PRÁCTICAS SECAS DE LABORATORIO

BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

SEGUNDO BLOQUE

2023-2024

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
FACULTAD DE MEDICINA
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

Elaboración:
Dra. Rebeca Milán Chávez
Dra. Sara Morales López
Dra. Norma Lilia Morales García

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 ÍNDICE

Práctica Página
4. Estudio del bombeo de protones por
levaduras. Efecto de los inhibidores y de los
3
desacoplantes sobre la cadena de transporte
de electrones

5. Determinación de glucosa en sangre 7

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 Práctica 4

Estudio del bombeo de protones por levaduras.

Efecto de los inhibidores y de los desacoplantes sobre la cadena
de transporte de electrones

Objetivos

Al terminar la práctica el estudiante:

1. Relacionará el consumo de glucosa con los cambios de pH producidos por

las levaduras.
2. Describirá las vías por las cuales la glucosa genera los cambios de pH.
3. Interpretará el efecto de los inhibidores y los desacoplantes sobre la salida
de protones.

Es necesario para realizar las actividades, revisar la introducción de la práctica que

se encuentra en el Manual de Prácticas.

ACTIVIDAD 1
1.1 Hacer una gráfica de cada uno de los experimentos, utilizando los valores de las
lecturas de pH contra tiempo (Tabla 1).

1.2 Analizar el significado de los cambios de pH en el experimento control, con

dinitrofenol como desacoplante y con azida de sodio como inhibidor del complejo IV
de la cadena de transporte de electrones.

1.3 Hacer una relación de las vías que producen estos cambios; tome en cuenta
que las levaduras tienen dos ATPasa de protones: una ubicada en la membrana
mitocondrial que se encarga de sintetizar ATP y la otra en la membrana plasmática,
cuya función es similar a la bomba de Na+/K+ en las células de los mamíferos que
se encarga de mantener la homeostasis celular, regulando la concentración de
iones en la célula.

Tabla 1.
Tiempo CONTROL DINITROFENOL AZIDA DE SODIO
(minutos) pH
0 7.0 6.8 6.8
5 6.7 6.5 6.7
10 6.4 6.3 6.4
8 15 6.3 6.2 6.3
f 20 6.1 6.1 6.2
A N
30 5.8 5.9 6.1
PH
40 5.6 5.7 6.0

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Una de las funciones de las mitocondrias es sintetizar ATP (fosforilación oxidativa)
debido al gradiente de protones que se genera al bombearlos de la matriz
mitocondrial al espacio intermembranal. Este gradiente se genera por los complejos
de la cadena respiratoria en un proceso que involucra el bombeo de protones,
mientras se da la transferencia de electrones hasta la molécula de oxígeno que es
su aceptor final.

En las mitocondrias aisladas se puede determinar el consumo de oxígeno mediante

la adición de varios sustratos e inhibidores y al graficarlo se puede analizar los
diversos estados de la respiración mitocondrial (Gráfica 1). Cuando se realiza la
adición de mitocondrias aisladas en un buffer que contiene succinato como sustrato
además de Pi (a), el oxígeno disminuye al agregar ADP (b), entrando en un estado
fosforilante, es decir, de síntesis de ATP (estado 3).

En la célula, las vías metabólicas responden a los requerimientos de energía, la

relación entre la cantidad de ADP (responsable de regular la velocidad de
funcionamiento de la cadena respiratoria) y ATP (ADP/ATP) es una forma de
expresarlo; sí existe más ADP, indica que se está consumiendo el ATP en los
procesos celulares, por lo cual las vías metabólicas que producen oxidación de las
moléculas se incrementan, con el fin de tener pares de hidrógenos que se
transportan a la cadena respiratoria para generar el gradiente electro-químico de
protones y acoplarlo a la síntesis de ATP. Estos procesos de oxido-reducción
pueden ser representados por la relación NAD+/NADH, que también indirectamente
permitirá conocer las condiciones energéticas de la célula.

En caso de agregar inhibidores de la cadena transportadora de electrones el

consumo de oxígeno se frenaría, ya que no existiría la transferencia de éstos hacía
el oxígeno.

Gráfica 1

4
ACTIVIDAD 2

2.1 En la gráfica 2 se muestra el consumo de oxígeno de la mitocondria con

diferentes sustratos e inhibidores. Coloque en los espacios correspondientes, el
probable inhibidor (letras) que se adicionó en este trazo.

Gráfica 2

Respuestas

Rotpno na/amital
A:________________

Malona to antimicing
B:________________

Cianuro
C:_________________

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 ACTIVIDAD 3

3.1 Tomando en cuenta los componentes de la cadena respiratoria, así como los
inhibidores y desacoplantes que actúan en sus componentes; complete la siguiente
tabla:

NOMBRE FUNCIÓN SITIO DE ACCIÓN

Rotenona Inhibidor Complejo
A mi tal I a hi bid or Complejo I
Antimicina A Inhibidor comp 12/03
Malonato Inhibidor COMP10j 0 2

Cia nurc Inhibidor Complejo IV

Pinitrofend Desacoplante Elimina el gradiente de H+
Oligomicing Inhibidor Fracción OSCP de ATP sintasa
Azida de sodio Inhibidor COMP1810 IV

1. ¿Cuáles son las fuentes de carbono que usa la levadura?

Las levaduras pueden utilizar diversas fuentes de carbono, siendo la glucosa la más común. También pueden utilizar
otros azúcares como la sacarosa y los carbohidratos complejos como el almidón.

2. ¿Cuáles son las vías metabólicas que catabolizan a los carbohidratos?

Los carbohidratos se catabolizan principalmente a través de dos vías metabólicas clave: la glucólisis y la respiración
celular (fosforilación oxidativa).

3. ¿En qué consisten la glucólisis y la fosforilación oxidativa?

- La glucólisis es la vía metabólica que descompone la glucosa en piruvato, generando un poco de ATP y NADH en el
proceso.
- La fosforilación oxidativa es la parte final de la respiración celular en la que se utiliza el NADH y el FADH2 para producir
una gran cantidad de ATP mediante una cadena transportadora de electrones.

4. ¿Cuáles son los productos finales del catabolismo de los carbohidratos en las levaduras?
Los productos finales del catabolismo de carbohidratos en las levaduras son principalmente dióxido de carbono (CO2) y
agua (H2O). Además, se generan ATP y calor durante el proceso.

5. ¿Cuáles son los inhibidores de los sitios I, II y III de la cadena respiratoria? Describa su efecto sobre el consumo de O2 y
la síntesis de ATP.
- Los inhibidores de la cadena respiratoria son compuestos como la rotenona (inhibidor del sitio I), el antimicina A
(inhibidor del sitio II) y el cianuro (inhibidor del sitio III). Estos bloquean diferentes puntos de la cadena de transporte de
electrones.
- Su efecto es interrumpir la transferencia de electrones en la cadena respiratoria, lo que reduce el consumo de oxígeno y
disminuye la síntesis de ATP, ya que la cadena no puede generar un gradiente protónico para impulsar la fosforilación
oxidativa.

6. ¿Cuál es el mecanismo por el cual los protonóforos desacoplan la fosforilación oxidativa? Describa su efecto sobre el
consumo de O2 y la síntesis de ATP.
- Los protonóforos son compuestos que permiten que los protones (iones H+) atraviesen la membrana mitocondrial
interna sin pasar por la ATP sintasa.
- Al desacoplar el flujo de protones de la síntesis de ATP, los protonóforos aumentan el consumo de oxígeno, ya que se
requiere más oxígeno para mantener el gradiente protónico, pero no generan ATP de manera eficiente. Esto resulta en una
disminución de la síntesis de ATP.

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 Práctica 5

Determinación de glucosa en sangre total

Objetivos

Al terminar la práctica el estudiante:

1. Describirá el metabolismo de la glucosa en sujetos sanos en diferentes

condiciones.
2. Discutirá los cambios de la glucosa y la insulina después de la ingesta de
alimentos y en condiciones de ayuno.
3. Interpretará las curvas de índice glicémico obtenidas con glucosa de
diferentes fuentes.

Es necesario para realizar las actividades propuestas revisar la introducción de la

práctica que se encuentra en el Manual de Prácticas.

ACTIVIDAD 1

1.1 Con los datos de la curva de índice glicémico que se presentan en la Tabla 1,
los estudiantes discutirán la diferencia en los valores de glucosa debida a la ingesta
de diferentes tipos de alimentos.

Tabla 1. Curva de tolerancia a la glucosa después de la ingesta de diversos alimentos.

Tiempo (minutos) Glucosa capilar (mg/dL)

0 85 80 80
Ingesta de
15 g de glucosa 15 g de sacarosa 15 g de cereal
carbohidrato
30 110 80 82
90 90 110 85
60 80 95 80

ACTIVIDAD 2

Paciente de 50 años que inició hace 6 meses consumiendo hasta 2 litros de una
bebida que le recomendaron para tener más energía; esta bebida está endulzada
con fructosa.

2.1 ¿Qué GLUT es el que ingresa la fructosa a la célula?

7
2.2 ¿Cómo se encontrará la glicemia del paciente después de ingerir medio litro de
la bebida con fructosa?; aumentada, disminuida o normal ¿Por qué?

2.3 El nivel de insulina en sangre después de 30 min de la toma de su bebida,

¿estará aumentada o disminuida? ¿Por qué?

2.4 La fructosa puede ingresar a la glucólisis en dos niveles. Mencione cuál de ellos
propicia la formación de ácidos grasos.

ACTIVIDAD 3

Paciente femenino de 14 años se presenta para realizarse exámenes de laboratorio

rutinario ya que ha notado que su cabello se ha ido adelgazando. En los estudios
de laboratorio se encontró que presentaba glucosa 9.3 mM y Hemoglobina
glucosilada 78 mM (9.3%). La paciente presenta obesidad con un índice de masa
corporal 32 kg/m2. Como antecedentes heredo familiares de importancia: los dos
padres fueron diagnosticados con diabetes tipo 2.

3.1 Con estos datos, ¿puede proponer el diagnóstico de diabetes? Explique su

respuesta.

3.2 Con base en los datos de laboratorio calcule la concentración de glucosa en

ayunas en mg/dL.

ACTIVIDAD 4
Buscar la información correspondiente a la hemoglobina glucosilada.

4.1 ¿Cuáles son los valores de normalidad?

4.2 ¿Con que temporalidad se puede valorar y por qué?