón durante las horas de luz; las mitocondrias oxidan
el piruvato desde residuos de glucosa, especialmente durante la noche, para proporcionar energía
a la planta.

CENTROS DE REACCION. Para una eficaz absorción de la luz solar, los cloroplastos contienen
los carotenos y las clorofilas que tiene estructuras altamente resonantes. La energía de excitación
pasa desde un pigmento a otro hasta que llega a un centro de reacción,donde los complejos de
clorofila "a" se hallan asociados con otras proteínas necesarias para la utilización de la energía. La
clorofila "a" en el centro de reacción pierde la energía de excitación y es oxidada por la
transferencia de electrones hasta un aceptor.

FOTOFOSFORILACION CICLICA. En los centros de reacción tipo I los electrones

desplazados por fotooxidación son transferidos de nuevo desde sus receptores hasta la clorofila
oxidada. La transferencia se da a través de varios transportadores a la vez que son utilizados para
generar ATP. En este mecanismo, los electrones desplazados por la luz absorbida son devueltos
continuamente a la clorofila original pero la recombinación ocurre por el aparato de fosforilación
oxidativa.

PRODUCCION DE OXIGENO. Los electrones necesarios para llevar la clorofila oxidada del
PS I a su estado inicial, también pueden ser donados por el agua. Para que suceda esto, la luz es
absorbida por el PS II, en el que la clorofila oxidada después de la eliminación de un electrón
reaccionará con los iones hidroxilos del agua y liberará oxígeno. Los electrones también se
transfieren desde el PS II al PS I a través de parte del aparato de fosforilación oxidativa, y en este
caso se genera por lo menos un ATP por cada par de electrones transferidos.

REDUCCION DE FERREDOXINA. El uso del agua como donador de electrones permite a los
electrones ser liberados del sistema para otros fines, dejando atrás el oxígeno. El aceptor inmediato
de los electrones liberados por el PS I es una sustancia reductora de ferredoxina, la cual es reducida
por la SRF y es utilizada en las plantas verdes para reducir NADP hasta NADPH.

REDUCCION DEL DIOXIDO DE CARBONO. La glucosa se elabora a partir de CO2,

utilizando el NADPH y el ATP producidos en los procesos fotoquímicos. El CO2 es fijado por la
combinación con ribulosa-1,5-difosfato, esta se escinde para formar dos moléculas de 3-
fosfoglicerato, las cuales se reducen con NADPH. La pentosa transportadora de CO2 se
regenera por una reordenación de parte de las triosas fosfato obtenidas, y el remanente sirve para
formar glcosa-6-fosfato que será utilizada como combustible. La secuencia completa constituye el
Ciclo de Calvin, en el que el ATP se utiliza para regenerar ribulosa difosfato y para formar 1,3-
difosfoglicerato el que se reducirá a triosa fosfato por el NADPH.

El funcionamiento del Ciclo de Calvin depende de la isomerización y epimerización de las

pentosas fosfato, a través de una reacción de transcetolasa en la que dos unidades de carbono son
transferidas vía tiamina pirofosfato desde un donador cetosa hasta un donador aldosa.

RUTA DE HATCH-SLACK. Los cloroplastos están construidos de tal forma que la velocidad
del Ciclo de Calvin varía con la concentración de CO2 atmosférico. Una planta que disminuyesu
pérdida de agua cerrando los estomas de las hojas, restringe también el suministro de CO2, excepto
algunas plantas evolucionadas que sobreviven en condiciones secas y calurosas, y utilizan el ATP
para concentrar el CO2. La ruta de Hatch-Slack comprende la carboxilación de piruvato hasta
oxalcetato a expensas de ATP en un anillo externo de las células mesófílicas, seguido de la
reducción hasta malato por NADH. El malato se difunde enel interior de un anillo de células de la
vaina, donde es descarboxilado oxidativamente por NADP para formar piruvato y una elevada
concentración de CO2 para el ciclo de Calvin.

ALTERACION DE LA ATMOSFERA. La fotosíntesis es responsable de la oxido-reducción,

representada por la acumulación de compuestos de carbonos reducidos en los sedimentos a
expensas de carbonatos, y de la acumulación de oxígeno en la atmósfera a expensas del agua. las
alteraciones en el equilibrio de CO2 y O2 actualmente se autocompensan, siendo el sistema tan
masivo que las alteraciones catastróficas debidas a la interferencia del hombre no son si no
perturbaciones sencillas en la estequiometría del sistema.

PARTE EXPERIMENTAL

EXPERIMENTO 1. Aislamiento de cloroplastos.

Los cloroplastos enteros y los cloroplastos desintegrados se preparan macerando hojas u otro
material vegetal en agua o solución hipertónica, los desechos celulares groseros se remueven por
filtración y los otros constituyentes protoplasmáticos por centrifugación diferencial los
procedimientos que se describen se basan en que los cloroplastos intactos se obtienen utilizando
solución hipertónica de sacarosa, en cambio el uso de agua u otra solución hipotónica acompañada
de trituración vigorosa provocan la ruptura de los cloroplastos obteniéndose así los fragmentos de
cloroplastos.

Los métodos descritos son satisfactorios para preparar suspensiones de cloroplastos a partir de
hojas de espinaca, tabaco y algunas otras especies y también a partir de algunas algas.

Instrucciones Generales
Todas las operaciones se deben realizar a 0°C o a temperaturas cercanas a 0°C (4°C).Se debe lavar
varias veces las hojas recientemente colectadas o almacenadas en el frío. Se les deja escurrir y se
les coloca en una bolsa plástica en un cuarto frío durante unas horas hasta que las hojas se hinchen.
Luego se remueven los peciolos y las levaduras y se secan las hojas entre papel filtro. Si se utilizan
algas, estas deben ser lavadas por filtración o centrifugación. Examine las suspensiones de
cloroplastos bajo el microscopio (400 a 1000x) antes de usarlas.

Materiales
• Centrífuga
• Homogeneizador de cuchillasTejido de nylon o gasa Tubos de ensayo
 • Fiolas Sacarosa 0.5 M
• Solución buffer fosfato de potasio (solución 0.1 M de KH2PO4 en sacarosa ajustada a
pH6.5)
• Medio de sucrosa (solución de EDTA en solución buffer fosfato 10 mM, ajustada a pH
6.5)

Método de Trabajo
En un mortero homogenice 10 g. de hojas de espinaca bien lavadas con 10 ml. de medio de sucrosa.
Filtrar el homogenizado verde a través de una doble capa de tejido de nylon o gasa para remover
las paredes celulares y fibras. Centrifugar el filtrado a 200 xg por 5 min, para remover las partículas
extrañas y las células intactas. Desechar el precipitado.

El sobrenadante se centrifuga a 600 xg por 12 min para sedimentar los cloroplastos. Descartar el
sobrenadante. El precipitado se resuspende con 20 ml de sucrosa 0.5 M fría yse centrifuga de
nuevo a 600 xg durante 12 min. Descartar el sobrenadante. El sedimento asíobtenido constituye
los cloroplastos. Resuspenda los cloroplastos en 20 ml de sucrosa u otromedio hipertónico (medio
de reacción helado) agitándolo suavemente con una varilla de vidrio y almacenándolo sobre hielo
hasta cuando lo utilice (Figura 1).

Figura 1. Extracción de Cloroplastos. Fotos cortesía de Kevín Cervantes Tuero

EXPERIMENTO 2. Reacción de Hill

La síntesis de carbohidratos a partir de CO2 y agua se da en dos etapas, reacción luminosa y

reacción oscura. La reacción luminosa que se demuestra en este experimento se efectúa solo en
presencia de luz visible, que es absorbida por la clorofila de los cloroplastos. Los electrones de la
clorofila son llevados a niveles más altos de energía y retornan al estadoinicial por una serie de
reacciones semejantes a las de la cadena respiratoria mitocondrial. Durante este proceso de
transporte de electrones se produce ATP. Al mismo tiempo se producen equivalentes reductores
en forma de NADPH2 y se libera O2.

La fotólisis del agua o "Reacción de Hill" se define como una reacción de oxido- reducción
dependiente de luz, catalizada por cloroplastos, fragmentos de cloroplastos, o en algunos casos,
células vegetales intactas, en la que el agua es el donador de hidrógeno,
se produce oxígeno, y alguna otra sustancia. El CO2 (reactivo oxidante de Hill es el aceptor de
hidrógenos. La reacción lleva el nombre de Robert Hill, quien fue el primero en observar la
reducción del oxalato férrico por cloroplastos iluminados (aislados). La reacción de Hill se puede
estudiar: a) siguiendo la evolución del oxígeno, b) por el cambio de la concentración del ion
hidrógeno, c) por el cambio del potencial de oxido-reducción; y d) por la reducción de un oxidante.

En este experimento usamos el 2,6-diclorofenolindofenol como un aceptor artificial de hidrógenos.

La reducción del colorante no se efectúa en la oscuridad. Tampoco se aprecia reducción cuando se
usa cloroplastos hervidos.

La lenta oxidación espontánea del 2,6-diclorofenolindofenol permite usar una cubeta abierta (de 1
cm. de trayectoria de luz y de 5 a 10 ml de capacidad), como un vaso de reacción o un tubo de
ensayo. Sobre la cubeta se enfoca un rayo de luz que proviene de un foco de 100 watt. La cubeta
de reacción, a su vez está sumergida e un baño de agua a temperatura constante.

Material
• Fotocolorímetro Tubos de ensayo Cubetas de vidrio Focos de 100 watt
• Mezcla de reacción (buffer fosfato de potasio 0.02 M pH 6.5, que contiene KCl 0.05%)
2,6-diclorofenolindofenol 0.1 M
• Ácido Ascórbico
• Preparación de cloroplastos: diluya los cloroplastos enteros o fragmentados con lamezcla
de reacción hasta obtener una concentración de clorofila de aproximadamente 5 mg/ml.

Método de Trabajo
Mezcle 1.0 ml de suspensión verdosa de cloroplastos con 4.0 ml de la solución de 2,6-
diclorofenolidofenol. Prepare cuatro tubos de la misma forma. Coloque el primer tubo en la
oscuridad durante el experimento. Al segundo tubo añada suficiente ácido ascórbico para reducir
completamente el colorante y lea inmediatamente la extinción a 520 nm; esta soluciónreducida nos
da una lectura cero en el instrumento. Lea la extinción del tercer tubo (lectura inicial) frente al
segundo tubo. Introduzca el cuarto tubo (tubo experimental) en el baño de temperatura constante
y dejar 5 min en la oscuridad para que se establezca el equilibrio térmico. Para poner en marcha la
reacción, se retorna el aparato a la luz (frente al foco de 100 watt). Siga la reducción del colorante
midiendo la extinción de las muestras retiradas a intervalos convenientes hasta un tiempo de 30
min. Al final del experimento, lea la extinción del tubo que guardó en la oscuridad (Figura 2).

Figura 2. Preparación del sistema de trabajo para demostrar la reacción de Hill. Fotos cortesía deKevin Cervantes Tuero

La diferencia entre la lectura inicial y la lectura cero es proporcional al cambio de la DOcuando

todo el colorante está reducido. Puesto que se conoce la concentración del colorante,
calcule el número de micro moles de colorante reducido.

Con los valores de densidad óptica obtenidos durante los 30 min de experimentación, haga una
gráfica colocando los datos de densidad óptica en el eje vertical y el tiempo en minutos en el eje
horizontal.

RESULTADOS

a b

Figura 3. Reacción de Hill. En a) se muestra el sistema de trabajo y en b) se observa cómo el2,6-diclorofenolindofenol se reduce con
el tiempo. Fotos cortesía de Kevin Cervantes Tuero

DISCUSIÓN

Los 4 tubos de ensayos prácticamente fueron experimento para determinar la importancia de la

fotosíntesis, como se puede observar en el 4 tubo, el color es de verde limón, eso quiero decir que
presenta mayor cantidad de clorofila.

CONCLUSIÓN

• La actividad fotosintética está condicionada por una serie de factores que son los que
finalmente establecen la efectividad del proceso.

• La espinaca es una planta de temperaturas templadas lo que explica que su actividad

óptima esté a bajas temperaturas. De hecho, se nota disminución de la actividad desde
los 30o C.

• La longitud de onda es otro factor relevante en la actividad fotosintética. Quedó

evidenciado que la actividad es óptima en azul, rojo y violeta tal como lo reporta la
literatura.

BIBLIOGRAFÍA

https://www.redalyc.org/pdf/3761/376140391004.pdf