DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS: REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

(PCR)
TEMARIO
➢ Fundamento de la PCR
➢ Pasos previos a la PCR
➢ Pasos posteriores a la PCR
➢ Variantes de la PCR
➢ Aplicaciones de la PCR

PCR: REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

➢ Técnica molecular que permite amplificar más de mil millones de veces un ADN (gen o fragmento
de ADN) in vitro, obtenido a partir de una región seleccionada de un genoma, «purificando» de
forma eficiente este ADN del ADN genómico restante (puede ser mezcla compleja de ADNs)
➢ Reacción en cadena de la polimerasa descrita por el Dr. Kary Mullis en 1984
➢ Es in vitro y lo que se hace es que en un laboratorio se lleva a cabo esta reacción con un tubito
que es muy pequeño de tamaño 2 cm
➢ De un pedazo grande se selecciona uno pequeño utilizando componentes o reactivos que se
llaman partidores
➢ Es imprescindible conocer las secuencias nucleotídicas que flanquean el gen o fragmento del
ADN de interés para poder tener lo que son los primers

COMPONENTES O REACTIVOS DE LA PCR: REPLICACIÓN DEL ADN IN VITRO

➢ En los dibujos vemos los distintos componentes, estos se mezclan todos en el tubo PCR, el tubo
no tiene una altura mayor a 2 cm, luego ese tubo se cierra cuando esta toda la mezcla, se inserta
en el equipo que se llama termociclador y dentro del equipo se llevan a cabo los ciclos de la PCR
➢ Cada ciclo consta de 3 etapas → denaturacion, annealing y extensión

Yandary Leyton
 ENZIMAS ADN POLIMERASAS
➢ Se llaman así porque lo que hacen es leer un templado que es de ADN para generar otra hebra
nueva de ADN
➢ La enzima Taq polimerasa fue aislada de la bacteria Thermus aquaticus en 1976, es la mas
utilizada
➢ Esta bacteria vive en ambientes con altas temperaturas, las enzimas que se extraen de ella son
termoestables, es decir, son activas a 95°C pero su óptimo es 72°C, esto quiere decir que su
actividad más alta será a 72°C
➢ Hoy en día, hay diversas enzimas que difieren entre sí por estabilidad, fidelidad, corrección de
errores (5´-3´; 3´-5´), procesividad → mientras más características tenga la enzima, mas cara
será y va a trabajar de mejor manera
➢ La fidelidad tiene que ver con que por ejemplo, si la ADN polimerasa ve que en el templado hay
una adenina esa es capaz de efectivamente colocar una timina que es su nucleótido que es
complementario, si ve una adenina y coloca una citocina que no es complementario, se dice que
esa enzima tiene una menor fidelidad
➢ ¿Cuándo es importante que una enzima tenga mejor fidelidad?
• Cuando se está investigando una mutación de un solo nucleótido
➢ La corrección de errores tiene que ver con que la enzima va avanzando y leyendo el templado
de ADN y es capaz de “mirar hacia atrás” si puso realmente el nucleótido complementario, si lee
y puso el nucleótido incorrecto, la misma enzima es capaz de sacarlo y colocar el nuevo
nucleótido que va a ser el que efectivamente es complementario
➢ La procesividad tiene que ver con la cantidad de nucleótidos que pone por ejemplo por segundo
una enzima
➢ En la imagen vemos que cada enzima tiene distintas características que van a depender del
objetivo de la investigación

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 CRECIMIENTO DE LA CADENA NUCLEOTÍDICA
➢ La enzima ADN polimerasa cataliza la elongación del ADN mediante la adición de nucleótidos
trifosfatos al extremo 3´OH de la cadena en elongación
➢ La ADN polimeraza lo que hace es unirse a un sitio donde haya un extremo 3’ OH
➢ En el dibujo de la izquierda vemos que dice ADN templado, hebra de ADN templado, entonces
esa es la hebra que esta a partir de la cual esta copiando la ADN polimerasa y esta copia arriba
de eso, entonces ahí va insertando el nucleótido que sea complementario
➢ Solo se va a unir la ADN polimerasa si hay un extraño 3’OH
➢ Entonces lo que hace es insertar un nucleótido nuevo, en este caso es una timina porque esta
leyendo en la hebra templado que hay una adenina, luego va a colocar el nucleótido tri fosfato,
va a cortar arriba (en donde esta la flecha celeste) y va a eliminar estos 2 fosfatos que se llaman
pirofosfatos y ahora va a unir el fosfato que queda restante con el 3’OH del nucleótido adyacente
y como resultado (ver imagen derecha) va a quedar como insertado este nucleótido de timina
que es complementario a la adenina y va a quedar unido por el enlace fosfodiéster
➢ Como quedo un extremo nuevo 3’ OH, la enzima va a traer su sustrato (nucleótidos) que seria
una guanina por lo que se tendría que insertar una citocina, va a eliminar los 2 fosfatos y va a
quedar insertado un nuevo nucleótido

PARTIDORES, INICIADORES, PRIMERS O CEBADORES

➢ Los partidores delimitan el segmento de ADN a amplificar
➢ Los vamos a encontrar con los nombres de partidores, iniciadores, cebadores o en inglés que
dice primers y todos esos nombres los podemos encontrar en los artículos científicos o en algún
protocolo
➢ En la imagen, arriba tenemos un ADN templado que es muy largo porque es el genoma completo
de cualquier microorganismo, luego este fragmento por un fenómeno que se llama denaturación
se rompe en ADN templados y significa que es el ADN molde, es decir, es el ADN a partir del
cual la ADN polimerasa va a copiar

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 ➢ ¿Qué es lo que va a determinar que segmento especifico de todo el genoma completo va a
amplificar? → son los partidores, en la imagen los tenemos en color rojo
➢ Entonces en todo el genoma con el uso de partidores se puede delimitar el segmento, entonces
con el fenómeno de denaturación se rompen los puentes de hidrogeno, se abre la hebra, siempre
se utiliza un mínimo de 2 partidores si es una PCR convencional, en este caso se utilizan 2 por
lo que se va a unir un primers a un segmento de una hebra y el otro primers se va a unir a otro
segmento de otra hebra
➢ Siempre se unen de manera complementaria y de esa manera va a quedar delimitado que de
todo el genoma solo se va a amplificar ese segmento
➢ Los partidores son oligonucleótidos de un tamaño que es variable (20 a 25 nucleótidos) y luego
se unen los partidores y ahora cada uno de ellos va a otorgar el 3’ÓH en donde se va a unir la
ADN polimerasa (verde), se une en el segmento y va a ir insertando los sustratos que son los
nucleótidos de manera complementaria
➢ Siempre la hebra avanza en el sentido 5’ a 3’ que es la dirección en donde va insertando los
nucleótidos
➢ Amplicon → es el resultado de la PCR y en este caso es de 46 pares de bases (la cuenta de los
nucleótidos)

COMPONENTES O REACTIVOS DE LA PCR

➢ Enzima ADN polimerasa → 1 – 2,5 U
➢ Partidores (forward y reverse o sentido y antisentido) → 0,1- 0,5 µM
➢ Solución amortiguadora (buffer o tampón) → Tris-HCl pH 8,8, KCl, MgCl2 , iones amonio, BSA
➢ Desoxinucleótidos (dNTP´s) → dATP, dGTP, dCTP y dTTP (20 a 200 µM) → es el sustrato de la
enzima y son los componentes del ADN
➢ Agua libre de nucleasas (degrada el ADN) (estéril)
➢ Opcional → sales KCl 50 mM

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 ➢ En la figura esta siendo amplificado un tubo de PCR donde estan
mezclados los distintos componentes, ADN templado que es lo que va
a utilizar la ADN polimerasa para poder copiar el segmento que se le
pide con los primers, los primers van a delimitar que segmento se va a
amplificar, luego se agregan también los nucleótidos para que se
pueda generar la nueva hebra con la ADN polimerasa que va letendo
el templado y va insertando estos nucleótidos de manera
complementaria en la hebra nueva
➢ Catión divalente (MgCl2 ) → cloruro de magnesio
• Cofactor de la ADN polimerasa (0,5 a 2,5 mM), la concentración afecta la incorporación de
dNTP, actividad de polimerasa y Tm cebador-molde
• Si este cofactor no esta presente, la ADN polimerasa no puede ejercer su función
➢ DNA templado:
• Homogenizados, extractos crudos de tejidos, sangre, mucosa, orina, heces, líquido
cefalorraquídeo, ADN y ARN extraídos, mezclas de ADN obtenidos con enzimas de
restricción, entre otros, (se necesitan cantidades mínimas de DNA, picogramos es suficiente
10 pg-1µg)

ADYUVANTES DE LA PCR
➢ Son elementos que mejoran el rendimiento y la especificidad de la PCR, son opcionales.
➢ Ayudan a que el ADN este más accesible a la polimerasa ya que eliminan estructuras
secundarias.
➢ El DMSO mejora la separación de la hebra en regiones ricas en G-C. Por lo general se utiliza al
5 % concentración final. 10
➢ El BSA incrementa la eficiencia de la PCR y actúa como una proteína captadora de iones que
pueden ser inhibidores de la Taq polimerasa. También impide que las enzimas se adhieran a los
tubos de reacción y las superficies con punta. Por lo general se utiliza en concentraciones por
encima de 0,8 µg/µl.

GABINETE PARA PCR

➢ Se utiliza luz UV para descontaminar
➢ Con cubículos que van encima de un mesón y están completamente cerrados y tienen una puerta
la cual se alza y es ahí donde la persona o investigador puede hacer la mezcla de los
componentes
➢ Es super importante que se realice en
los cubículos para evitar la
contaminación, la idea es que todo el
material que se utilice incluyendo las
micropipetas solo se maneje dentro
del cubículo y nunca se saque
➢ El personal debe estar capacitado, el
uso del delantal es obligatorio y los
guantes también ya que las manos
están llenas de enzimas como las
nucleasas que degradan el ADN

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 TERMOCICLADORES
➢ Número de pocillos variables 48-96
➢ Equipos en los cuales se lleva a cabo la reacción de PCR
➢ Programables → 1 hora y media aprox se demora
➢ Termocicladores simples
➢ Termocicladores en gradiente (permiten estandarizar de manera más rápida la técnica)
➢ El ADN templado jamás se mezcla dentro del gabinete

PCR: REPLICACIÓN DEL ADN IN VITRO

➢ Este proceso es el que ocurre en el tubo cuando esta dentro del termociclador
➢ El promedio es de 30 – 40 ciclos
➢ Denaturación
• Se rompen los puentes de hidrogeno
• La hebra que era doble se separa
• Esta denaturación se logra al llevar el ADN a una temperatura de 94 – 98°C
➢ Almacenamiento
• Esto ocurre a 50 – 60°C, es decir, el equipo de termociclador baja la temperatura porque a
esa T° se pueden unir los primers
• El tiempo es variable pero generalmente se utilizan 30 segundos
➢ Extensión
• El termociclador eleva la T° a 72°C porque es la temperatura optima a la cual va a realizar su
actividad la polimerasa que proviene de un organismo que es Thermos aquaticos
• A esta T° aun permanecen unidos los primers al ADN templado, este primers va a otorgar el
extremo 3’OH en ambas hebras y es aquí donde se va a unir la ADN polimerasa y va a
empezar a elongar, va a empezar a sintetizar la nueva hebra

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 ETAPA TEMPERATURA FUNDAMENTO
Separación de las hebras de ADN
DESNATURALIZACIÓN 94°C – 98°C Elimina estructuras secundarias
Tiempo depende de contenido de GC (30 – 45 s)
Hibridación de los partidores a sitios específicos del templado
ALINEAMIENTO 50°C – 65°C La temperatura depende de la TM de los partidores
Tiempo variable (30 – 60 s)
Síntesis de ADN sentido 5’- 3’
La temperatura depende de la T° optima de la Taq ADN polimerasa utilizada
EXTENSIÓN 72°C
Tiempo de extensión depende del tamaño del amplicon (fragmento de ADN
amplificado, en general 1kb por minuto)

EL NÚMERO DE COPIAS DE ADN DELIMITADO POR LOS PARTIDORES AUMENTA DE

MANERA EXPONENCIAL
➢ Ciclos sucesivos de amplificación doblan la cantidad del ADN sintetizado de manera que se
acumula exponencialmente el segmento de interés en 2 n , en donde n corresponde al número
de ciclos realizados
➢ En la imagen tenemos el tubo en donde se agregaron todos los componentes de la PCR, ¿Qué
ocurre con una única molécula de ADN? Una molécula de ADN es de doble hebra, lo que va a
ocurrir en el primer ciclo será la denaturación, alineamiento en donde se unen los primers,
extensión por parte del ADN polimerasa y como resultado de eso van a haber 2 hebras de ADN
en el primer ciclo
➢ Luego esto se va repitiendo y por ejemplo en un segundo ciclo van a haber 4 hebras y así
exponencialmente

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 PASOS PREVIOS A LA REALIZACIÓN DE LA PCR
EXTRACCIÓN DE ADN
➢ Métodos de extracción del ADN: ebullición (se calienta la muestra a 100°C por 10 min, las células
se rompen para poder exponer el ADN), chelex, fenol cloroformo, entre otros, generalmente se
utilizan kits de extracción
➢ Etapas en la extracción de ADN: (excepto el de ebullición)
• Lisis de las células o virus → sales caotrópicas, detergente como el SDS es necesaria a
menudo para eliminar las membranas.
• Degradación de la fracción proteica asociada al ADN → adición de una proteasa. La fracción
proteica puede precipitarse con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato
sódico
• Purificación del ADN → precipitación del ADN (etanol frío o isopropanol). Lavado del pellet (se
realiza con alcohol frío volviendo a centrifugarse). Recuperación (el sedimento se puede
resuspender en agua o tampón Tris tras ser secado completamente)
➢ La confirmación de la presencia de ADN se
lleva a cabo mediante electroforesis en un
gel de agarosa y posterior tinción con red gel
y observación con luz UV o directamente al
espectrofotómetro mediante espectro de
absorción de 260-280 nm
➢ El ADN es almacenado a -20 °C
➢ Método fenol – cloroformo
• Puede ser toxico
• Se separa el ADN por fases y lleva
bastante tiempo
➢ Utilización de kit comerciales
• Utiliza membranas
• El que se va a utilizar depende de la investigación y el presupuesto
• En la imagen tenemos en la primera parte una muestra de sangre, lo
que se hace en la primera etapa es la lisis de la célula, se rompe esta
célula para que el ADN ahora quede en suspensión
• Luego se agrega en la columna la cual tiene una membrana de sílice
donde se unen las hebras de ADN
• Van a quedar unidas y se van haciendo procesos de lavados
sacando todas las otras cosas que pueden interferir
• Se va centrifugando para separar, se van cambiando los tubos de
abajo y finalmente se hace una etapa de dilución en donde se coloca
un buffer que es EDTA y ahora el ADN que esta unido a la membrana
de silice utilizando específicamente la solución de EDTA o a veces
puede ser solo agua pero mejora el rendimiento si se utiliza un buffer
• Ahora ese ADN va a quedar en el tubo final y esa membrana se
descarta y va a quedar el ADN purificado el cual puede durar años si
se guarda a -20°C

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 CUANTIFICACIÓN DE ADN
➢ En esta etapa se evalúa la pureza del ADN
➢ El ADN purificado se puede cuantificar con un espectrofluorímetro mediante el uso de fluoróforos
específicos Ej: Picogreen®, Molecular Probes (fluorometría), en el nano espectrofotómetro se
utilizan unidades muy pequeñas
➢ Espectrofotómetro mediante espectro de absorción de 260-280 nm:
• Una absorbancia de 1 unidad a 260 nm corresponde a 50 µg de ADN por ml A260 = 1 ⇒ 50
µg/ml
• Pureza de ADN: proporción A260/A280, ADN puro tiene una proporción de ≈ 1.8- 2.0, con el
A260 se leen los nucleótidos (se lee cuando ADN y ARN hay) y con el A280 se miden los
aminoácidos

PASOS POSTERIORES A LA REALIZACIÓN DE LA PCR

ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS DE PCR

➢ La detección del producto de la PCR se realiza mediante electroforesis
➢ Dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución deseada, se utilizarán diferentes
medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones
➢ Se utiliza buffer TAE 1x o TBE 1x para preparar la agarosa y como buffer de corrida
➢ Marcador de tamaño molecular: tamaños conocidos: 50pb, 100pb, 1Kb
➢ La posterior visualización se puede realizar con sybr safe, safeview o redgel en un
transiluminador UV
➢ La manera de visualizar si hubo resultados positivos o negativos es a través de una electroforesis
de agarosa
➢ En la imagen lo que se hace es utilizar los moldes, se agrega la agarosa y se insertar esos
peines, es igual que una peineta, en cada uno de ellos el gel de agarosa va a dejar como un
pocillo o un espacio, la agarosa es como la gelatina pero sin color
➢ En los pocillos se agregan las muestras de los tubos que se utilizaron en la PCR, luego se
conecta a una fuente de poner generando un campo eléctrico por lo que el ADN va a migrar ya
que esta cargado negativamente por lo que ira al polo positivo, después de 30 a 40 min se lleva
al equipo que se llama trans iluminador para visualizar el ADN, para hacerlo se le agrega unos
agentes (como gel) los cuales se unen al ADN y al estar expuestos a luz UV muestran un color
que índice el resultado

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 VERIFICACIÓN DEL PRODUCTO FINAL DE UNA PCR EN UN GEL DE AGAROSA
➢ Con un gel de agarosa de 0,7% se obtiene una buena separación (resolución) de grandes
fragmentos de ADN (5–10 kb) y con uno de 2% se resuelven mejor los fragmentos pequeños
(0,2–1 kb). El porcentaje estándar es de 1%
➢ La imagen corresponde a un gel de agarosa
➢ M → corresponde a los pocillos en donde se cargó la muestra
➢ Se coloco en el electroforesis y las muestras migraron/avanzaron porque la agarosa es un
polímero y hace unas redes y a través de esto el ADN va avanzando
➢ Mientras menor es el tamaño del ADN mas migra porque le es mas fácil pasar por que agarra
una mayor velocidad que los fragmentos mas grandes
➢ Las columnas (M – 11) se llaman carriles
➢ En el carril M se cargo una muestra que se llama marcador de tamaño molecular
➢ Se hizo la PCR y se obtuvieron los distintos amplicones, mientras más intensa sea la banda
significa que hay una mayor cantidad de ADN, y mientras mas tenue, hay una menor cantidad
➢ En la imagen el carril del 1 al 4 tiene un tamaño aprox <200 bp

LADDER O MARCADOR DE TAMAÑO MOLECULAR

➢ Se utilizan para estimar el tamaño molecular de los productos de PCR
➢ Existen otros como 50 pb o distintos tamaños moleculares y cantidad de bandas
➢ Dentro del tubo hay una mezcla de distintos tamaños de pares de bases (pb)

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 USO DE CONTROLES EN LA PCR
➢ Control positivo
• Se debe utilizar un ADN que contenga la secuencia blanco, sea este ADN genómico o
plasmidial.
➢ Control negativo
• Utilizar cualquier templado que carece de la secuencia blanco como control negativo.
➢ Blanco de reacción
• Contiene todos los reactivos de la PCR excepto el templado, sirve para evaluar contaminación
durante el procedimiento
➢ En la foto tenemos M que corresponde al Ladder, en el carril 3 tenemos el positivo ya que si
aparece una banda es porque hay ADN, en el carril 4 tenemos el negativo ya que no hay nada

RESUMEN: PASOS PREVIOS Y POSTERIORES A UNA PCR

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 VENTAJAS Y LIMITACIONES DE LA PCR
➢ Ventajas:
• Alta sensibilidad y especificidad
• Requiere poca muestra (templado)
• Técnica simple, rápida
• Automatización
➢ Limitaciones:
• Información de la secuencia
• Sensibilidad a los inhibidores
• Contaminación

CONTROL DE LA CONTAMINACIÓN
➢ Buenas prácticas de laboratorio
➢ Movimiento unidireccional (no transportar elementos de post a pre PCR)
➢ Uso de elementos específicos para cada área
➢ Uso de tips o puntas con filtro
➢ Evitar el uso de baños de agua o de hielo

VARIACIONES DE LA PCR
➢ PCR múltiple:
• Permite la amplificación simultánea de más de una secuencia de interés en una reacción con
más de un par de partidores.
• Ej. Detección de distintos microorganismos en una misma muestra
• Agrega varios partidores en una misma reacción
➢ PCR en tiempo real:
• Permite cuantificar el ADN en cada ciclo, no necesita gel de agarosa para ver productos de
PCR
• El equipo trabaja con un software en donde se ven las curvas, si pasa el umbral es positiva
➢ rt-PCR:
• Utiliza transcriptasa reversa. A partir de ARN se sintetiza ADN complementario (ADNc), éste
último se utiliza como templado en la PCR
• Lee ARN para generar ADN
• Los resultados corren en un gen de agarosa
➢ PCR nested o anidado:
• El producto de una amplificación es utilizado
como molde para realizar una segunda
amplificación con partidores que se ubican
dentro de la primera secuencia amplificada,
utiliza 2 pares de partidores y es altamente
específico
• En azul tenemos los primers

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 APLICACIONES DE LA PCR
➢ Medicina:
• Diagnóstico de enfermedades infecciosas y hereditarias (mutaciones en genes)
• Diagnóstico genético pre-implantación
• Diagnóstico microbiológico de patógenos tradicionalmente difíciles de cultivar
• Genotipificación de polimorfismos
➢ Investigación:
• Huella genética
• Aislamiento de genes
• Secuenciación
• Mutagénesis
• Estudios de manipulación y expresión de genes
• Estudios de genómica comparativa
• Análisis de pedigree
➢ Medicina forense:
• Determinación de paternidad
• Criminalística

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