Bioquímica II • 2022 • Ingeniería en Biotecnología

Docente a cargo: Dra. Natalia Bongiovani / JTP: Mg. Pablo L. Rado

Guía de Trabajo Práctico de Laboratorio N°2

Estudio de la fotosíntesis en cloroplastos de espinaca (Spinacia
oleracea)

Introducción
Fotosíntesis
Los cloroplastos están presentes en todas las células de las plantas verdes y algas
eucarióticas. Se los puede considerar como centrales energéticas de la célula que utilizan la
energía solar. En los cloroplastos, moléculas de pigmento que absorben la energía de la luz y
la emplean para fabricar ATP y, en última instancia, para reducir dióxido de carbono y producir
glúcidos tales como almidón y sacarosa. El proceso fotosintético en eucariotas y cianobacterias
produce O2 como producto secundario de las reacciones de captación de la luz, por lo que en
condiciones anaeróbicas, la fotosíntesis no se ve afectada.
Estos orgánulos tienen aproximadamente 5 µm y adoptan formas muy diversas. Tienen tres
sistemas de membranas y contienen una elevada concentración de clorofila y en menor
proporción otros pigmentos, que en conjunto pueden absorber la energía de la luz en
prácticamente la totalidad del rango del espectro visible. Estas moléculas se localizan en las
membranas más internas de los cloroplastos, que forman apilamientos de cisternas cerradas
conocidos como tilacoides.
Los organismos fotosintéticos atrapan la luz solar formando ATP y NADPH, que utilizan como
fuente de energía para fabricar glúcidos y otros componentes orgánicos a partir de CO2 y H2O,
y de forma simultánea liberan O2 a la atmósfera. La ecuación global de la fotosíntesis describe
una reacción de oxidación-reducción en la que el H2O cede electrones para la reducción del
CO2 a glúcidos (CH2O):

CO2 + H2O CH2O + O2

Eq. 1. Fotosíntesis

Como el agua es un pobre dador de electrones (su potencial de reducción estándar es alto),
este proceso requiere el aporte de energía en forma de luz para crear un buen dador de
electrones. Entonces, los electrones fluyen a través de una serie de transportadores ligados a
la membrana, al tiempo que se bombean protones a través de la misma para crear un potencial
electroquímico. Este potencial electroquímico es la fuerza motriz para la síntesis de ATP a
partir de ADP y Pi por un complejo ATP sintasa ligado a la membrana. Este proceso se
denomina fotofosforilacion.
Mediante ciertos experimentos se demostró que la síntesis de ATP está estrechamente
acoplada a la cadena transportadora de electrones. Esta dependencia es explicada fácilmente
por la teoría quimiosmótica. No obstante, ciertas condiciones y reactivos desacoplan la
fosforilación del transporte electrónico. Entre estos desacoplantes químicos se encuentra el
2,4-dinitrofenol (DNP) que es un ácido débil con propiedades hidrofóbicas. Su hidrofobicidad le
permite difundir fácilmente a través de las membranas y después de entrar en la matriz en
forma protonada pueden liberar un protón (se disocian) disipando de este modo el gradiente de
protones.
En presencia del DNP, la captación de luz y el transporte electrónico seguiría funcionando
aunque no haya producción de ATP. En cambio, en presencia de un inhibidor de alguno de los
transportadores de electrones, el flujo a través de la cadena cesará.

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La fotosíntesis abarca dos procesos (ambos se realizan en los cloroplastos):

Reacciones lumínicas: se absorbe energía luminosa por los pigmentos conservándola
en forma de ATP y NADPH; simultáneamente se elimina O2
Reacciones de fijación de carbono: se utiliza el ATP y NADPH para reducir el CO2
formando glucosa y otros productos orgánicos.
Robert Hill en 1937 descubrió que si el aceptor de electrones era un compuesto no biológico,
igual se desprendía oxígeno y se reducía ese aceptor según la siguiente ecuación:

2 A + 2 H2O 2 AH2 + O2
Eq. 2. Ecuación de Hill
Donde A es el aceptor de hidrógeno artificial. Uno aceptor no biológico es el 2,6-
diclorofenolindofenol (reactivo de Hill) que en su forma oxidada es azul e incoloro en su forma
reducida (AH2). Varios años más tarde, se encontró que el NADP+ es el aceptor biológico de
electrones en los cloroplastos.
El proceso de captación y transferencia de la luz es el siguiente:
La luz excita una molécula antena (clorofila o pigmento accesorio), elevando un electrón
a un nivel energético superior.
La molécula antena excitada pasa energía a una molécula de clorofila vecina
(transferencia de energía por resonancia), excitándola.
Esta energía se transfiere a una clorofila del centro de reacción, excitándola.
La clorofila excitada del centro de reacción pasa un electrón a un aceptor electrónico
primario.
El hueco electrónico en el centro de reacción se cubre con un electrón de un dador
electrónico.
La absorción de un fotón ha producido una separación de carga en el centro de
reacción.
De esta forma la excitación por la luz produce una separación de carga e inicia una cadena de
oxido-reducción. Esta cadena se divide en dos fotosistemas, cada uno con su propio tipo de
centro de reacción fotoquímico y un conjunto de moléculas antena. Los dos fotosistemas tienen
funciones distintas y complementarias. Es entre los fotosistemas II y I que tiene lugar el flujo
electrónico impulsado por la luz, produciendo NADPH y un gradiente protónico transmembrana.

Fig 1. Esquema en Z de las reacciones lumínicas con escala de potenciales estándar de reducción (E° red)

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Este esquema en Z muestra la ruta de transferencia de electrones desde el H2O al NADP+ en la

fotosíntesis no cíclica. La posición de cada transportador electrónico sobre la escala vertical es
un reflejo de su potencial de reducción estándar. Para elevar la energía de los electrones
provenientes del agua al nivel de energía requerido para reducir al NADP+, cada electrón ha de
ser elevado dos veces por los fotones absorbidos en los fotosistemas II y I. Durante la escisión
del agua y durante la transferencia de electrones a través del complejo del citocromo bf, se
transportan protones a través de la membrana tilacoide produciendo el gradiente de protones
que es central para la formación de ATP.

Fraccionamiento celular
Según un método típico de fraccionamiento celular, se lisan las células mediante
homogeneización suave en un medio con sacarosa 0,2 M para romper las membranas por
presión osmótica. Los orgánulos tienen diferente tamaño y por lo tanto sedimentan a distintas
velocidades durante la centrifugación. También tienen diferente densidad específica y flotan a
distintos niveles en un gradiente de densidad. La centrifugación diferencial permite obtener un
fraccionamiento inicial del contenido citoplásmatico, que puede purificarse con más precisión
mediante una centrifugación isopícnica. En el sobrenadante se encuentran proteínas solubles.

Condiciones de Centrifugación Pellet

1.000 g - 10 min Células enteras, núcleos, membranas plasmáticas
20.000 g - 20 min Mitocondrias, lisosomas, peroxisomas
80.000 g - 60 min Microsomas, vesículas pequeñas
150.000 g - 180 min Ribosomas, virus, macromoléculas grandes
Tabla 1. Centrifugación diferencial

En la centrifugación isopícnica se llena un tubo de centrífuga con una disolución cuya densidad
aumenta desde la superficie hasta el fondo. Para producir este gradiente de densidad se
disuelve un soluto, por ejemplo la sacarosa, a diferentes concentraciones. Cuando se deposita
una mezcla de orgánulos sobre este gradiente de densidad y se centrifuga el tubo a una alta
velocidad, los orgánulos individuales sedimentan hasta que su densidad corresponde
exactamente a la del gradiente. Entonces puede recogerse cada capa separadamente.

Objetivos
Aislar cloroplastos de hojas de espinaca (fraccionamiento celular).
Verificar que estén fotosintéticamente activos (reacción de Hill) e intactos (visualización
al microscopio).
Ensayar la acción de distintos tratamientos sobre su capacidad fotosintética (efecto de
los detergentes).

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Materiales y Métodos
Materiales
Buffer de homogeneización (B10): Tris•HCl 30 mM (pH 7,4)
MgCl2 5 mM
Buffer B20: B10 con sacarosa 20% p/v
Buffer B40: B10 con sacarosa 40% p/v
Buffer B60: B10 con sacarosa 60% p/v
Solución de DCPIP: 0,1 mg/ml (3,2 mM) de 2,6-diclorofenolindofenol en B10
Solución de SDS: 1% p/v de dodecilsulfato sódico en B10 y diluciones seriadas.
Solución de Tritón X-100: 1% p/v de tritón X-100 en B10 y diluciones seriadas.

Distribución del trabajo

Todos los grupos obtendrán una suspensión de cloroplastos purificada.
Todos los grupos realizarán el ensayo de normalización.
1 grupo realizará el ensayo correspondiente a la cinética de la reacción de Hill.
1 grupo realizará los ensayos correspondientes a determinar el efecto del SDS.
1 grupo realizará los ensayos correspondientes a determinar el efecto del Tritón-X100.

Procedimiento
Aislamiento de cloroplastos
1. Pesar 10 g de hojas de espinaca frescas y lavarlos con agua corriente.
2. Enjuagar con agua destilada, escurrir, secar, destroncar y trozar las hojas en pedazos
medianos y colocarlos en el mortero.
3. Agregar 30 ml de B10 frío y triturar bastante las hojas (agregar de a pequeñas
cantidades).
4. Filtrar usando un embudo con un pedacito de algodón previamente humedecido con
B10.
5. Centrifugar el filtrado a 4°C durante 5 minutos a 200 rpm.
6. Reservar el sobrenadante y centriguarlo a 4000 rpm durante 10 minutos.
7. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet de cloroplastos en 3 ml de B10,
agregar 5 gotas de la solución de MgCl2 5 mM y reservar en hielo.
8. Armar el gradiente de sacarosa en un tubo cónico de 15 ml agregando con pipeta 3,5 ml
de las soluciones de sacarosa (hacerlo por duplicado). El orden se debe respetar y el
agregado debe realizarse lentamente sobre la pared del tubo (para no mezclar las
capas). Primero se adiciona B60, luego B40 y por último B20.
9. Cargar con cuidado 0,5 ml de la suspensión de cloroplastos en la parte superior del
gradiente.

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10. Centrifugar a 4°C durante 15 minutos a 5000 rpm. No utilizar el freno al cortar la
centrifugación (desacelaración= 0).
11. Los cloroplastos enteros quedarán en la interfase entre B40 y B60. Retirar los
cloroplastos con una pipeta Pasteur y colocarlos en un tubo limpio en hielo.

Verificación de la integridad de los cloroplastos

1. Colocar en un tubo 0,5 ml de B10, agregar 5 gotas de suspensión de cloroplastos y
agitar suavemente.
2. Dejar a temperatura ambiente 5 minutos.
3. Colocar una gota sobre un portaobjetos y montar el cubreobjetos.
4. Observar al microscopio.
5. Observar también directamente trozos de las hojas lavadas.

Normalización de las soluciones de cloroplastos

Dado que entre una preparación y otra la cantidad de cloroplastos puede variar
significativamente, será necesario determinar el volumen de suspensión que provoque una
reacción colorimétrica en el tiempo deseado (15 minutos). Para ello se efectuará el siguiente
ensayo:
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8
B10 936 ul 900 ul 898 ul 896 ul 892 ul 884 ul 868 ul 836 ul
DCPIP - 100 ul 100 ul 100 ul 100 ul 100 ul 100 ul 100 ul
Cloroplastos 64 ml - 2 ml 4 ml 8 ml 16 ml 32 ml 64 ml
Vf 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Preparar todos los tubos primero sin agregar DCPIP y a tiempo 0 agregarlo rápidamente a cada uno.
Incubar los tubos con iluminación y considerar como referencia el tubo en el cual la coloración
se perdió en un tiempo más cercano a los 15 minutos (se asemejará más al tubo 1 de control).

Cinética de Reacción de Hill

1. Rotular 5 tubos de ensayo del 1 al 5
2. Agregarle a cada tubo las siguientes soluciones:
Tubo 1 2 3 4 5
B10 1000 ul (1000-X) ul 900 ul (900-X) ul (900-X) ul
DCPIP - - 100 ul 100 ul 100 ul
Cloroplastos - X ul - X ul X ul
Vf 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Preparar todos los tubos primero sin agregar DCPIP y a tiempo 0 agregarlo rápidamente a cada uno.

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3. Mezclar de inmediato y colocar los tubos del 1 al 4 a la luz, y el quinto en oscuridad.

4. Leer absorbancia (excepto el tubo 5) a 610nm al tiempo inicial, y del tubo 4 cada 5
minutos, durante 20 minutos. Al finalizar, leer la absorbancia del tubo guardado en
oscuridad.

Efecto de los detergentes

1. Preparar tubos con las siguientes soluciones:
Sin det. ni Sin clorop. SDS
Sin DCPIP Sin det. SDS 1% SDS 0,01%
clorop. (SDS 1%) 0,1%
(900-X) (890-X) (890-X)
B10 (990-X) ul 900 ul 890 ul (890-X) ul
ul ul ul
DCPIP - 100 ul 100 ul 100 ul 100 ul 100 ul 100 ul
SDS 10 µl - - 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl
Cloroplastos X ul - X ul - X ul X ul X ul
Vf 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Sin det. ni Sin clorop. Tritón

Sin DCPIP Sin det. Tritón 1% Tritón 0,01%
clorop. (Tritón 1%) 0,1%
B10 (990-X) ul 900 ul (900-X) ul 890 ul (890-X) ul (890-X) ul (890-X) ul
DCPIP - 100 ul 100 ul 100 ul 100 ul 100 ul 100 ul
Tritón 10 µl - - 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl
Cloroplastos X ul - X ul - X ul X ul X ul
Vf 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

2. Mezclar suavemente sin hacer espuma.

3. Incubar durante 15 minutos bajo luz natural.
4. Leer absorbancia a 610nm. Mientras se realiza este paso, mantener lo demás tubos en
oscuridad.