UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE CIENCIAS

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA (2015585)

FORMATO DE INFORME DE LABORATORIO

PRÁCTICA: Estudio de la reacción de Hill sobre cloroplasto de espinaca común (Spinacea oleracea)
DOCENTES: Edgar Antonio Reyes Montanoy Luis Ernesto Contreras Rodriguez
ESTUDIANTES: Camilo Andres Rico Cortesy Danna Nataly Garzon Polania

OBJETIVOS:
● Estudiar la inhibición de la reacción de hill en el proceso metabólico de la fotosíntesis por acción de herbicidas
en cloroplastos de espinaca.
● Extraer cloroplastos a partir de hojas de espinaca orgánica.
● Hacer el seguimiento de la reacción de Hill por medio de medidas espectrofotométricas.

CONTEXTO: Defina los siguientes conceptos:

Cloroplastos, estructura y función Fotosíntesis

Cloroplastos, estructura y función

Los cloroplastos, son orgánulos subcelulares (plastidios)

verdes, con un diámetro que puede variar desde 5 a 10 μm.
Están presentes en las células mesofílicas de las hojas o en
cualquier otro tejido vegetal con capacidad fotosintética. Las
angiospermas pueden contener de 15 a 20 cloroplastos por
célula fotosintética. Hasta el 50% de la proteína foliar puede
estar contenida en los cloroplastos. Su forma y tamaño varía
en dependencia de la especie vegetal. Los cloroplastos se
originaron como organismos endosimbióticos en la célula
eucariota primitiva y poseen una autonomía genética parcial,
al contener ácido desoxiribonucleíco (ADN), ácido
ribonucleíco (ARN) y toda la maquinaría enzimática de
replicación, transcripción y traducción .
Una suspensión de cloroplastos aislados puede desprender O2
en presencia de luz, si se suministra un compuesto oxidado
capaz de aceptar electrones procedentes de la fotolisis del
agua. De esta forma, el proceso de desprendimiento de O2 en
la fotosíntesis puede ser separado del de la fijación de CO2.
Los cloroplastos presentan una envoltura constituida por dos
membranas (externa e interna) y otra membrana, también
interna, la membrana tilacoidal. Estas tres membranas
describen tres compartimientos: espacio intermembrana,
estroma y espacio tilacoidal.
Fase luminosa de la fotosíntesis
La fase fotoquímica es un proceso de conversión de energía
luminosa en energía química. Se inicia con la absorción de la
luz por parte de los pigmentos del complejo antena y continúa
con la transferencia por resonancia de la energía de los
electrones de los pigmentos excitados, hacia los centros de
reacción fotoquímica. Allí la energía se transforma en una
corriente de electrones y protones entre moléculas
oxidorreductoras (cadena de transporte de electrones). Esta
corriente de electrones comienza en el fotosistema II, en el
que el agua es escindida proporcionando electrones, protones
y oxígeno molecular que será liberado a la atmósfera como
producto residual de la reacción.
Los productos de las reacciones de óxidorreducción son dos
biomoléculas, ATP y NADPH que proporcionan energía y
poder reductor respectivamente necesarios para la siguiente
fase.
Fase oscura de la fotosíntesis
El ATP y NADPH sintetizados en la fase fotoquímica se
utilizan en la reducción del carbono del CO2 a un azúcar
simple: gliceraldehído3-fosfato (C3H7O6P). De este modo,
la energía química almacenada temporalmente en las
moléculas de ATP y NADPH se transfiere a moléculas que
transportan y almacenan energía en las células de los
organismos fotoautótrofos. Como resultado de este proceso
se forma un esqueleto hidrocarbonado a partir del cual
pueden construirse una variedad de moléculas orgánicas. La
incorporación inicial de CO2 en compuestos orgánicos se
conoce como fijación del carbono. En las células eucariotas,
este proceso ocurre en el estroma de los cloroplastos. El
carbono está disponible para los seres vivos en forma de
CO2 . Las algas obtienen el CO2 del agua en el que se halla
disuelto. En las plantas, el CO2 llega a las células del
parénquima clorofiliano a través de los complejos
estomáticos, presentes en las hojas y tallos verdes.
Las células del parénquima fotosintético de las plantas
contienen cloroplastos que presentan una maquinaria
enzimática única para catalizar la conversión del CO2 en
compuestos orgánicos sencillos (reducidos), proceso que se
denomina fijación del carbono. En el citoplasma de dichas
células, estos productos sencillos de la fotosíntesis se
convierten en biomoléculas complejas, entre ellas glúcidos,
2
 polisacáridos y metabolitos derivados de los mismos. Las
reacciones que dan lugar a la fijación del CO2 forman una
ruta cíclica en la que se regeneran intermediarios clave.
La primera etapa de la fase de fijación del carbono está
catalizada por la enzima ribulosa 1,5 bifosfato carboxilasa-
oxigenasa (RuBisCO) que, como su nombre lo indica, tiene
como sustrato a la ribulosa 1,5 bifosfato. Esta enzima puede
catalizar tanto reacciones de carboxilación (fijación del
carbono) como de oxigenación (que inicia una ruta
denominada fotorrespiración). Vale decir, la RuBisCO no es
absolutamente específica para el CO2 , sino que el CO2 y el
O2 compiten por el sitio activo de la enzima, lo cual está en
relación directa con la ppO2 presente en el ámbito de las
cámaras de aire del interior del parénquima fotosintético de
la hoja.
La fotorrespiración (cuyo rol en la planta es discutido) afecta
en gran medida la eficiencia de fijación de carbono en las
plantas, lo que se traduce en una disminución en la síntesis
de biomasa. Esto ocurre especialmente cuando las
temperaturas son muy altas en que las plantas se ven
forzadas a cerrar sus estomas para evitar la pérdida de agua
por evapotranspiración. Este hecho altera la proporción CO2
/O2 en los espacios aéreos del interior de las hojas, lo que
desplaza la afinidad de la RuBisCO a favor del O2 y
aumenta la tendencia de la enzima a catalizar la reacción de
fotorrespiración. Las plantas de los trópicos que están
expuestas a una luz solar intensa y temperaturas elevadas,
así como algunas plantas cultivadas en zonas templadas pero
provenientes de los trópicos (maíz, caña de azúcar) han
desarrollado estrategias anatómicas y metabólicas que
tienden a disminuir los efectos de la fotorrespiración. Éstas
consisten en generar una concentración elevada de CO2 en
las células de la hoja donde transcurre el ciclo de Calvin. A
esta plantas se la conoce con el nombre de plantas C4. En
climas muy calurosos y con alta escacez de agua, las plantas
deben permanecer con sus estomas cerrados durante el día.
Esto ha promovido el desarrollo de una adaptación por la
cual el CO2 ingresa durante la noche y se fija mediante la
vía C4 en malato que se almacena en la vacuola. Durante el
día el malato se descarboxila y el CO2 está disponible para
el ciclo de Calvin. Esta plantas han recibido el nombre de
plantas CAM (del inglés Crassulacean Acid Metabolism) lo
cual refiere a la familia de las plantas crasuláceas, en las que
este metabolismo fue descrito inicialmente.
DATOS Y CÁLCULOS: Concentración DCPIP (µM) en los patrones (indique los cálculos)
Patrón 1: Patrón 2: Patrón 3:
60,0 48,0 38,4
Patrón 4: Patrón 5: Patrón 6:
30,7 24,6 19,7

3
 Cálculos:
Concentración DCPIP ( M ) x Volumen de DCPIP( L) 1 μM
Concentración del patrón1(μM )= x
Volumen de la solución 3 ( L ) +Volumen DCPIP(L) 10−6 M

4 mLde patrón 1
Concentración patron 2 ( en adelante )(μM )=Concentración del patrón 1 x
1 mL solución3+ 4 mL patrón 1
Curva de calibración: Abs 600 nm -vs- Concentración DCPIP (µM)
Coeficientes
Indique ecuación de la recta y coeficiente deError típico
regresión lineal (R2)

0.750 Intercepción -0,013 0,008

Variable X 1 0,0119 0,0002
0.650 R2 ajustado 0,999 0,007
Absorbancia (ua)

0.950 77.0
0.550
0.850

Concentración (µM)
0.450 67.0
Absorbancia (ua)

0.750
0.350 57.0
0.650
0.250 47.0
0.550
0.150 37.0
0.450
16.0 21.0 26.0 31.0 36.0 41.0 46.0 51.0 56.0
0.350 27.0
0 Concentración
5 10 DCPIP(µM)
15 20 25 0 5 10 15 20 25
Tiempo (min) Tiempo (min)

Intercepción 69,17 1,10

Variable X 1 -1,42 0,07
R2 ajustado 0,97 2,16

Velocidad de reacción (µM/min): -1,42 ± 0,07

Filtro Azul

4
 0.450 41.0

Concentración (µM)
0.400 36.0
Absorbancia (ua)

0.350 31.0

0.300 26.0

0.250 21.0

0.200 16.0
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20
Tiempo (min) Tiempo (min)

Abs 600 nm -vs- Tiempo (min) Concentración DCPIP (µM) -vs- Tiempo (min)
  Coeficientes Error típico
Intercepción 36,43 0,38
Variable X 1 -0,72 0,03
R2 ajustado 0,98 0,76

Velocidad de reacción (µM/min): -0,72 ± 0,03

Filtro Verde
Abs 600 nm -vs- Tiempo (min) Concentración DCPIP (µM) -vs- Tiempo (min)
0.250 25.0
Concentración (µM)

0.200 20.0
Absorbancia (ua)

15.0
0.150
10.0
0.100
5.0
0.050
0.0
0.000 0 5 10 15 20 25
0 5 10 15 20 25
Tiempo (min)
Tiempo (min)

  Coeficientes Error típico

Intercepción 20,04 0,35
Variable X 1 -0,73 0,02
R2 ajustado 0,99 0,69

5
 Velocidad de reacción (µM/min): -0,73 ± 0,02
Filtro Rojo
Abs 600 nm -vs- Tiempo (min) Concentración DCPIP (µM) -vs- Tiempo (min)

44.0
0.500   Coeficientes Error típico

Concentración (µM)
39.0
0.450 Intercepción 39,11 0,44
Absorbancia (ua)

Variable X 1 -0,72 34.0 0,03

0.400
R2 ajustado 0,98 29.0 0,86
0.350
0.300 24.0
Velocidad de reacción (µM/min): -0,72 ± 0,03
0.250 19.0
0 5 10 15 20 25 30
0.200
0Efecto
5 de10la inhibición
15 de
20la reacción
25 de Hill. Indicar las siguientes gráficas:
Tiempo (min)
Tiempo (min) Herbicida( Atrazina)
Abs 600 nm -vs- Tiempo (min) Concentración DCPIP (µM) -vs- Tiempo (min)
0.608 52.10

Concentración (mM)
0.607 52.00
Absorbancia (ua)

0.606
51.90
0.605
51.80
0.604
0.603 51.70

0.602 51.60
0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tiempo (min) Tiempo (min)

Etanol 96%
Abs 600 nm -vs- Tiempo (min) 51.2
Concentración (µM)

41.2
0.670
0.660 31.2
0.650
Absorbancia (ua)

21.2
0.640
0.630 11.2
0.620
1.2
0.610
9.3 11.3 13.3 15.3 17.3 19.3 21.3 23.3 25.3
0.600 -8.8
0.590
0.580 Tiempo (min)
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tiempo (min) Concentración DCPIP (µM) -vs- Tiempo (min)

  Coeficientes Error típico

Intercepción 52,18 0,17

6
 Variable X 1 -0,11 0,01
R2 ajustado 0,95 0,14

Velocidad de reacción (µM/min): -0,11 ± 0,01

Oscuridad
Abs 600 nm -vs- Tiempo (min) 48.5

Concentración (mM)
0.566
0.565
Absorbancia (ua)

0.564
0.563
0.562
48.0
0.561 5 7 9 11 13 15 17

0.560 Tiempo (min)

0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tiempo (min) Concentración DCPIP (µM) -vs- Tiempo (min)

  Coeficientes Error típico

Intercepción 48,26 0,00
Variable X 1 0,00 0,00
R2 ajustado 1,00 0,00

Velocidad de reacción (µM/min): 0

DISCUSIÓN: Interpretar los resultados obtenidos.

Los cloroplastos son los orgánulos de las células vegetales donde se realiza la fotosíntesis, al convertir la energía
lumínica en energía química (ATP) y generar poder reductor (NADPH) (Leiva et. al, 2010).

En la suspensión de cloroplastos aislados de la Spinacia oleracea el desprendimiento del O 2 en interacción con la

luz, es posible gracias a la presencia del 2,6-diclorofenolindofenol (DCPIP), el cual es un compuesto oxidado que
es capaz de aceptar electrones procedentes de la fotolisis del agua. De esta forma, el proceso de desprendimiento
de O2 en la fotosíntesis puede ser separado del de la fijación de CO 2 (Kozuleva e Ivanov, 2010). Mientras que, en
la hoja intacta, los principales aceptores naturales de electrones son la ferredoxina y el NADP, pero se inactivan
durante el proceso deaislamiento de los cloroplastos. (Sauer y Park, 1965).

En la fase lumínica de la fotosíntesis el proceso ocurre en la antena (cloroplastos, tilacoides)

7
- diferentes pigementos en los cuales se almacenan los fotones (carotenoides)
- fotones capturados por la antena y son dirigidos al centro de reacción: la reaccion fotoquímica
convierte la energia de un foton en una separación de carga iniciando el flujo de electrones

8
CONCLUSIONES

9
BIBLIOGRAFÍA

Leiva-Mora, M., Alvarado-Capó, Y., Acosta-Suárez, M., Cruz-Martín, M., Sánchez-García, C., & Roque, B.
(2010). Protocolo para el aislamiento de cloroplastos intactos de hojas de plantas de Musa spp. obtenidas por
cultivo in vitro y evaluación de la actividad fotosintética. Biotecnología Vegetal, 10(1). Recuperado de
https://revista.ibp.co.cu/index.php/BV/article/view/270/800

Kozuleva, AM, Ivanov NB (2010) Evaluation of the participation of ferrodoxin in oxygen reduction in the
photosynthetic electron transport chain of isolated pea thylakoids. Photosynthetic research105: 51-61

Sauer, K, Park BR (1965) The Hill Reaction of Chloroplasts. Action Spectra and Quantum Requirements Biochemistry 4(12):
2791–2798

10