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Universidad Industrial de Santander

Faculta de Ciencias - Escuela de Biología


Biomoléculas (Cód. 25367)
Prof. Dr. William Hidalgo Bucheli

Taller de estudio # 2: Proteínas y Enzimas

1. La poliglicina, un polipéptido simple, puede formar una hélice con φ=-80°, ѱ=+150°. A partir
de la representación de Ramachandram, describa esta hélice en cuanto a
a. su lateralidad
b. su número de residuos (aminoácidos) por vuelta
2. A continuación se presenta una estructura esquemática de la subunidad de la hemeritrina
(una proteína que une el oxígeno presente en los animales invertebrados). ¿Cuál sería el
efecto de una mutación que colocase un residuo de prolina en el punto A de la estructura?
3. ¿Qué es lo que en último término determina la compleja mezcla de plegado secundario y
terciario que caracteriza a cada proteína globular?

4. Consulte el concepto de fibrillas amiloides o placas amiloides, asócielo con posibles


enfermedades (en general, animales y el ser humano) causadas por este tipo de fibrillas y
determine su relación con las proteínas denominadas “priones”.
5. ¿Qué significa que una proteína X tenga propiedades anfifílicas?
6. La siguiente secuencia es parte de una proteína globular. Utilizando la tabla (abajo) para la
predicción de secuencias secundarias y las reglas de Chou-Fasman, predecir la estructura
secundaria de esta región.
… RRPVVLMAACLRPVVFITYGDGGTYYHWYH…
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Tabla. Probabilidades relativas de la presencia de residuos de aminoácidos en diferentes


estructuras secundarias de proteínas globulares.
7. Mediante un cuadro comparativo, identifique los principales enlaces/interacciones que
gobiernan cada una de las estructuras proteicas (primaria, secundaria, terciaria, cuaternaria).
8. La hormona péptidica vasopresina se utiliza en la regulación del equilibrio hidrosalino en
muchos vertebrados. La vasopresina porcina tiene la siguiente secuencia:
Asp-Tyr-Phe-Glu-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly
a. Calcule el coeficiente de extinción molar (ɛ), en unidades de cm2/mg, para la vasopresina,
utilizando radiación con λ (longitud de onda) = 280 nm
b. Una disolución de vasopresina se coloca en una cubeta de 0.5cm de grosor. Se observa
que su absorbancia a 280 nm es de 0.75. ¿Cuál es la concentración de vasopresina, en
mg/cm3?
Nota: para la solución del ejercicio, consulte los coeficientes de extinción molar de los
aminoácidos contenidos en la vasopresina (a 280nm) y utilice la Ley de Beer-Lambert.
9. Una proteína en condiciones de composición de amortiguador, pH y temperaturas próximas a
las condiciones fisiológicas, presenta un peso molecular, mediante medidas de equilibrio de
sedimentación, de 140000 g/mol. Cuando la misma proteína se estudia por electroforesis en
gel con SDS en ausencia o presencia de agente reductor β-mercaptoetanol (BME), se observan
los patrones de las calles A y B, respectivamente. La Calle C contiene estándares de peso
molecular indicado. A partir de estos datos, describa la proteína nativa, en términos de:
a. Tipo de subunidades presentes
b. Estequiometría de las subunidades
c. Tipos de enlace (covalente, no covalente) que existen entre las subunidades.
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10. ¿Cuáles son las propiedades de las enzimas que las convierten en catalizadores especialmente
útiles?
11. ¿Qué necesita una apoenzima para ser holoenzima?
12. ¿Cuál es el mecanismo fundamental por el que las enzimas aumentan la velocidad de las
reacciones químicas?
13. ¿Cuáles son las características más importantes del centro activo de la enzima? De una breve
explicación de cada una.
14. Investigue y explique la diferencia entre las reacciones secuenciales y las reacciones de doble
desplazamiento para las enzimas.
15. ¿Qué es una enzima alostérica? Explique la cinética de este tipo de enzima.
16. Realice un cuadro sinóptico entre las diferentes estrategias que utiliza la célula para controlar
y/o regular el metabolismo.
17. La hidrólisis de sacarosa a glucosa y fructosa es muy lenta en ausencia de un catalizador.
𝑆𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 + 𝐻2 𝑂 → 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 + 𝐹𝑟𝑢𝑐𝑡𝑢𝑜𝑠𝑎
Si la concentración inicial de sacarosa es de 0,050 M, se requieren 440 años para que la
concentración de la sacarosa disminuya a la mitad a 0,025 M. ¿Cuál es la velocidad de
desaparición de la sacarosa en ausencia de un catalizador?
18. Si está presente un catalizador, la hidrolisis de sacarosa (problema anterior) es mucho más
rápida. Si la concentración inicial de sacarosa es de 0,050 M, se requieren 6.9x10-5 s para que
la concentración disminuya a la mitad, a 0,025 M. ¿Cuál es la velocidad de desaparición de la
sacarosa en presencia de un catalizador?
19. La enzima anhidrasa carbónica es una de las más rápidas conocidas. Cataliza la hidratación del
dióxido de carbono para formar bicarbonato y un ion hidrogeno:
𝐶𝑂2 + 𝐻2 𝑂 ⇌ 𝐻 + + 𝐻𝐶𝑂3−
El sitio activo de la enzima contiene un ion zinc que se coordina con el anillo imidazol (que se
abrevia “In” en la figura) de tres residuos histidina. (Un cuarto residuo histidina se localiza en
las cercanías y participan en la catálisis). Una cuarta posición de coordinación está ocupada
por una molécula de agua. Escriba el mecanismo de reacción (se muestra el primer paso) de
la hidratación del dióxido de carbono y muestre la regeneración de la enzima.
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20. Considere la siguiente reacción:

Piruvato + ADP + Pi → Acetaldehído + CO2 + ATP

Utilizando los siguientes datos, determine el orden de la reacción para cada sustrato y el orden
global de la reacción.

Experimento [Piruvato]* [ADP] [Pi] [Velocidad]


1 0.1 0.1 0.1 8x10-4
2 0.2 0.1 0.1 1.6x10-3
3 0.2 0.2 0.1 3.2x10-3
4 0.1 0.1 0.2 3.2x10-3
*Las concentraciones están en moles por litro. Las velocidades enzimáticas están medidas en
moles por litro por segundo.

21. Considere los siguientes datos para una reacción de hidrólisis catalizada por una enzima por el
inhibidor “I”:

[Sustrato] (M) V (µm/min) Vi (µm/min)


6x10-6 20.8 4.2
1x10-5 29 5.8
-5
2x10 45 9
6x10-5 67.6 13.6
1.8x10-4 87 16.2

Utilizando una representación de Michaelis-Menten, determine la Km de la reacción sin inhibir


y de la reacción inhibida.

22. Utilizando los datos de la pregunta anterior:


a. genere una representación de Lineweaver-Burk de los datos
b. Explique el significado de (*) la intersección horizontal, (**) la intersección vertical, (***) la
pendiente
c. ¿Qué tipo de inhibición se está midiendo?
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23. ¿cuáles son los dos tipos de inhibidores enzimáticos? Dé un ejemplo de cada uno

24. Se han realizado dos experimentos con la enzima ribonucleasa. En el experimento 1 se midió
el efecto del incremento de la concentración de sustrato sobre la velocidad de reacción. En el
experimento 2, las mezclas de reacción fueron idénticas a las del experimento 1 excepto la
adición de 0.1 mg de un compuesto desconocido a cada tubo. Represente los datos de
acuerdo con el método de Lineweaver-Burk. Determine el efecto del compuesto desconocido
sobre la actividad enzimática (la concentración de sustrato se mide en milimoles por litro. La
velocidad se mide por el cambio de densidad óptica por hora).
Experimento 1 Experimento 2
[S] v [S] v
0.5 0.81 0.5 0.42
0.67 0.95 0.67 0.53
1 1.25 1 0.71
2 1.61 2 1.08

25. La alcohol deshidrogenasa se inhibe por numerosos alcoholes. Utilizando los datos de la tabla
siguiente, calcule los valores de Kcat/Km para cada uno de los alcoholes. ¿Cuál de los alcoholes
de la lista metaboliza más fácilmente la enzima alcohol deshidrogenasa?

Parámetros cinéticos para la ADHde testículo de hámster


Sustrato Km (µM) Kcat (min-1)
Etanol 960 480
1-butanol 440 450
1-hexanol 69 182
12-hidroxi-dodecanoato 50 146
todo-trans-retinol 20 78
Alcohol bencílico 410 82
2-butanol 250000 25
ciclohexanol 31000 122

26. La anhidrasa carbónica es fuertemente inhibida por acetazolamida, el cual es usado como un
diurético (es decir, incrementar la producción de orina) y para disminuir la excesiva presión
sanguínea en los ojos (debido a la acumulación del fluido intraocular) en glaucoma. La
anhidrasa carbónica juega un papel importante en esos y otros procesos de secreción, puesto
que ésta participa en la regulación de la concentración de bicarbonato y en el pH de varios
fluidos biológicos. La curva experimental de la velocidad de reacción inicial (como % Vmax)
versus [sustrato] para la reacción de anhidrasa carbónica se ilustra en la figura de abajo.
Cuando el experimento es repetido en presencia de acetoazolamida, la curva inferior (indicada
en azul) es obtenida. De acuerdo a los resultados y su conocimiento de las propiedades de
inhibidores enzimáticos, determine la naturaleza de la inhibición por acetoazolamida.
Justifique.
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27. El sildenafilo (Viagra), es un fármaco utilizado para tratar la disfunción eréctil y la hipertensión arterial
pulmonar. Actúa como un inhibidor potente y selectivo de la fosfodiesterasa tipo 5 (PDE5) específica
de GMP cíclico (GMPc), una enzima que promueve la degradación del GMPc en GMP. Esto conduce a
una respuesta biológica prolongada por parte del GMPc (puesto que no puede ser convertido a GMP)
ocasionando relajación del músculo liso del cuerpo cavernoso, mediante vasodilatación de las arterias
helicinas del interior del pene, permitiendo así un incremento del flujo de sangre en el interior del pene
y ocasionando la erección. Ballard, S. y colaboradores, estudiaron el tipo de inhibición enzimático
causado por el viagra sobre la enzima PDE5 y los resultados fueron publicados en el Journal of Urology
en 1998. En la gráfica de Lineweaver-Burk (indicada abajo), se muestran los resultados obtenidos
respecto a la actividad enzimática de PDE5 a diferentes concentraciones del inhibidor, sildenafilo. Con
base en ella, determine el tipo de inhibición causada por el viagra (competitivo, acompetitivo o no-
competitivo) y además, JUSTIFIQUE brevemente su respuesta.

28. La fosfocreatina (PC), también denominada creatina fosfato, sirve como una fuente disponible
de grupos fosforilo para la rápida síntesis de ATP desde ADP, principalmente en el músculo
esquelético (figura, Paso 3). La enzima Creatina Quinasa cataliza la reacción reversible:
Creatina-fosfato  Creatina + fosfato ΔG°´= -43 kJ/mol
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ESQUEMA: Creatina fosfato y su rol


durante el almacenamiento de energía
en el músculo esquelético.

Paso 1: Síntesis de Creatina fosfato en la


mitocondria.

Paso 2: Eflujo de Creatina fosfato


sintetizada desde la mitocondria hacía
el sarcoplasma (citoplasma células
musculares)

Paso 3: Síntesis de ATP a partir de la


hidrólisis de Creatina-fosfato.

Paso 4: Reciclaje de Creatina por la


mitocondria.

Según el esquema, la energía liberada durante la hidrólisis de un mol de Creatina-fosfato


(ΔG°´= -43 kJ/mol) es suficiente para dirigir la síntesis de un mol de ATP (ΔG°´= +30.5 kJ/mol),
siendo la reacción global de tipo exergónico (ΔG°´global= -12.5 kJ/mol); en estas circunstancias,
el ATP sintetizado es utilizado rápidamente durante la contracción muscular para abastecer los
requerimientos energéticos. Con base en lo anterior y de acuerdo al esquema,
a) Escriba la ecuación química global correspondiente a la reacción descrita en el Paso 1.
b) ¿Cuál sería el cambio de energía libre estándar (ΔG°´global) para la reacción anterior?
c) De acuerdo con el ítem b, la reacción química que conduce a la síntesis de creatina fosfato,
es un proceso desfavorable a condiciones estándar. En contraste, bajo condiciones
celulares, está es una reacción exergónica y por tanto, termodinámicamente favorable.
Teniendo en cuenta que en la célula muscular, cuya temperatura es 37°C, las
concentraciones de cada componente de la reacción global corresponden a:
[Creatina-fosfato]=30 mM; [ATP]=3 mM y [ADP]=0.78 mM.
¿Cuál deberá ser la concentración de Creatina (expresado en Molaridad) en la célula, para
que ΔG´reacción sea igual a -1.0 kJ/mol? (reacción termodinámicamente favorable)

29. Una glutaminasa de hepatocito hidroliza distintas concentraciones de glutamina, en presencia


o ausencia de un inhibidor, obteniéndose los siguientes resultados:

[Sustrato], [mM] 0,2 0,4 0,8 1,6 3,2


V Sin inhibidor 1,67 2,86 4,44 6,15 7,62
(mmol/min) [I]= 1,5 mM 0,63 1,18 2,11 3,48 5,16

Calcular/Determinar:
a. El tipo de inhibición existente (competitivo, no competitivo, acompetitivo)
b. El valor de los correspondientes parámetros cinéticos: Km, Kmapp, Vmáx, Vmáxapp. Utilice el
método de doble recíproco o el análisis de Eadie Hofstee.
c. Si la concentración de la enzima equivale a 0,5 µM, determine el número de recambio (TON).
Según lo anterior, ¿cuántas moléculas de producto se forman en 80 segundos? Suponga el
sistema sin inhibidor.