BOMBEO DE PROTONES EN LEVADURAS Y SUS PROCESOS INHIBITORIOS

Lasprilla Ruiz Leidy Daniela a, Vidal Lina Estefaníab

Naniz_10ruiz@hotmail.com a, lina.estafania.vidal@icesi.edu.co b
Universidad ICESI, Facultad de Ciencias Naturales, Programa de Biología.
28 de abril del 2018
Laboratorio de bioquímica
Santiago de Cali

1. RESULTADOS:

1.1 Procedimiento Experimental

Para el desarrollo de la práctica de bombeo de protones en levaduras y sus
procesos inhibitorios se siguieron los pasos descritos en la guía de laboratorio.

1.11 Datos:

En el vaso de control (1) se añadió 5ml de levadura al 20%, y 40 ml de agua

destilada la cual tiene una coloración beige. En el vaso de DNP (2) se añadió 5ml
de levadura al 20%, 40 ml de agua destilada y 0,2 ml de DNP 0.8mM el cual torna
a un color amarillo y por último en el vaso de Azida (3) se añadió 5ml de levadura
al 20%, 40ml de agua destilada y 0.5ml de solución azida 800Mm la cual se
mantiene con un color beige. Se tomo el pH de estas soluciones en los tiempos 0,
5 y 10 minutos, al completar los 10 minutos se procedió a agregar glucosa dentro
de las tres soluciones y se tomó el pH de estas soluciones en los tiempos de 5, 10.
20, 30 y 40 minutos. Los resultados colectados de muestran a continuación
Tabla 1: Valores de PH obtenidos con los reactivos iniciales (suspensión de
levadura, agua destilada, DNP y Azida).

Tiempo (min) PH (control) PH (DNP) PH (Azida)

0 5,73 5,68 5,84
5 5,60 5,60 5,85
10 5,68 5,70 6,00
Tabla 2: Valores de PH obtenidos después de la Adición de la Solución de
glucosa al 10%

Tiempo (min) PH (Control) PH (DNP) PH (Azida)

5 5.38 5,27 5,80
10 5,20 5,16 5,80
20 5,13 5,03 5,80
30 5,06 4,99 5,81
40 4,98 4,88 5,70

Gráfica 1. pH en función del tiempo antes de adicionar glucosa a la

suspensión de levadura.

Gráfica 2. pH en función del tiempo después de adicionar glucosa a la

suspensión de levadura
 2. ANALISIS DE RESULTADOS:

En la práctica de laboratorio se observó el efecto de los agentes desacoplantes e

inhibidores sobre la bomba de protones en levaduras y como el consumo de la
glucosa reflejado en el cambio de Ph.
La levadura es un hongo de tipo unicelular estos son importantes en el proceso de
descomposición de toda materia orgánica bajo el uso del proceso conocido como
fermentación.1
Las levaduras poseen un gradiente electroquímico para el transporte de solutos
intracelular; este gradiente es un sistema de bombeo de iones H + hacia el interior
de la membrana mitocondrial (matriz), puesto que hay una mayor concentración
afuera (espacio intermembranal) y por eso el pH es 1.4 veces más ácido.
Las levaduras generan este gradiente gracias a las ATPasas de la membrana que
utilizan la energía liberada por la hidrolisis del ATP para bombear los protones al
exterior de la célula; esta enzima permite el transporte intracelular de nutrientes.
Las levaduras también poseen una bomba de protones en la membrana interna de
la mitocondria, donde la ATP sintasa cataliza la síntesis de ATP a partir de ADP y
ortofosfato2

Esquema 1 Formación de ATP.

Esta enzima grande y complejo está compuesta por dos partes principales, f 0 y f1.
La subunidad f0 está insertada en la membrana interna mitocondrial y la subunidad
f1 se proyecta hacía la matriz mitocondrial y posee la actividad catalítica de la
sintasa.

Esquema 2 ATP sintasa

La subunidad f1 está formada por cinco tipos de cadenas polipeptídicas, α3, β3, γ,
δ, ε. Las subunidades α y β se disponen en formación alterna en un anillo
hexamérico, y son miembros de la familia NTPasas de bucle P; únicamente las
subunidades β participan en la catálisis. La proteína γ y ε son el tallo de las
subunidades α y β.
La subunidad f0 es un segmento hidrofóbico y contiene el canal de protones del
complejo, este canal, está formado por un anillo que contiene entre 10 y 14
subunidades c, pero sólo una de estas se una a la periferia del anillo.
Por lo tanto, las subunidades f0 y f1 están conectadas mediante el tallo γ y ε, y
mediante una columna externa que está formada por la subunidad a, 2
subunidades b y la subunidad δ.
El ATP formado no abandona el centro catalítico a menos que exista un flujo de
protones, a través de la enzima, por lo tanto, el papel del gradiente de protones no
es la formación de ATP sino la liberación de la sintasa. Esta enzima tiene tres
centros activos y está compuesta de una parte móvil (el anillo c y el tallo γ y ε) y
uno estacionario (el resto de la molécula), entonces en los centros activos ocurren
tres pasos secuenciales: (1) unión de ADP y Pi, (2) síntesis de ATP y (3) liberación
de ATP.
El desacoplamiento del transporte electrónico de la síntesis de ATP (c) ocurre por
el íntimo acoplamiento entre el transporte electrónico y la fosforilación oxidativa.
Los agentes desacoplantes como el DNP (2-4 dinitrofenol), 1, no afectan e incluso
aceleran el transporte de electrones, sin embargo, impiden la formación de ATP.
Estos agentes dislocan (desacoplan) el sistema fosforilante del sistema
respiratorio, puesto que, no se detiene el proceso, pero se impide la comunicación
entre procesos que ocurren al mismo tiempo, síntesis de ATP y creación del
gradiente químico y electroquímico, que impulsa la ATPasa según la teoría
quimiosmótica2.
 (1)
En presencia del DNP el transporte de electrones desde el NADH al O 2 procede
de forma normal pero no se da la síntesis de ATP mediante la ATP sintasa
mitocondrial porque la fuerza protón-motriz que se establece a través de la
membrana interna mitocondrial se disipa continuamente3. El movimiento de
protones se da a favor del gradiente y como en la matriz es menor la
concentración de protones van a fluir hacia esta zona desde el espacio
intermembranal. El pH inicial fue de 5,68 y aumentó a 5,70 en la intermembrana
mitocondrial por lo que disminuyo la concentración de protones (de 2.08 x 10 -6 a
1.99 x 10-6) lo que evidencia que hubo un movimiento a favor de gradiente. Sin
embargo, la variación del pH con respecto al tiempo fue pausada, lo que nos
indica que el movimiento de protones se fue deteniendo.
Todo esto aumenta el consumo de oxígeno y de la oxidación de NADH por lo tanto
cuando se consume accidentalmente desacoplantes o se adicionan y a su vez se
agregan combustibles metabólicos (glucosa) no se almacena energía en forma de
ATP sino que se libera calor. Es importante saber que el DNP se encuentra en
herbicidas y fungicidas. Por esto muchas veces las personas consumen el DNP
como suplemento dietario y perder peso.
En esta práctica se usó un pHmetro que contiene un sensor para medir el pH en
una disolución. Este tiene junto con electrodos, el voltímetro que será sumergido
en la sustancia haciendo que genere una corriente eléctrica, es así como la
concentración de iones de hidrógenos presenta en la solución la corriente
eléctrica. Esto se da por medio de la membrana de vidrio que tiene el pH metro la
cual obtiene la sensibilidad y selectividad de las dos soluciones de concentración.
Se debe tener cuidado en el manejo: antes de cada medición se debe verificar que
la membrana de vidrio esté limpia (limpiarse con agua desmineralizada y
desionizada) y para evitar daños en el electrodo debe mantenerse húmedo, pero
se debe limpiar el exceso de agua con papel.4

Ilustración 1 PHmetro
Los inhibidores de la cadena de transportadores de electrones (a) son agentes
que impiden que se genere un bombeo de protones, actúan como oxidantes o
reductores al aceptar o liberar electrones en la cadena transportadora, capturando
la energía que es necesaria para el transporte de protones y al quitarle esta
energía se impide la formación del gradiente de concentración 5.
Existen varios tipos de inhibidores tales como la rotenona, que se usa como un
veneno para peces e insectos y el amital que es un sedante barbitúrico, son
obtenidos de las plantas, y bloquean la cadena de transporte electrónico en la
NADH-Q oxidorreductasa (complejo proteico I) y por esto impiden la utilización de
NADH como sustrato.3 y 6
La antimicina A es un antibiótico producido por Streptomyces griseous que ha sido
usado como veneno para controlar algunas especies de peces, esta interfiere en
el flujo de electrones desde el citocromo bH en el complejo III (Q-citocromo c
oxidorreductasa).6
Otro inhibidor es el cianuro (CN-) que trabaja de igual forma que la azida. La azida
funciona como un inhibidor de la cadena transportadora de electrones porque
puede bloquear el flujo de electrones en el citocromo c oxidasa. La azida y el
cianuro reaccionan con la forma férrica del hemo a 3, mientras que el monóxido de
carbono inhibe la forma ferrosa, por lo tanto, no hay síntesis de ATP (no pudo
producirse protón-motriz).
Por lo tanto al analizar el comportamiento del inhibidor azida usado en la práctica
deberíamos esperar no encontrar la formación de un gradiente (igualar la
concentración de protones dentro de la matriz y en el espacio intermembranal de
la mitocondria) lo que generaría que disminuyera la concentración de H + en el
espacio intermembranal para que fluyan hacia la matriz y esta aumente su
concentración de protones. Según la gráfica 1 el pH pasó de 5,84 a 6,00 lo que
indica que la concentración de H+ aumentó en el espacio intermembranal (1.44 x
10-6 a 1 x 10-6) lo que evidencia que no continuó formando un gradiente de
protones.
Al añadir glucosa a esta solución con azida el pH tiende a mantenerse constante,
puesto que, la azida se enlaza a algunos grupos proteícos que forman complejos
en la cadena transportadora de electrones, impidiendo su capacidad de cambiar
reversiblemente de forma oxidada a reducida, por lo cual no habrá libación de
energía, lo que conlleva a que las bombas de protones no funcionen y por ende no
haya síntesis de ATP, por lo cual es de esperarse que haya una variación muy
mínima en el pH6, como sucedió en nuestros resultados de la práctica.
La glucosa es un monosacárido de 6 carbonos, más simple e importante en el
metabolismo del ser humano, es fuente de energía para plantas y animales; su
grupo carbonilo libre le permite oxidarse, reacción que es muy importante en el
metabolismo del ser humano, puesto que, éste compuesto al oxidarse produce
energía que es utilizada por las células3
Esquema 3 Estructura química de la glucosa

la formación de ATP en la glicólisis y en el ciclo de Krebs a partir de glucosa es

conocida con certeza porque está determinado por la estequiometria de las
reacciones presentadas en dichos casos.

Esquema 4 ciclo de krebs

Sin embargo en la fosforilación oxidativa las estequiometrias de los procesos de

bombeo de protones, síntesis de ATP y transporte de metabolitos no siempre
corresponden a números enteros. Como se mencionó antes la síntesis de una
molécula de ATP en la levadura está dada por aproximadamente 3.333 protones a
través de la ATPasa pero hay que tener en cuenta que se consume un protón
adicional en el transporte del ATP de la matriz al citoplasma.
Con la generación de un gradiente de iones se puede calcular la energía total que
se debe diferenciar de la energía libre estándar (∆G°’) que está relacionada con el
incremento de energía libre a pH 7 en cambio (∆G) es la energía libre total. Es
importante saber que ∆G°’= -30,5 kJ/mol en la hidrólisis de ATP.3
El ciclo del ácido cítrico tiene lugar en las mitocondrias y su objetivo es generar
NADH y FADH2 mediante la oxidación del acetil-coA. En la fosforilación oxidativa,
que ocurre también en las mitocondrias se utiliza el NADH y el FADH2 para
reducir el oxígeno molecular a agua y posteriormente producir ATP por medio de
la ATP sintasa. La reducción del oxígeno molecular por NADH y FADH2 es un
proceso muy exergónico que se realiza mediante una serie de reacciones de
transferencia de electrones, que tiene lugar en un conjunto de proteínas de
membrana conocida como cadena respiratoria3
El acoplamiento entre el transporte electrónico y la fosforilación oxidativa en las
mitocondrias se puede desacoplar mediante el 2,4-dinitrofenol y otros compuestos
ácidos aromáticos. Estas sustancias transportan protones a través de la
membrana mitocondrial, a favor de su gradiente de concentración 3.
En presencia de estos desacoplantes, el transporte de electrones desde el NADH
al O2 procede de forma normal, pero no se forma ATP mediante la ATP sintasa
mitocondrial por que la fuerza protón- motriz que se establece a través de la
membrana interna mitocondrial se disipa continuamente. Esta pérdida del control
respiratorio provoca un aumento del consumo de O2 y de la oxidación del NADH.
De hecho, durante la ingestión accidental de desacoplantes se consumen grandes
cantidades de combustible metabólico, pero no se almacena energía en forma de
ATP. En cambio, la energía se libera en forma de calor. El DNP es el componente
activo en algunos herbicidas y fungicidas3.
En el mundo hay gente que consume DNP como un fármaco para perder peso, a
pesar de que la FDA prohibió su uso en 1938. También hay informes de que a los
soldados soviéticos se les suministraba DNP para mantener su temperatura
durante los largos inviernos rusos.

3. CONCLUSIONES:
● Los cambios en el pH están relacionados con la generación de protones.
Esto se evidencia ya que, durante la práctica, en el momento en el que se
generó altas concentraciones de H+ en el medio, este presentaba una
disminución en el pH y por el contrario a bajas concentraciones de estos
protones en el medio, este aumentaba su pH, estableciendo de esta
manera una relación inversamente proporcional.
● Los agentes desacoplantes bloquean la síntesis de ATP por medio del
transporte de protones a través de la membrana interna mitocondrial
disipando el gradiente electroquímico de protones que no requiere la
síntesis de ATP.
● El gradiente de protones no es el encargado de sintetizar el ATP, sino que
genera la rotación de un complejo proteico que este a su vez genera una
secuencia de procesos para sinterizar el ATP
● La cuantificación de la producción de ATP en la fosforilación oxidativa
depende de más factores aparte de la estequiometria de las reacciones
netas.

4. REFERENCIAS:

1. Stryer, L., Berg, J. M., & Tymoczko, J. L. (2012). Bioquímica con

aplicaciones clínicas. Barcelona: REVERTÉ
2. PEÑA Antonio, ARROYO Ángel, GÓMEZ Armando, TAPIA Ricardo,
GÓMEZ Carmen. 2000. Bioquímica. Segunda edición. JGH editores
3. STRAYER, et. 2013. Bioquímica. Séptima edición. Reverte
4. Instrumentos del laboratorio. Buscando ¿Qué es un pHmetro? [en línea].
[Citado 30 de Abril, 2018] Disponible en:
http://instrumentosdelaboratorio.org/phmetro
5. Seres modélicos. Buscando levadura [en línea]. [citado 30 de abril.,
2018] Disponible en: http://seresmodelicos.csic.es/llevat.html.
Universidad Autónoma de Chiapas. Buscando bombeo de protones [en
línea].
6. Bioquímica. Buscando inhibidores de la cadena de transporte de
electrones [en línea]. [Citado 30 de Abril, 2018] Disponible en:
https://temasdebioquimica.wordpress.com/2008/11/23/inhibidores-de-la-
cadena-de-transporte-de-electrones/