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El arte del cultivo de células animales para el aislamiento del virus

1. Introducción
En virología, el cultivo celular generalmente se refiere al crecimiento in vitro y
manipulación de células de un tejido obtenido de un organismo multicelular. El
término "cultivo celular" a menudo se usa indistintamente con "cultivo de tejidos". El
cultivo celular permanece integral con la virología, ya que los virus son parásitos
intracelulares obligados que requieren replicación dentro de una célula viva para
producir copias de sí mismos (es decir, para formar viriones de progenie). Tanto las
células animales como las vegetales se propagan en cultivos celulares. Las únicas
otras alternativas prácticas al cultivo celular son propagar los virus en huéspedes
animales o vegetales susceptibles. Esta revisión cubre solo el cultivo celular para
virus animales. Dado que el significado literal del cultivo de tejidos es el cultivo de
piezas de tejido, es decir, cultivo de explantes, el término "cultivo celular" se utiliza
en esta revisión en lugar de "cultivo de tejidos".
Los cultivos celulares pueden prepararse a partir de células unicelulares (p. Ej.,
Glóbulos blancos) o de un trozo de "tejido". Definimos el tejido como un agregado
de células similares que forman un tipo definido de material estructural con una
función específica en un organismo multicelular. Los tejidos primero se disocian en
pedazos más pequeños por interrupción mecánica (como cortar en pedazos más
pequeños con tijeras). A continuación, las piezas de tejido se someten a tratamiento
con agentes que interrumpen la matriz extracelular que mantiene unidas las células.
Los agentes de disociación celular generalmente son enzimas proteolíticas como la
colagenasa y la tripsina (para digerir proteínas) en combinación con quelantes de
cationes como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) que unen o quelan el Ca
2+.y otros cationes divalentes de los que depende la adhesión célula-célula. Luego,
las células se separan suavemente, se suspenden en medio de crecimiento celular
y se colocan en vasos de crecimiento estériles. En el pasado, se usaban botellas de
vidrio o placas de Petri. De hecho, en el contexto de la virología, el término " in
vitro"Originalmente se refería a células cultivadas" en vidrio "; Este término se usó
para contrastar los experimentos llevados a cabo en células cultivadas en
recipientes de vidrio en lugar de los experimentos con organismos vivos. Hoy en
día, los vasos de poliestireno (plástico) se usan con mayor frecuencia para el cultivo
celular. La mayoría del cultivo celular todavía se realiza utilizando técnicas en las
que las células crecen en dos dimensiones. Hay nuevas tecnologías disponibles
que permiten el crecimiento celular en tres dimensiones; utilizando tales técnicas,
ha sido capaz de inducir a algunas células a diferenciarse en formas que no se
observan durante el crecimiento bidimensional. Dicha tecnología todavía es
relativamente nueva en el campo de la virología, y no se discute en esta revisión.
Dado que los tejidos generalmente están compuestos de diferentes tipos de células,
una población heterogénea de células generalmente se aísla durante el primer
intento ("primario") de aislar las células para el cultivo celular. Por lo tanto, se
realizan esfuerzos posteriores para separar las células en varios tipos, con el
objetivo de obtener poblaciones de células homogéneas. La uniformidad genética
de un lote de células puede lograrse a través de un proceso denominado
"clonación", en el que una célula se aísla y se deja proliferar para formar una
"colonia" o "clon". Todas las células de una colonia derivan de un ancestro común
y, por lo tanto, son "clones" entre sí.
Las células obtenidas de los tejidos tienden a ser "adherentes", lo que significa que
se adhieren a la superficie de crecimiento (del matraz u otro recipiente) y luego se
extienden para formar una monocapa. Por otro lado, los glóbulos blancos se
asientan pero no se adhieren, y se mantienen como cultivos en "suspensión". Como
tal, generalmente son agitados constantemente por un imán giratorio en un tipo de
vaso de crecimiento denominado "matraz giratorio". Las células adherentes que
crecen como monocapas planas son generalmente de dos tipos: fibroblastos y
epiteliales. Los fibroblastos son las células más comunes del tejido conectivo y
sintetizan colágeno y la matriz extracelular. Las células epiteliales recubren las
cavidades y superficies de las estructuras en todo el cuerpo, y también forman
muchas glándulas. En la cultura, tienden a parecer rectangulares y se amontonan
en monocapas apretadas que parecen "pavimentos de ladrillo".
El arte del cultivo celular para el aislamiento del virus ha entrado en un renacimiento
en los últimos años. Se han realizado mejoras significativas en la calidad de los
reactivos disponibles, material plástico y en metodologías básicas. Por ejemplo, los
platicware desechables han suplantado en gran medida el uso de recipientes de
vidrio. Esto ha reducido los costos de cultivar células de muchas maneras: (a) las
botellas de vidrio no tienen que ser lavadas y esterilizadas entre usos, (b) el material
plástico de cultivo celular se puede comprar listo para usar con recubrimientos de
superficie de crecimiento o "tratamientos" electrostáticos que promueve la unión
celular a la superficie de crecimiento, (c) el material plástico es inherentemente más
seguro ya que es relativamente inastillable. Otros artículos de plástico desechables
estériles han reducido significativamente las cargas de trabajo. Por ejemplo, las
pipetas desechables han hecho obsoleta la tarea de lavar las pipetas de vidrio, y las
tareas posteriores necesarias para prepararlos para el trabajo de virología. En el
pasado, tales tareas requerían el uso de detergentes múltiples y lavados ácidos, lo
que creaba riesgos biológicos y químicos potenciales, y requería grandes
cantidades de agua destilada. Además de las mejoras en los materiales utilizados
para el trabajo de virología, hay muchos instrumentos nuevos disponibles que
simplifican la tecnología de cultivo celular y al mismo tiempo mejoran la precisión
entre experimentos. Por ejemplo, ahora hay disponibles varios contadores de
células que hacen que el conteo de células sea fácil y reproducible de manera intra
e interlaboratorio. Además, varias líneas celulares nuevas o de ingeniería y células
primarias están disponibles para la propagación de virus que alguna vez se
consideraron muy difíciles de estudiar. que creaba riesgos biológicos y químicos
potenciales y requería grandes cantidades de agua destilada. Además de las
mejoras en los materiales utilizados para el trabajo de virología, hay muchos
instrumentos nuevos disponibles que simplifican la tecnología de cultivo celular y al
mismo tiempo mejoran la precisión entre experimentos. Por ejemplo, ahora hay
disponibles varios contadores de células que hacen que el conteo de células sea
fácil y reproducible de manera intra e interlaboratorio. Además, varias líneas
celulares nuevas o de ingeniería y células primarias están disponibles para la
propagación de virus que alguna vez se consideraron muy difíciles de estudiar. que
creaba riesgos biológicos y químicos potenciales y requería grandes cantidades de
agua destilada. Además de las mejoras en los materiales utilizados para el trabajo
de virología, hay muchos instrumentos nuevos disponibles que simplifican la
tecnología de cultivo celular y al mismo tiempo mejoran la precisión entre
experimentos. Por ejemplo, ahora hay disponibles varios contadores de células que
hacen que el conteo de células sea fácil y reproducible de manera intra e
interlaboratorio. Además, varias líneas celulares nuevas o de ingeniería y células
primarias están disponibles para la propagación de virus que alguna vez se
consideraron muy difíciles de estudiar. Hay muchos instrumentos nuevos
disponibles que simplifican la tecnología de cultivo celular y al mismo tiempo
mejoran la precisión entre experimentos. Por ejemplo, ahora hay disponibles varios
contadores de células que hacen que el conteo de células sea fácil y reproducible
de manera intra e interlaboratorio. Además, varias líneas celulares nuevas o de
ingeniería y células primarias están disponibles para la propagación de virus que
alguna vez se consideraron muy difíciles de estudiar. Hay muchos instrumentos
nuevos disponibles que simplifican la tecnología de cultivo celular y al mismo tiempo
mejoran la precisión entre experimentos. Por ejemplo, ahora hay disponibles varios
contadores de células que hacen que el conteo de células sea fácil y reproducible
de manera intra e interlaboratorio. Además, varias líneas celulares nuevas o de
ingeniería y células primarias están disponibles para la propagación de virus que
alguna vez se consideraron muy difíciles de estudiar.in vitro . Desafortunadamente,
junto con las mejoras materiales y el progreso tecnológico, generalmente se pone
menos énfasis en enseñar el arte del cultivo celular en comparación con la
tecnología molecular relevante para la detección de virus. Esta es una receta para
el desastre, ya que el cultivo celular no es un proceso simple ni irreflexivo.
Parafraseando declaraciones recientes de un colega, "Todas las células cultivadas
in vitroestán enojados; están fuera de su entorno normal y se mantienen en
condiciones artificiales, rodeados de concentraciones fisiológicamente incorrectas
de todas las cosas importantes para su bienestar. ¡No es de extrañar que sea tan
difícil tener cultivos celulares con buen comportamiento ”! Sin entrenamiento y
preparación adecuados, el cultivo celular como arte y ciencia se vuelve descuidado,
y los datos generados por tales prácticas son cuestionables. A menudo no hemos
podido repetir los resultados de otros, y ellos no han podido repetir los nuestros,
debido a una diferencia en las células utilizadas en nuestros experimentos. En
algunos casos, las células no son lo que deberían ser, en otros casos, las células
están contaminadas con agentes adventicios que confunden los resultados y, a
veces, las células han cambiado, ya sea por diferenciación o inestabilidad genética.
Debido a la cantidad de disciplinas diferentes que ahora se dedican al cultivo celular,
la terminología utilizada para describir el trabajo varía sustancialmente. Esto dificulta
la comunicación efectiva utilizando un lenguaje destacado para la virología. Para
esta revisión, ocho términos clave utilizados para el trabajo de cultivo celular y sus
definiciones se presentan en la Tabla 1 . Las definiciones que figuran en la Tabla 1
son de la Sociedad de Biología In Vitro (SIVB), como en la referencia [ 1 ].
Recomendamos encarecidamente la adaptación de la terminología SIVB para las
comunicaciones entre laboratorios del trabajo de cultivo celular. Sus definiciones
están bien pensadas y son intuitivamente comprensibles.
En este capítulo, proporcionamos una revisión de algunos problemas
contemporáneos del cultivo celular relevantes para el aislamiento del virus. Se
proporcionan algunas pautas prácticas para el aislamiento de virus y el
mantenimiento de líneas celulares. La información que presentamos debe
proporcionar información útil para los virólogos, y puede ser una revisión útil de
algunos principios olvidados del aislamiento del virus. Esta revisión no pretende ser
exhaustiva, ya que cada tema requeriría un tratamiento sustancial y detallado,
histórico y contemporáneo. Cabe señalar que los términos "cepa celular" y "línea
celular" ( Tabla 1 ) a veces se usan indistintamente por otros autores. Otros también
definen "cepa celular" como un cultivo de un solo tipo de célula, y "línea celular"
como un cultivo inmortalizado de un solo tipo de célula.
2. Validación básica de células animales utilizadas para el aislamiento de
virus.
Las líneas celulares o cultivos celulares primarios derivados de vertebrados e
invertebrados se utilizan para el aislamiento de virus animales. Las líneas celulares
de animales se pueden comprar de proveedores bien conocidos, incluidos los que
figuran en la Tabla 2 , y las células primarias de proveedores como los que figuran
en la Tabla 3 . Alternativamente, se pueden establecer cultivos celulares primarios
de novo a partir de células, tejidos u órganos de animales vivos. Las células para el
trabajo de virología también se pueden obtener de colecciones universitarias o de
laboratorios individuales. En general, la mejor práctica es obtener células al nivel de
duplicación de población más bajo posible ( Tabla 1) de proveedores acreditados
que pueden proporcionar documentación relevante para la trazabilidad. Un
problema que encontramos repetidamente es que la mayoría de los laboratorios de
investigación académica carecen totalmente o no tienen un adecuado "Sistema de
calidad" o proceso de "Prácticas de calidad", y la trazabilidad es problemática. Por
ejemplo, ha sido casi imposible estimar el nivel de duplicación de la población ("edad
real del cultivo") de las células obtenidas de la mayoría de los laboratorios de
investigación debido a inconsistencias no solo en el mantenimiento de registros sino
también debido a la falta de estandarización de las prácticas. El principal problema
encontrado con las células que han sido altamente pasadas es que su fenotipo
puede ser bastante diferente de sus progenitores. Esto a menudo dificulta la
reproducción de experimentos realizados en años anteriores utilizando las células.
Tabla 1 Términos clave del cultivo celular.
Tabla 2. Fuentes de líneas celulares animales para virología.

Tabla 3. Lista parcial de proveedores de cultivos celulares primarios.

Mientras que la terminología difiere entre laboratorios y en diferentes países,


muchos virólogos usan terminología acuñada por el ATCC y se refieren a células
continuas (previamente denominadas "establecidas") como CCL (líneas celulares
certificadas), CRL (líneas de depósito certificadas), HB ( Hibridomas), TIB (líneas
celulares en bancos de inmunología tumoral) y HTB (líneas celulares en bancos de
células tumorales). En general, las células designadas como CCL por el ATCC son
las más caracterizadas y han sido certificadas por el Comité de Colección de
Cultivos Celulares Americanos de los Institutos Nacionales de la Salud [ 2 ].
Antes de su uso para el aislamiento o detección de virus, las células deben ser
"validadas" para su propósito previsto. Un lote válido de células implica que se han
probado y confirmado que son adecuadas para el aislamiento o la detección del
virus objetivo. Se deben hacer y responder tres preguntas generales durante el
proceso de validación:
¿Se ha confirmado la autenticidad (son las células lo que deberían ser)?
¿Las células se comportan como se esperaba antes de usarlas?
Cuando la tarea es el aislamiento (o propagación) de virus: ¿un virus de tipo salvaje
similar al virus objetivo infectará efectivamente las células, se replicará en ellas y
formará viriones de progenie? Si la tarea es la detección de virus: ¿un virus de tipo
salvaje similar al virus objetivo infectará efectivamente las células y formará un
producto codificado por virus que puede detectarse por inmunoquímica, PCR u otros
métodos relevantes?
Idealmente, cada laboratorio tendría la capacidad de "caracterizar" completamente
cada línea celular antes de su uso para el aislamiento del virus. Nominalmente, esto
incluiría algún tipo de autenticación de especies de células hospedadoras,
verificación de que las células están libres de contaminantes microbianos,
confirmación del fenotipo celular y la cinética de crecimiento, y lo más importante,
las células deben analizarse utilizando un aislado de tipo salvaje contemporáneo
del virus que está dirigido a la detección o al aislamiento. En la práctica, la
autenticación celular interna no suele ser rentable ni práctica para laboratorios de
diagnóstico pequeños. Para el trabajo de rutina / virología general, hemos
encontrado que las siguientes prácticas son útiles para la validación de las células
para el aislamiento del virus:
Obtenga células de una fuente o laboratorio de buena reputación: los recursos como
el ATCC proporcionan un certificado que detalla la autenticidad y que las células no
están contaminadas con micoplasma, bacterias u hongos. Además, las líneas
celulares obtenidas del ATCC se confirman actualmente para la identidad de la
especie utilizando un ensayo de PCR de la subunidad I del citocromo C (COI) y el
perfil de repetición en tándem corto (STR) [ 3 ], un método de perfil de ADN basado
en PCR para la identificación intraespecies. Se debe prestar especial atención a las
células obtenidas a través de la transferencia entre laboratorios, ya que muchas
están contaminadas de forma cruzada con diferentes células o se han identificado
erróneamente [ 4 ]. Nuestra experiencia es que a menudo también están
contaminados con agentes adventicios.
Use un proveedor de pago por servicio para verificar la identidad de la celda.
Mientras que no necesariamente respaldamos ninguno, en la Tabla 4 se dan
ejemplos de proveedores de servicios comerciales que autentican células animales.
Muchas universidades también tienen excelentes servicios de autenticación celular.

Tabla 4. Lista parcial de proveedores de servicios de identificación celular.


Observe la morfología celular a densidades celulares bajas y altas, y verifique que
se ajusten a las expectativas. Las formas celulares aberrantes pueden indicar que
se obtuvieron las células incorrectas o que las células están contaminadas con
micoplasma u otros agentes infecciosos.
Verifique que las células no tengan micoplasma. Hemos obtenido células
contaminadas con micoplasma incluso en los laboratorios más prestigiosos; en un
caso, se contaminaron 15/20 líneas celulares de cáncer y, tras un análisis genético,
se descubrieron cinco especies diferentes de micoplasmas en las células. Cada
laboratorio debe tener una prueba de micoplasma, adecuada para la detección de
una amplia variedad de micoplasmas, de los cuales hay más de 100 especies. Se
han descrito muchas pruebas de PCR para micoplasma, y varios kits están
disponibles comercialmente. Por experiencia hemos descubierto que las pruebas
de PCR deben evaluarse cuidadosamente, ya que muchas de las pruebas más
antiguas no detectan algunas de las especies de micoplasma descubiertas más
recientemente. En concierto con la PCR, se recomienda el aislamiento de
micoplasma como segunda prueba, especialmente si las pruebas de PCR no se han
actualizado. Recomendamos específicamente cultivar células durante un mínimo de
dos semanas en ausencia de antibióticos antes de realizar las pruebas de
micoplasma, ya que algunas especies de micoplasma son inhibidas pero no
destruidas por los antibióticos agregados a los medios de crecimiento celular. Sin
embargo, es una buena práctica aislar cualquier línea celular entrante y tratarla
automáticamente como si contuviera micoplasma mediante la incorporación de
plasmocina en el medio de crecimiento. Algunas de las otras pruebas no basadas
en PCR para micoplasma incluyen la detección de organismos vivos mediante el
método de cultivo de Barile [ para aislar cualquier línea celular entrante y tratarla
automáticamente como si contuviera micoplasma mediante la incorporación de
plasmocina en el medio de crecimiento. Algunas de las otras pruebas no basadas
en PCR para micoplasma incluyen la detección de organismos vivos mediante el
método de cultivo de Barile [ para aislar cualquier línea celular entrante y tratarla
automáticamente como si contuviera micoplasma mediante la incorporación de
plasmocina en el medio de crecimiento. Algunas de las otras pruebas no basadas
en PCR para micoplasma incluyen la detección de organismos vivos mediante el
método de cultivo de Barile [5 ], tinción de cultivos celulares con tinte fluorescente
Hoeschst 33258 [ 6 ] y uso de PlasmoTest (InvivoGen), que es un ensayo basado
en células. PlasmoTest se realiza utilizando células HEK-Blue ™ -2, que son células
HEK293 que están diseñadas con múltiples genes de la vía del receptor tipo Toll2
(TLR2). En presencia de micoplasma, las células HEK-Blue-2 secretan fosfatasa
alcalina embrionaria, que luego reacciona con un sustrato específico en los medios
celulares para producir un color azul.
Además de las instalaciones de pruebas universitarias, los proveedores de servicios
también pueden realizar pruebas de micoplasma. Mientras que no necesariamente
respaldamos ninguno, en la Tabla 5 se enumeran ejemplos de proveedores de
servicios que realizan pruebas de micoplasma :
Tabla 5. Lista parcial de servicios de prueba de micoplasma
Evaluar las células para la contaminación con agentes distintos de micoplasma [ 7
]. Muchas veces, los laboratorios suponen que los contaminantes bacterianos son
fáciles de detectar a través del color del tinte indicador de pH en el medio de
crecimiento. En particular, muchas formulaciones de medios de crecimiento
incorporan rojo fenol, y se utiliza una conversión rápida de rojo a amarillo como
evidencia de la presencia de contaminación bacteriana. Mientras que lo primero es
a menudo cierto para las bacterias que son fermentadores o anaerobios facultativos,
debe tenerse en cuenta que los aerobios obligados tienden a hacer que los medios
sean más básicos. Además, algunos contaminantes bacterianos se pierden durante
la inspección superficial por microscopía porque no son móviles, se replican
lentamente y a menudo están presentes unidos a las superficies de las células
cultivadas. Hemos encontrado Propionibacterium acnes(que es un anaerobio
aerotolerante), varias especies de actinomicetos y anaerobios gram positivos y
negativos en cultivos celulares contaminados. A menudo, las bacterias son
resistentes a los antibióticos comúnmente utilizados para el cultivo celular y, lo que
es peor, algunas son resistentes a múltiples fármacos y casi imposibles de erradicar.
Como paso final de validación, verifique que las células sean adecuadas para el
virus objetivo. Esto es especialmente cierto para las líneas celulares de cáncer, que
son cariotípicamente anormales o genéticamente inestables. Siempre que sea
posible, examinamos la susceptibilidad de las células a una versión contemporánea
de tipo salvaje del virus objetivo, así como a una cepa de laboratorio conocida del
mismo virus que sirve como estándar de referencia. Esta comparación se realiza
porque los virus tienden a mutar y, en el proceso, la afinidad por el receptor celular
particular puede cambiar. Además, la cantidad de receptores celulares en la célula
puede cambiar, y esto puede afectar la avidez del virus por su receptor.
3. Complicaciones derivadas del uso de células primarias para el aislamiento
del virus.
Las células primarias ( Tabla 1 ), que son células no inmortalizadas tomadas
directamente de un organismo vivo, a menudo se usan en laboratorios clínicos para
el aislamiento de varios virus. Por ejemplo, las células primarias de riñón de mono,
que en los EE. UU. Se obtienen de rhesus u otros macacos o de varias especies de
monos "verdes" africanos, se usan para el aislamiento del eco y otros virus picorna,
y parainfluenza humana y otros paramixovirus. Las células primarias son
especialmente útiles para el diagnóstico virológico porque algunos virus son más
fáciles de aislar (o solo pueden aislarse) en ellas. Sin embargo, las células primarias
a menudo albergan virus latentes que se reactivan una vez que las células se
separan de los riñones y se propagan in vitro.o contienen virus que producen una
infección persistente pero subclínica del huésped. Los últimos virus pueden no
causar una patología significativa (si la hay) in vivo , donde las células existen en un
entorno con un sistema inmune funcional. Pero fuera del huésped y lejos del sistema
inmune, las células pueden ser totalmente permisivas y el mismo virus causa
efectos altamente citopáticos (CPE). Desafortunadamente, algunas células
primarias también pueden albergar virus que pueden replicarse en las células
huésped sin causar CPE fácilmente reconocible, y también en las células
indicadoras utilizadas para su aislamiento (o detección) in vitro . Los virus no
deseados en las células primarias causan diversas complicaciones relevantes para
el aislamiento de un virus objetivo, que incluyen:
Podrían adelantar rápidamente a un cultivo celular, reduciendo las posibilidades de
aislar el virus objetivo.
Pueden causar CPE idéntico a los del virus objetivo, lo que provoca una evaluación
preliminar falsamente positiva.

Son fuentes obvias de contaminación que complican el aislamiento del virus objetivo
en forma "pura".
Pueden presentar un riesgo de bioseguridad para los trabajadores de laboratorio.
Cabe destacar que las células primarias pueden albergar agentes contaminantes
distintos de los virus. Por ejemplo, las especies de micoplasmas están presentes en
la mayoría de los animales y prevalecen en las superficies del tracto respiratorio.
Además, las especies de micoplasma existen como variedades intracelulares y
extracelulares. Por razones que aún no están del todo claras, los riñones son
"santuarios" para los virus. Por esta razón, a menudo buscamos nuevos virus en las
células renales procedentes de especies exóticas (J. Lednicky, inédito).
Algunos de los agentes adventicios que hemos encontrado en las células primarias
incluyen:

• Citomegalovirus humano en células renales humanas


• Virus de la coriomeningitis linfocítica en células renales de ratón
• Poliomavirus murino en los riñones de ratones de una colonia de roedores
de la universidad
• Virus de parainfluenza 5 (anteriormente virus Simian 5) en células renales de
mono rhesus
• Citomegalovirus de simio en células renales de simio (varias especies)
• Retrovirus espumoso de simio en células de riñón de mono verde y rhesus

Las células primarias también tienen una vida útil finita, y deben usarse con pases
mínimos in vitro. De lo contrario, la senescencia de las células puede confundirse
con CPE causada por virus. Varios proveedores comerciales actualmente
proporcionan células primarias de diversos tejidos y especies. Estas células deben
usarse juiciosamente para la propagación o aislamiento de virus. Un error común
es suponer que las células primarias obtenidas de los proveedores están
certificadas como libres de virus. En realidad, este no es el caso. Por ejemplo, los
donantes de células humanas primarias vendidas en los EE. UU. Se examinan (por
serología) en busca de anticuerpos contra los virus de la hepatitis B y C y contra el
VIH, siguiendo las pautas de la Administración de Drogas y Alimentos de los
Estados Unidos (USFDA), y si esa información no es disponible, las celdasson
verificados por PCR u otros métodos para los mismos virus. [La USFDA es una
agencia del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos
responsable de proteger y promover la salud pública a través de la regulación y
supervisión de productos biofarmacéuticos, transfusiones de sangre, cosméticos,
suplementos dietéticos, dispositivos emisores de radiación electromagnética
(ERED), seguridad alimentaria, dispositivos médicos, medicamentos de venta libre
(medicamentos), productos de tabaco, medicamentos recetados, vacunas y
productos veterinarios]. Sin embargo, la USFDA no ha ordenado pruebas
adicionales para otros agentes adventicios, y puede ser poco práctico verificar la
presencia de muchos otros agentes con respecto al costo y las razones de muestreo
representativas. Así,
El deterioro celular en las células primarias debido a la formulación inadecuada de
los medios de crecimiento celular también se puede confundir con el CPE causado
por virus. Es importante mantener controles no infectados junto con las células
utilizadas para el aislamiento del virus para la comparación. Hemos observado un
deterioro celular debido a la deficiencia de L-glutamina, y a una dosificación
inadecuada de agentes antifúngicos en los medios de crecimiento, entre algunos
lotes de células primarias compradas comercialmente. De manera similar, las
formulaciones de medios comerciales para células humanas primarias a menudo
incluyen aditivos tales como epinefrina, factor de crecimiento epidérmico
recombinante humano, hidrocortisona, insulina, transferrina y otros; un error en la
cantidad de algunas de estas biomoléculas agregadas a los medios de crecimiento
celular puede afectar negativamente la viabilidad celular.
Por lo tanto, las células primarias son útiles para el aislamiento de algunos virus,
pero deben usarse con precaución porque: (a) pueden contener agentes
adventicios, y (b) el deterioro celular debido a una de las muchas razones diferentes
puede confundirse con virus inducido CPE.

4. Suero versus medio de cultivo celular libre de suero


El suero ha sido un aditivo obligatorio en los medios de crecimiento celular durante
gran parte de la historia del cultivo de tejidos, y es esencial para el crecimiento
celular, el metabolismo y para estimular la proliferación ("efecto mitogénico"). Esto
se debe a que el suero en una mezcla compleja que proporciona (a) factores
hormonales para estimular el crecimiento y la proliferación celular y promover
funciones diferenciadas, (b) transportar proteínas que transportan hormonas (por
ejemplo, transcortina), minerales y oligoelementos y lípidos, (c) fijación y factores
de propagación, y (d) factores de estabilización y desintoxicación necesarios para
mantener el pH o para inhibir las proteasas, ya sea directamente (p. ej., el inhibidor
de la antitripsina α en suero es un inhibidor importante de la tripsina de la proteasa),
o indirectamente, actuando como un sumidero inespecífico para proteasas y otras
moléculas (tóxicas) [ 8 ].
Anteriormente, el suero humano y de caballo, recogido asépticamente mediante
venopunción, era la fuente de suero para el cultivo de tejidos. Esto fue suplantado
más tarde por suero bovino menos costoso procedente de sangre extraída de
bovinos de matadero. La sangre bovina se recolecta usando una metodología algo
cruda, la sangre coagulada, separada del suero, luego generalmente filtrada usando
filtros de 0.1 µm. Tanto el ternero como el suero fetal bovino (FBS) se usan para
medios de cultivo celular. Sin embargo, principalmente debido a su rico contenido
de factores de crecimiento y su bajo contenido de γ-globulina (anticuerpo), FBS ha
sido adoptado como el suplemento estándar de los medios de cultivo celular [ 8]
Desafortunadamente, la filtración usando filtros de poros más pequeños es
técnicamente difícil debido a la composición compleja del suero. Además, los filtros
no retienen el micoplasma y los virus; micoplasma presumiblemente debido al
pequeño tamaño y su flexibilidad inherente, y virus debido a sus pequeñas
dimensiones y, a menudo, a la naturaleza pleomórfica. Por lo tanto, el suero mismo
ha sido a menudo la fuente de micoplasma y contaminación por virus [ 9 - 14 ]. Los
virus que pueden ser contaminantes comunes de la ternera bovina o FBS incluyen:
virus de la diarrea viral bovina (BVDV) [ 15 - 19 ], poliomavirus bovino [ 20 , 21 ],
parvovirus bovino [ 22 - 24] (J. Lednicky, inédito) y virus del herpes bovino [ 25 - 28
]. La contaminación inadvertida de las células cultivadas por estos virus derivados
del suero tiene repercusiones obvias no solo con respecto a la generación de datos,
sino también porque ejerce un costo en el tiempo perdido en el desempeño del
trabajo de laboratorio y los costos de los mismos. Y generalmente ocurre que los
problemas se notan muchos meses después (en lenguaje común, los problemas
ocurren “aguas abajo”).
Siempre que sea económicamente factible, sugerimos el uso de FBS de bajo
anticuerpo irradiado con rayos gamma o suero de ternera para medios de cultivo de
tejidos. Los sueros bajos en anticuerpos son deseables para reducir las
posibilidades de neutralización de anticuerpos del virus objetivo, mejorando así las
posibilidades de aislamiento del virus.
La irradiación gamma generalmente se realiza después de la filtración, y actúa como
una protección secundaria [ 29 - 31 ]. El proceso de irradiación supuestamente
inactiva virus y microorganismos vivos con un daño mínimo a la integridad del
producto [ 32 , 33] La irradiación gamma se debe realizar utilizando un proceso
validado; ocasionalmente hemos encontrado lotes de sueros irradiados con rayos
gamma repletos de material carbonoso filamentoso que para el ojo inexperto puede
confundirse con micelios fúngicos. La presencia de material filamentoso se debe a
la degradación de la proteína resultante del manejo inadecuado durante el proceso
de irradiación gamma. Una advertencia: hemos observado que los virus de ADN
pequeños, como los parvovirus y los poliomavirus en los sueros, no se inactivan
eficazmente por irradiación gamma (Lednicky y Wyatt, observaciones no
publicadas). Observaciones similares fueron publicadas recientemente por otros [
34 , 35 ]. El conocimiento sobre la susceptibilidad de las líneas celulares a
parvovirus y poliomavirus bovinos es relativamente escaso.

Otra consideración importante al comprar suero de ternera o FBS es el nivel de


endotoxina [ 36 ]. El fracaso de algunos intentos de cultivo celular a veces puede
rastrearse hasta el nivel de endotoxina en los sueros. Cuando se le presenta la
opción, siempre es mejor comprar sueros con los niveles de endotoxina más bajos
posibles. Los estándares industriales para el suero vendido actualmente especifican
<10.0 EU / ml, donde 1 EU / ml ~ 0.1 ng / ml (EU = unidad de endotoxina). La
endotoxina se detecta mediante el ensayo de lisado de amebocitos de limulus, que
puede detectar hasta 0,01 EU / ml.
Los riesgos asociados con el uso de componentes de origen animal en el medio de
cultivo han llevado a la búsqueda de medios de crecimiento celular libres de
proteínas y animales. Hasta la fecha, se han adaptado varias líneas celulares para
crecer en medios sin suero. Y numerosas formulaciones definidas de medios libres
de suero están disponibles para algunas de las líneas celulares comúnmente
utilizadas para el aislamiento del virus, como para la línea celular de riñón de mono
verde africano denominada Vero y para las células Madin Darby Canine Kidney
(MDCK). El uso de medios de crecimiento celular sin suero se ha validado para el
aislamiento o la propagación de muchos virus [ 37], incluidos los utilizados para las
vacunas. Como ejemplo, un virus quimérico de parainfluenza tipo 3 - virus sincitial
respiratorio se propagó a títulos 100 veces más altos en células Vero cultivadas en
medios de crecimiento de células libres de suero de lo que podría lograrse con una
formulación de medios que contiene suero [ 38 ]. Las células Vero cultivadas en
medios sin suero se han utilizado para la producción de reovirus [ 39 ]. Las células
MDCK cultivadas en medios sin suero se usaron para la producción del virus
Influenza H5N1 usado como vacuna [ 40 ]. El virus de la rabia utilizado para la
producción de vacunas creció a títulos más altos en células Vero en suero libre que
en medio de crecimiento celular que contiene suero [ 41 ].
Por lo tanto, los medios libres de suero deben considerarse para aplicaciones de
virología que impliquen la propagación de virus de rutina o la producción de virus de
vacuna. Menos explorado es el uso de medios libres de suero para el aislamiento
de virus de muestras clínicas. Hasta la fecha, muchos laboratorios no han
experimentado con esta opción, probablemente porque muchas formulaciones de
medios sin suero se usan sin la adición de antibióticos y antifúngicos, o con su uso
en 1/5 a 1/10 de las concentraciones que normalmente se usarían. en medios que
contienen suero. A concentraciones más bajas, los antibióticos y antifúngicos
pueden no suprimir eficazmente los microorganismos contaminantes que a menudo
están presentes en las muestras clínicas. Sin embargo, hemos encontrado que la
mayoría de las células que se han adaptado al crecimiento en medios sin suero
toleran los antibióticos. Por ejemplo, Hemos utilizado células MDCK en medios
libres de suero con antibióticos para el aislamiento de los virus de la gripe. Como
ahora hay muchas formulaciones diferentes de medios celulares libres de suero, es
probable que se desarrollen metodologías exitosas que las utilicen para el
diagnóstico virológico. Un aspecto particularmente importante de dicho trabajo sería
la reducción de costos para los laboratorios de diagnóstico de virología en naciones
menos privilegiadas, ya que el suero es costoso.
Como se señaló anteriormente, el suero es una mezcla compleja y es común la
variación e inconsistencia de lote a lote. Esto se debe a que los animales de origen
difieren, y su estado nutricional, hidratación, bienestar general, etc. tienen efectos
directos sobre la calidad del suero. Los niveles de hormonas y vitaminas en los
sueros pueden variar, y todas las cosas juntas pueden tener un impacto significativo
en el cultivo celular. Por lo tanto, otro argumento para usar medios de crecimiento
celular libres de suero, donde sea posible, es que existe un mejor control del proceso.
Antes del desarrollo de medios de crecimiento celular libres de suero, muchos investigadores
probarían múltiples lotes de suero para una aplicación particular, luego comprarían un lote grande
del lote de suero de mejor rendimiento. Esto sigue siendo una práctica aconsejable cuando el suero
debe usarse para proyectos a largo plazo y para trabajos de alto rendimiento,

5. Remediación de la contaminación por micoplasma.


Las micoplasmas son bacterias (clase Mollicutes) que se encuentran entre los
contaminantes más comunes y graves de los cultivos celulares. Hay dos géneros
de micoplasma que son relevantes para el cultivo celular, Acholeplasma y
Micoplasma, y tienen varias propiedades únicas que los distinguen de otros
procariotas. En particular, carecen de una pared celular, en lugar de usar esteroles
para mantener su membrana plasmática. El micoplasma requiere colesterol o
esteroles similares derivados de huéspedes vertebrados, que incorporan en sus
membranas celulares, mientras que Acholeplasmacrece en ausencia de esteroles
(pero los incorpora si están presentes). Como carecen de paredes celulares, el
micoplasma no se ve afectado por los antibióticos que interfieren con la formación
de mureína (peptidoglucano) de las paredes celulares, como la penicilina y otros
antibióticos betalactámicos. También son resistentes a la estreptomicina. A
principios de la década de 1990, se estimó que alrededor del 15% de los cultivos
celulares en los Estados Unidos estaban contaminados con micoplasma [ 42 ]. Las
fuentes más probables de micoplasma para los laboratorios dedicados al cultivo
celular son: (a) cultivos celulares previamente contaminados (que pueden incluir
nuevos cultivos de fuentes desconocidas o algunos obtenidos de bancos de
células), (b) equipos de laboratorio, medios, reactivos que ingresaron contacto con
cultivos contaminados y sueros utilizados para el cultivo celular [ 43], y (c) personal
involucrado en el mantenimiento de la celda [ 44 ].
Debido a que son relativamente pequeños (0.15–0.3 μm), es difícil filtrarlos de la
suspensión. Existen tipos de micoplasma intracelular y extracelular. El micoplasma
se replica relativamente lento a medida que se propaga a través de un cultivo
celular. Algunas especies de micoplasmas comprenden el 95% de los aislados de
cultivos celulares: Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma arginini, M. fermentans, M.
hominis, M. hyorhinis, M. orale, M. pirum y M. salivarium [ 42 , 44 - 46 ]. Cabe señalar
que, por definición, los miembros del género Mycoplasmaestán restringidos a
huéspedes vertebrados. Por esta razón, muchos investigadores suponen que los
materiales de origen vegetal están libres de micoplasma que infecta las células
derivadas de los vertebrados. Sin embargo, sugerimos precaución contra tales
nociones; como la contaminación de los componentes de los medios de origen
vegetal por A.laidlawii se ha informado recientemente [ 47 ]. Las consecuencias de
la contaminación por micoplasma de las células cultivadas pueden variar de sutiles
a graves. Los efectos generales del micoplasma en un cultivo celular varían según
la especie de micoplasma que infecta las células, la carga de micoplasma (título), el
tipo de células infectadas y la duración de la infección [ 48] El micoplasma se adhiere
a las membranas celulares para obtener nutrientes, y en el proceso puede dañar las
membranas de la célula huésped, el ADN y el ARN y los orgánulos intracelulares.
Su presencia puede ejercer profundos efectos que van desde alteraciones
inesperadas de los patrones de crecimiento y la expresión del gen del huésped
hasta la modulación del metabolismo del huésped (p. Ej., Producen metabolitos que
alteran el pH), inducción de aberraciones cromosómicas, agotamiento de los
medios, alteración de los rendimientos del producto (como el título del virus ), y la
alteración de la producción de citocinas y otras funciones de las células del sistema
inmune [ 44 , 48 - 50 ]. No hace falta decir que se deben hacer esfuerzos para
prevenir la contaminación por micoplasma de los cultivos celulares, siguiendo las
buenas prácticas de cultivo celular [ 44]
Si un cultivo celular está contaminado con micoplasma, existen dos soluciones de
remediación: (a) Destruya (autoclave) el cultivo y deséchelo, y comience con un
nuevo cultivo, o (b) Trate el cultivo con antibióticos específicos u otros productos
bioquímicos que son tóxicos para el micoplasma pero seguros para las células. Los
antibióticos de cultivo celular más comúnmente utilizados no son efectivos contra la
contaminación por micoplasma, pero otros antibióticos han demostrado tener éxito
en la eliminación del micoplasma de los cultivos celulares. En el pasado cercano,
se utilizaron los siguientes tratamientos para eliminar cultivos celulares
contaminados con micoplasma: (a) tratamiento de una a dos semanas con el Agente
de eliminación de micoplasma de fluoroquinolona (MRA, de ICN Biochemicals
[ahora MP Biochemicals]), (b) dos semanas tratamiento con la ciprofloxacina de
fluoroquinolona (que muchos conocen mejor como Ciprobay),51 , 52 ]. Antes del
uso de los productos de erradicación de micoplasmas mencionados anteriormente,
los tratamientos a largo plazo con tetraciclinas eran comunes. Nosotros y otros
hemos encontrado que tales tratamientos de erradicación de micoplasmas tienen
una eficacia limitada. En cambio, cuando sea necesario, favorecemos el uso del
tratamiento con plasmocina (InvivoGen) (durante un mínimo de dos semanas). La
plasmocina es una mezcla de antibióticos que consiste en una combinación de un
macrólido y una quinolona, y es activa contra el micoplasma intracelular y
extracelular. No se detectaron alteraciones permanentes en las células eucariotas
tratadas con plasmocina [ 53], lo que sugiere que el producto puede ser
generalmente seguro para la mayoría de las líneas celulares. Esta ha sido nuestra
experiencia hasta ahora con las muchas líneas celulares que hemos tratado al
recibirlas como una medida profiláctica (J. Lednicky y D. Wyatt, inédito).
Plasmocure, una nueva mezcla de antibióticos para la erradicación del micoplasma
de los cultivos celulares, ahora también está disponible en Invivogen; sin embargo,
no hemos probado este producto y no podemos comentar sobre su eficacia.
Una última consideración importante es que algunos cultivos pueden estar
infectados por más de una especie de micoplasma [54; J. Lednicky y D. Wyatt, datos
no publicados]. No se puede eliminar un cultivo de micoplasma si una (o más) de
las especies en un cultivo contaminado es resistente a los antibióticos que se utilizan
para erradicar el micoplasma. Debido a que la biología del micoplasma varía entre
las especies, no es correcto generalizar el efecto de un determinado antibiótico o
una mezcla de antibióticos para todos (es decir, un antibiótico o una mezcla de
antibióticos que funciona para la erradicación de uno puede no funcionar para una
especie de micoplasma diferente) [ 55 ]
En los últimos años, no hemos detectado micoplasma en líneas celulares que
hemos validado en nuestros respectivos laboratorios. Y hemos observado una
disminución en el porcentaje de células contaminadas con micoplasma obtenidas
de laboratorios acreditados. Sin embargo, todavía detectamos frecuentemente
micoplasma en preparaciones de virus obtenidas de proveedores comerciales,
laboratorios clínicos y otras fuentes. Por lo tanto, es aconsejable evaluar las
reservas de virus para la contaminación por micoplasma. Esto es particularmente
importante para los stocks de virus producidos en cultivos celulares destinados a
estudios en animales. Especialmente si el virus debe inyectarse en los animales por
vía intracerebral, subcutánea o intraperitoneal. En estudios con animales, rara vez
se da el caso de que los investigadores examinen si las discrepancias entre
laboratorios pueden deberse a la presencia o ausencia de micoplasma en el virus
de desafío. En relación con esto, también vale la pena verificar que los anticuerpos
de hibridoma utilizados para estudios en animales estén libres de micoplasma.
6. Microscopía para cultivo celular.
Hemos observado que muchos laboratorios dedicados al cultivo celular, incluidos
los laboratorios de virología, hasta ahora solo están equipados con microscopios
que utilizan iluminación de campo brillante transmitida. Y muchos de estos
laboratorios utilizan objetivos de microscopio que, en combinación con los lentes del
ocular, producen una imagen ampliada de solo 200X más o menos. Un gran
problema es que las células en cultivo parecen virtualmente transparentes cuando
se observan con un microscopio óptico bajo iluminación de campo brillante. Para
mejorar la visibilidad y el contraste, los analistas deben reducir el tamaño de
apertura del diafragma del iris del condensador de subestación, pero esto
generalmente resulta en una pérdida grave de resolución y la introducción de
artefactos de difracción. Por otra parte, los cambios morfológicos sutiles son
imposibles de observar cuando las células se ven con bajo aumento utilizando
iluminación de campo brillante transmitida. Por lo tanto, es fácil pasar por alto signos
reveladores de deterioro celular o "estrés", y también de CPE, cuando las células
cultivadas se ven usando iluminación de campo brillante transmitida con un aumento
relativamente bajo. Las imágenes de las células fotografiadas utilizando la
iluminación de campo brillante transmitida con bajo aumento tienden a carecer de
una resolución adecuada para fines de enseñanza y son menos deseables para la
captura de datos. De hecho, los laboratorios que utilizan iluminación de campo
brillante transmitida a menudo recurren al uso de diversos procedimientos de tinción
celular para que las características de las células infectadas por virus puedan
visualizarse más fácilmente. Esto agrega costos y a menudo presenta riesgos de
bioseguridad, y también mata las células que se están estudiando. Cuando la tinción
celular debe usarse como un complemento para la microscopía, los siguientes son
útiles: y también de CPE, cuando se ven células cultivadas usando iluminación de
campo brillante transmitida con un aumento relativamente bajo. Las imágenes de
las células fotografiadas utilizando la iluminación de campo brillante transmitida con
bajo aumento tienden a carecer de una resolución adecuada para fines de
enseñanza y son menos deseables para la captura de datos. De hecho, los
laboratorios que utilizan iluminación de campo brillante transmitida a menudo
recurren al uso de diversos procedimientos de tinción celular para que las
características de las células infectadas por virus puedan visualizarse más
fácilmente. Esto agrega costos y a menudo presenta riesgos de bioseguridad, y
también mata las células que se están estudiando. Cuando la tinción celular debe
usarse como un complemento para la microscopía, los siguientes son útiles: y
también de CPE, cuando se ven células cultivadas usando iluminación de campo
brillante transmitida con un aumento relativamente bajo. Las imágenes de las
células fotografiadas utilizando la iluminación de campo brillante transmitida con
bajo aumento tienden a carecer de una resolución adecuada para fines de
enseñanza y son menos deseables para la captura de datos. De hecho, los
laboratorios que utilizan iluminación de campo brillante transmitida a menudo
recurren al uso de diversos procedimientos de tinción celular para que las
características de las células infectadas por virus puedan visualizarse más
fácilmente. Esto agrega costos y a menudo presenta riesgos de bioseguridad, y
también mata las células que se están estudiando. Cuando la tinción celular debe
usarse como un complemento para la microscopía, los siguientes son útiles: Las
imágenes de las células fotografiadas utilizando la iluminación de campo brillante
transmitida con bajo aumento tienden a carecer de una resolución adecuada para
fines de enseñanza y son menos deseables para la captura de datos. De hecho, los
laboratorios que utilizan iluminación de campo brillante transmitida a menudo
recurren al uso de diversos procedimientos de tinción celular para que las
características de las células infectadas por virus puedan visualizarse más
fácilmente. Esto agrega costos y a menudo presenta riesgos de bioseguridad, y
también mata las células que se están estudiando. Cuando la tinción celular debe
usarse como un complemento para la microscopía, los siguientes son útiles: Las
imágenes de las células fotografiadas utilizando la iluminación de campo brillante
transmitida con bajo aumento tienden a carecer de una resolución adecuada para
fines de enseñanza y son menos deseables para la captura de datos. De hecho, los
laboratorios que utilizan iluminación de campo brillante transmitida a menudo
recurren al uso de diversos procedimientos de tinción celular para que las
características de las células infectadas por virus puedan visualizarse más
fácilmente. Esto agrega costos y a menudo presenta riesgos de bioseguridad, y
también mata las células que se están estudiando. Cuando la tinción celular debe
usarse como un complemento para la microscopía, los siguientes son útiles: Los
laboratorios que utilizan iluminación de campo brillante transmitida a menudo
recurren al uso de diversos procedimientos de tinción celular para que las
características de las células infectadas por virus puedan visualizarse más
fácilmente. Esto agrega costos y a menudo presenta riesgos de bioseguridad, y
también mata las células que se están estudiando. Cuando la tinción celular debe
usarse como un complemento para la microscopía, los siguientes son útiles: Los
laboratorios que utilizan iluminación de campo brillante transmitida a menudo
recurren al uso de diversos procedimientos de tinción celular para que las
características de las células infectadas por virus puedan visualizarse más
fácilmente. Esto agrega costos y a menudo presenta riesgos de bioseguridad, y
también mata las células que se están estudiando. Cuando la tinción celular debe
usarse como un complemento para la microscopía, los siguientes son útiles:
Tinción May-Grüenwald-Giemsa, utilizada para visualizar la citopatología. Las
monocapas de células infectadas teñidas se comparan con las de los controles no
infectados. La tinción May-Grüenwald-Giemsa teñirá diferencialmente las
nucleoproteínas de ADN (rojo / púrpura) y las nucleoproteínas de ARN (azul). Las
células teñidas también se examinan para detectar la presencia de sincitios o
células gigantes, cuerpos de inclusión y otros CPE virales.
Tinción de Wright-Giemsa modificada para glóbulos blancos, células en suspensión
o células cultivadas como monocapas en cubreobjetos. Disponible comercialmente
como prueba Diff-Quick, hemos encontrado que este proceso de tinción es útil para
la detección de células infectadas con coxiella o clamidia, cuerpos de inclusión viral
y aplicaciones similares. El margen de cromatina, el encallamiento citoplasmático,
las vacuolas y la forma de los cuerpos de inclusión viral se visualizan fácilmente,
dando pistas sobre qué virus puede estar en una célula.
Giménez mancha. Esta tinción es útil para las bacterias intracelulares que se tiñen
mal usando una tinción de Gram. Hemos usado esta tinción para detectar bacterias
que crecen unidas al exterior de las células cultivadas como monocapas en cultivo
celular.
Una mejor manera de visualizar las células cultivadas es usar un microscopio
invertido configurado para microscopía de contraste de fase. Con el contraste de
fase, los objetos relativamente delgados, como las células planas, se hacen visibles
bajo el microscopio óptico. Las diferencias en la estructura celular se amplifican
durante el contraste de fase, lo que da como resultado una imagen que puede
considerarse como un mapa de densidad óptica. Las estructuras finas en las células
que no se detectan fácilmente mediante microscopía de campo claro se visualizan
claramente, lo que facilita la evaluación de la "condición" de las células, y el CPE es
más fácil de detectar. La microscopía de contraste de fase es especialmente
ventajosa porque las células vivas se pueden observar sin ser destruidas, "fijadas"
(preservadas) y teñidas. Equipamos nuestros microscopios de contraste de fase con
objetivos que proporcionan una vista amplia y plana, y recomiendan una ampliación
de hasta al menos 400X. Económico, Las cámaras digitales de alta calidad ahora
están ampliamente disponibles y son muy recomendables para la captura de
imágenes. Existen varios microscopios en el mercado abierto que son asequibles,
resistentes y adecuados para la mayoría de las aplicaciones de virología que usan
células cultivadas como monocapas. Los autores de este manuscrito utilizan
microscopios fabricados por Leitz, Nikon y Olympus en sus laboratorios. Para los
laboratorios de alta contención en los que se deben usar protectores faciales [p. Ej.,
Protectores faciales que son componentes de un conjunto de respirador purificador
de aire (PAPR)], es conveniente una pantalla de enfoque en formato LCD. De lo
contrario, el enfoque es difícil, especialmente cuando el protector facial está rayado
por el "desgaste" cotidiano, o se ha vuelto algo opaco debido a la descontaminación
repetida con hipoclorito de sodio o soluciones de descontaminación duras
similares).
En los últimos años, el concepto de usar microscopios digitales invertidos ha
generado mucho interés entre los virólogos. Hemos probado el microscopio EVOS-
x1 de campo claro y contraste de fase (AMG, Alemania) y nos resulta fácil de usar.
Estos microscopios tienen una pantalla de visualización LCD de alta resolución que
es útil para fines de instrucción, ya que muchas personas pueden verla
simultáneamente. Estos microscopios son portátiles y tienen una dimensión general
relativamente compacta que los hace fáciles de instalar en gabinetes de
bioseguridad o en cajas de guantes de clase III. Centrarse en la imagen al ver la
pantalla LCD es conveniente en laboratorios de bioseguridad de alta contención en
los que el trabajo se realiza utilizando máscaras faciales protectoras, como el trabajo
con PAPR.
7. Mantenimiento de cultivos celulares infectados por virus durante unos
meses.
El aislamiento de algunos virus puede llevar de semanas a dos meses o más. Hay
muchas razones para esto. En muchos casos, las células indicadoras son
subóptimas para la replicación de alto título del virus. Algunos virus asociados con
lesiones pueden ser defectuosos; por ejemplo, el virus del sarampión (MeV)
asociado con panencefalitis schlerosing subaguda puede causar efectos citopáticos
sin liberar viriones [56 y referencias allí]. Otros virus causan infecciones persistentes
subclínicas en sus huéspedes naturales y pueden haber evolucionado para
replicarse lentamente. Por lo tanto, se requiere una incubación prolongada, a
menudo hasta dos meses, para el aislamiento de algunas variantes del virus JC de
poliomavirus que tienen una región reguladora arquetípica [57; J. Lednicky, inédito].
Hemos podido aislar virus considerados "casi imposibles" de aislarin vitro al
mantener cultivos celulares durante períodos prolongados después de la
inoculación con muestras clínicas (o ambientales). Un proceso complementario para
el mantenimiento a largo plazo de los cultivos es el desempeño periódico de los
"pasos ciegos" de la célula infectada (que se analiza con más detalle a
continuación).
La clave para mantener las células durante muchos meses es ralentizar su
metabolismo y / o el tiempo de duplicación de su población. Esto se realiza caso por
caso, ya que no todas las celdas responderán de la misma manera a cualquier
protocolo dado, y puede haber variabilidad dentro de una línea celular determinada,
dependiendo de la edad, el historial de pasajes, etc. Un objetivo importante es para
mantener las células en un estado relevante para el virus objetivo. Por ejemplo, ¿el
virus objetivo normalmente infectaría (y se replicaría) en células que están
mitóticamente activas / en división, como en el caso de los parvovirus? Si es así, no
se debe permitir que las células se confluentes. Por otra parte, ¿El virus
normalmente infecta las células "confluentes" inhibidas por contacto? ¿Deberían las
células ser diferenciadas terminalmente? ¿Deben rotarse las células para crear
interfaces de aire y líquido como se realiza para el aislamiento de rinovirus usando
células en botellas de rodillos?
Las tres formas habituales de mantener las células para la observación a largo plazo
son:
Use medio de crecimiento con una concentración reducida de glucosa. Por ejemplo,
el medio comercial Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) se vende como
formulaciones de glucosa "alta" o "baja". Las células pueden propagarse en DMEM
con alto contenido de glucosa y luego pasar a DMEM con bajo contenido de glucosa
después de inocularse con el virus.
Cambie de formulaciones ricas en nutrientes a formulaciones de medios de
crecimiento tradicionales después de inocular las células con virus. Por ejemplo, las
células pueden crecer en DMEM, pero una vez infectadas, mantenerse en el Medio
Esencial Mínimo de Eagle (EMEM). Como medida aproximada, DMEM tiene
aproximadamente 4 veces la concentración de aminoácidos que se encuentran en
EMEM.
Reduzca la cantidad de suero en el medio de crecimiento celular después de que
las células hayan sido inoculadas con virus. Por ejemplo, en lugar de 10% de FBS,
en muchos casos se pueden usar medios de crecimiento celular con 1 - 3% de suero
para volver a alimentar las células. Además, en lugar de FBS, el suero de ternera a
veces se puede usar para el mantenimiento / reabastecimiento de medios. Esto
ayuda a ralentizar la replicación celular y el metabolismo porque, en general, el
suero de ternera tiene una menor concentración de factores promotores del
crecimiento que FBS.
Hemos utilizado los procedimientos anteriores, únicamente o combinaciones de los
mismos, para el aislamiento de varios virus. Es una buena idea validar los medios
de crecimiento para cada aplicación; descubrimos que los medios de crecimiento
celular no son necesariamente equitativos entre los fabricantes (es decir, todo se
mantiene igual, DMEM del proveedor A puede no funcionar tan bien como DMEM
del proveedor B).
Una técnica que ha funcionado bien para el aislamiento de virus que infectan y se
replican lentamente en células derivadas de monos verdes africanos es esta:
sustituya Vero E6 por otras líneas celulares derivadas de células de mono verde
africano. Las células Vero E6 están más inhibidas por contacto que líneas celulares
similares estrechamente relacionadas, y pueden mantenerse durante largos
períodos de tiempo con cambios mínimos o nulos en los medios. Por ejemplo,
hemos podido aislar metapneumovirus humanos (CPE detectado en 10-14 días) y
otros paramixovirus como los virus parainfluenza 4A y 4B en células Vero E6
mantenidas en medios libres de suero, con cambios en los medios de crecimiento
cada dos semanas. . Este concepto fue popularizado por Akibo et al [ 58] para el
aislamiento de metapneumovirus, mientras que las células Vero E6 se consideraban
menos útiles que el riñón de mono terciario (tMK) y la línea celular LLC-MK2 para el
aislamiento de esos virus.

8. Virus adventicios en líneas celulares.


No es raro recibir líneas celulares contaminadas con virus de los proveedores, y
esto es especialmente cierto para las células obtenidas a través de la transferencia
entre laboratorios. Un problema es que las células pueden haberse infectado con
virus bovinos (del suero) que se replican de manera relativamente lenta (es decir, el
tiempo que les lleva completar un ciclo de replicación y formar viriones de progenie
es mayor que el tiempo de duplicación de la población celular) . Estos virus
contaminantes se denominan virus "adventicios" (es decir, son virus que no
deberían estar presentes).
Muchas veces, los virus adventicios pasan desapercibidos, y el deterioro de las
células se atribuye a algún tipo de "folklore" frecuente entre los practicantes de
cultivos celulares. Por ejemplo, hemos encontrado lotes de células que se
deterioraron cuando se sembraron a bajas densidades, pero no a altas densidades.
Los investigadores que habían estado trabajando con esas células en particular no
cuestionaron las instrucciones de propagación celular proporcionadas con las
células. Descubrimos que la razón por la que las células sobrevivieron cuando se
sembraron a altas densidades fue porque estaban infectadas con parvovirus, y
muchos parvovirus requieren células de replicación activa para formar viriones de
progenie in vitro.. Tras una investigación adicional, descubrimos que algunas líneas
de células que están disponibles de fuentes comerciales se empaquetan junto con
instrucciones que sugieren que para la propagación, no se deben intentar más de
cinco pases de células (con semillas a altas densidades) para obtener resultados
"óptimos". ¡Suponemos que existe un problema similar para esas células (que están
infectadas con parvo u otros virus que requieren células que se replican
activamente)!
Además de los sueros, los virus contaminantes también se pueden rastrear a los
trabajadores de laboratorio, a las enzimas de origen animal utilizadas para el cultivo
celular (como la tripsina porcina) y a otros biológicos utilizados para el cultivo celular.
Una compilación reciente de virus bovinos y porcinos que pueden contaminar el
suero bovino y la tripsina porcina está disponible en la ref. 59. A medida que se
descubren nuevos virus, la conciencia de su posible presencia en productos
biológicos como el suero y la tripsina atrae más interés y atención. Por ejemplo, la
tripsina porcina se ha rastreado como la fuente del virus Torque teno sus (TTSuV),
un miembro de la familia Anelloviridaeeso es un contaminante de muchas líneas
celulares. De hecho, TTSuV se encontró en quince linajes celulares, originarios de
trece especies diferentes, y su presencia en las líneas celulares probablemente se
remonta al uso de tripsina porcina durante la propagación de esas células [ 60 ]. Los
Anellovirus son pequeños virus de ADN que se replican dentro de los núcleos de
las células infectadas, y el CPE debido a su presencia no se ha descrito bien en la
actualidad. Los circovirus porcinos 1 y 2 (PCV1 y PCV2) también se han detectado
en líneas celulares, incluidas las utilizadas para las vacunas, y se han rastreado
hasta el uso de tripsina porcina [ 61 - 63 ].
Recientemente rastreamos un suplemento de aminoácidos filtrados como la fuente
de un reovirus contaminante, y aprendimos de algunos colegas de la industria que
habían hecho el mismo hallazgo. Sin embargo, como es típico de estos casos, los
hallazgos no se publican y, por lo tanto, la información no se difunde ampliamente.
Sin embargo, los reovirus pueden tener un amplio rango de huéspedes e infectar
muchas líneas celulares diferentes [ 60 , 64 ].
En algunos casos, las bacterias inusuales e incluso algunos microorganismos
eucariotas unicelulares causan problemas de contaminación celular que se
atribuyen a los virus. Esto se debe a que muchas personas dedicadas al cultivo
celular tienen poca experiencia con la detección e identificación de este tipo de
organismos. Una vez nos encargaron identificar un "virus" que afectara algunas
líneas celulares de cáncer desarrolladas internamente, que resultaron infectadas
con clamidia.
Los virus adventicios pueden confundir los resultados de la investigación de muchas
maneras inesperadas. En un evento memorable, se pensó que las células se habían
transformado a través de un mecanismo de "golpear y correr", ya que las células
transformadas no retenían un oncogén que se había transfectado en las células
precursoras (no transformadas). Sin embargo, se demostró que las células estaban
infectadas con el poliomavirus bovino y que expresaban sus genes de proteínas
tumorales (Lednicky, observaciones no publicadas). Esto desvaneció las
esperanzas de los investigadores de una solicitud de patente. También es
angustiante cuando uno realiza una microscopía electrónica y descubre que hay
más de un virus presente en la muestra que se está viendo (o peor, solo se visualiza
el virus incorrecto). Las líneas celulares contaminadas son una razón principal por
la cual los estudios de expresión génica pueden variar significativamente entre
laboratorios.
En los últimos años, hemos ayudado a varios investigadores, así como a compañías
de biotecnología, a identificar virus adventicios que afectan su trabajo. Entre los
virus adventicios que hemos encontrado recientemente están:
• Herpesvirus bovino 4 (BoHV-4) en humanos HeLa y Hek293, y en células
MDCK caninas. Otros han informado que BoHV-4 es capaz de infectar
células de varias especies diferentes, incluidas las células humanas [ 65 ].
En las células MDCK, las células infectadas con algunas cepas de BoHV-4
producen vacuolas en las uniones célula a célula, y esto a menudo se
confunde con el "estrés celular" debido al agotamiento de nutrientes.

• BVDV en células MDBK (Madin Darby Bovine Kidney). Este hallazgo es


consistente con la biología conocida de BVDV, y las células MDBK a menudo
se usan para estudios in vitro de BVDV. Por ejemplo, ver [ 66 ].
• Virus de minutos de ratón (MMV) en células de ovario de hámster chino
(CHO). El MMV es un contaminante notorio de las líneas celulares de
roedores importantes para la industria biofarmacéutica [ 67 ].

• Reovirus en varias líneas celulares de mamíferos e insectos. Se utilizó


microscopía electrónica para identificar estos virus; No se realizaron pruebas
de seguimiento para determinar la especie viral. Sin embargo, la presencia
de reovirus en líneas celulares de insectos fue una sorpresa para nuestros
clientes de la industria, quienes experimentaron pérdidas catastróficas de
líneas celulares de insectos utilizadas para tecnologías basadas en
baculovirus.

• Vesivirus en células Crandell – Rees Feline Kidney (CRFK). Hemos


detectado una instancia de contaminación por vesivirus de células CRFK,
utilizando microscopía electrónica.
NOTA: También hemos experimentado algunos casos en los que los investigadores
que trabajan con células contaminadas con virus adventicios atribuyen el deterioro
celular a una técnica deficiente (a menudo se culpa a los estudiantes de posgrado).

9. Líneas celulares diseñadas para el aislamiento de virus.


Como señaló elegantemente el Dr. Paul Olivo [ 68], los ensayos de diagnóstico
rápido basados en la detección directa de antígeno viral o ácido nucleico se utilizan
con mayor frecuencia en laboratorios de virología clínica. En cualquier caso, el
cultivo de virus sigue siendo la única forma de detectar virus infecciosos y analizar
fenotipos virales clínicamente relevantes, como la resistencia a los medicamentos.
El crecimiento de virus en el cultivo celular es costoso, laborioso y requiere mucho
tiempo y requiere el uso de muchas líneas celulares diferentes. La tecnología
transgénica ofrece la posibilidad de utilizar líneas celulares genéticamente
modificadas ("modificadas") para mejorar el crecimiento del virus en el cultivo celular
y facilitar la detección de células infectadas por el virus. Mientras que hay varios
enfoques disponibles, las dos aplicaciones comunes de ingeniería celular para
virología diagnóstica son: (a) ingeniería de líneas celulares susceptibles para
sobreexpresar receptores de virus,
Conceptualmente, el hecho de que una línea celular sea susceptible y permisiva
para un virus no significa que el receptor de virus óptimo esté presente en la
superficie celular. El número de receptores virales en la superficie celular también
podría ser subóptimo. Si un gen auténtico para el receptor viral se sobreexpresa
(mediante ingeniería genética), se debe mejorar la unión del virus y la entrada a la
célula. Por esa razón, hemos diseñado Vero E6 y otras células (como Mv1 Lu, que
son células pulmonares de visón), que sobreexpresan la molécula de activación de
linfocitos de señalización canina (cSLAM), que se cree que es el principal receptor
de virus del virus del moquillo canino ( CDV). Esencialmente, otros utilizaron la
misma lógica en sus decisiones para diseñar líneas celulares derivadas de Vero que
sobreexpresen cSLAM [ 69 ,70 ]. De manera análoga a la experiencia de los otros
grupos, encontramos que muchas cepas de CDV se detectan dentro de un día
después de la infección de las células que expresan SLAM frente a hasta un mes
en las células Vero convencionales. En la figura siguiente se muestra una fotografía
de las células Mv1-cSLAM que muestran sincitios dentro de las 16 horas posteriores
a la infección por una cepa americana de CDV tipo 2. Una línea celular relacionada
que expresa SLAM humana, Vero-hSLAM, se usa para el aislamiento de MeV [ 71
], un virus estrechamente relacionado con el CDV y a menudo también es difícil de
aislar usando células Vero convencionales.
De manera similar, nosotros y otros hemos diseñado células MDCK que
sobreexpresan una sialil transferasa 1 (SIAT1) que cataliza la formación de
receptores de ácido siálico ligados a α-2,6 reconocidos por los virus de la influenza
A humana. En nuestras manos, la mayoría de los virus de la gripe humana H1N1 y
H3N2 contemporáneos se detectan antes y forman títulos de virus más altos en las
células MDCK modificadas que en las células MDCK convencionales (J. Lednicky y
D. Wyatt, datos que se presentarán en otros lugares), en acuerdo con un informe
reciente [ 72] Además de las células MDCK estándar, también hemos diseñado
líneas celulares adicionales que sobreexpresan SIAT1, y también, líneas celulares
que sobreexpresan SIAT4 para catalizar la formación de receptores de ácido siálico
unidos a α-2,3 (datos e información para ser presentado en otro lugar). Con estas
células que sobreexpresan SIAT1 y SIAT4, hemos aislado virus de influenza que
otros no pudieron, y también, en cuanto a [ 72 ], hemos recuperado virus de reservas
congeladas con las que otros tuvieron gran dificultad.
Otro ejemplo de una línea celular que ha sido diseñada para el aislamiento efectivo
de un virus es L20B, utilizada para el aislamiento de poliovirus, que es un
enterovirus. Las células L20B se derivan de las células L de ratón y se diseñaron
para expresar el receptor de poliovirus. Una ventaja de usar estas células sobre
líneas celulares humanas como Hep2 y RD para el aislamiento de poliovirus es que
pocos enterovirus humanos pueden completar su ciclo de replicación en células de
ratón [ 73 ]. Por lo tanto, es posible diseñar células que normalmente no son
permisivas para un virus en particular en una versión permisiva.

Figura 1.
Células Mv1Lu-cSLAM 16 horas después de la inoculación con homogeneizado de
pulmón de un perro con moquillo que incluye signos neurológicos. Las células
multinucleadas, un signo de infección por CDV, son evidentes. Se aisló una variante
estadounidense de CDV tipo 2. Aumento original a 400X.
Para la modificación genética de células cultivadas (para expresar un receptor de
virus), en muchos casos ya no es necesario clonar primero un ADNc de un receptor
de virus particular. Muchas compañías ahora venden ADNc de longitud completa de
genes humanos (y no humanos) ya clonados en vectores de expresión de
plásmidos. Algunos de los vectores de expresión de nueva generación también son
muy activos entre especies, eliminando así la necesidad de optimizar secuencias
potenciadoras / promotoras en el vector de expresión.
El segundo enfoque general para la ingeniería de las células para la detección /
aislamiento de virus, el de modificar las células para expresar genes informadores
en respuesta a la infección por virus, todavía es relativamente nuevo, pero ya ha
demostrado ser útil para la virología diagnóstica. Por ejemplo, el sistema ELVIS HSV
comercializado por la compañía Diagnostic Hybrids para la detección y tipificación
de virus del herpes simple humano (HSV) 1 y 2. El sistema ELVIS HSV utiliza células
BHK diseñadas para expresar β-galactosidasa en respuesta a la infección por HSV.
Después de que las células manipuladas se inoculan con una muestra clínica, se
forma un precipitado azul sobre las células infectadas debido a la interacción de la
β-galactosidasa con un sustrato colorimétrico. La formación de un color azul facilita
la detección de células infectadas, con el efecto neto de reducir el tiempo desde la
inoculación de la muestra hasta la detección de virus de (típicamente) siete o más
días a uno o dos días. Un posterior ensayo de inmunofluorescencia que usa
anticuerpos monocolonales específicos para HSV 1 o 2 se usa para tipificar el virus.
10. Paradigmas para el aislamiento del virus.
A menudo se nos pregunta "¿Cuál es la mejor combinación de células indicadoras
para el aislamiento (primario) de virus de muestras clínicas?" Por supuesto, esta no
es una pregunta que tenga una respuesta correcta. De hecho, no existe una
combinación mágica que sea de aplicación universal. Y la variabilidad existe según
la disponibilidad de reactivos en varios países. La mejor respuesta a la pregunta de
qué células usar es confiar en la experiencia de los virólogos que trabajan en el sitio
y usar la mayor variedad posible de células indicadoras para el aislamiento de virus
desconocidos. Sin embargo, hay algunas pautas que son aplicables en muchas
aplicaciones:
Muchos virus respiratorios se replican en el tracto respiratorio superior y requieren
temperaturas inferiores a 37 ° C para una replicación óptima. Para cada tipo de línea
celular indicadora (o células primarias), es aconsejable inocular cultivos celulares
replicados e incubar uno a 35 ° a 37 ° C, el otro a 32 ° a 34 ° C.
Los cultivos no deben considerarse negativos para el aislamiento del virus si no se
detectan CPE. Se debe considerar una segunda medida y se deben desarrollar
criterios bien pensados antes de rechazar una cultura "negativa". Por ejemplo, ¿se
formaría CPE si los cultivos se mantuvieran durante un período de tiempo más
largo? Los ejemplos de evaluaciones secundarias incluyen el rendimiento de la
hemaglutinación (utilizando medios de cultivo usados) o las pruebas de
hemadsorción (realizadas directamente en las células infectadas) y la microscopía
electrónica. Las pruebas de hemaglutinación y hemadsorción se realizan mejor
usando glóbulos rojos de dos especies no relacionadas (p. Ej., Una especie de
mamífero y una de ave). La microscopía electrónica debe realizarse utilizando
material de los medios gastados para detectar viriones liberados y también en una
muestra de las células infectadas (a menudo,
Para todo el trabajo, los cultivos no infectados (controles negativos) deben
mantenerse y examinarse en paralelo con cualquier cultivo infectado con virus.
Donde sea económicamente factible, se deben usar pruebas moleculares de nueva
generación para ayudar en la identificación de nuevos virus.
Algunos virus requieren "adaptación" antes de la replicación adecuada en células
cultivadas y la formación de CPE. En el pasado, el proceso denominado "cultivo
ciego" se realizaba cuando se sospechaba que el virus no tenía CPE. Una versión
popular de este método es eliminar periódicamente muestras de un cultivo de
células presumiblemente infectadas e inocularlas en un nuevo lote de células. Este
proceso se repite cuatro veces. Un complemento al proceso anterior es dividir las
células infectadas (si confluentes) en un matraz más grande o en varios matraces y
permitir que las células se repliquen. Esto puede hacer que el CPE sea aparente si
las células que se replican activamente son óptimas para la detección del CPE
causado por un virus en particular.
El aislamiento de virus de mosquitos, garrapatas, etc., puede ser un desafío.
Muchos virus transmitidos por mosquitos se amplifican mejor a un título alto en las
líneas celulares de mosquitos, donde a menudo proliferan sin causar CPE, antes
del subcultivo en células animales. Ocasionalmente, también ha sido necesario
inocular roedores recién nacidos o lactantes (por vía subcutánea o intracerebral)
para obtener un alto título de virus para la inoculación de cultivos celulares.
Durante el aislamiento primario del virus a partir de muestras clínicas o ambientales,
muchos laboratorios rutinariamente filtran muestras a través de un filtro de 0,45 µm
antes de la inoculación de cultivos celulares. Este paso de filtración se realiza para
eliminar bacterias, hongos y otros contaminantes microbianos potenciales y
partículas no vivas. Un problema con este paso de filtración es que muchos virus
son pleomórficos y algunos tienen formas largas y filamentosas que pueden superar
los 0,45 µm. Esto incluye algunos virus de la gripe y morbilivirus. Además, en
muestras clínicas, muchos virus están unidos a restos celulares y otros, y quedan
atrapados por el filtro. Recomendamos la inoculación de dos lotes de células; uno
con una alícuota filtrada, el otro sin filtrar, de la muestra de virus.
Desafortunadamente, No es raro en la actualidad que las bacterias en muestras
clínicas (como la flora normal que son contaminantes de los hisopos naofaríngeos)
sean resistentes a la penicilina y la estreptomicina; preferimos usar una mezcla de
antibióticos que incluya neomicina además de penicilina y estreptomicina.
Cuando sea económicamente posible, sugerimos la inoculación de células que
crecen en una superficie de crecimiento relativamente grande con una muestra. La
idea detrás de esto es efectuar una dilución del inóculo en un área amplia,
reduciendo la concentración de agentes tóxicos. Por ejemplo, agregue un pequeño
inóculo (por ejemplo, 100 µl) a las células en un matraz con una superficie de
crecimiento de 75 centímetros cúbicos (matraz T75). Esto es especialmente útil
cuando las muestras deben tratarse previamente con una alta concentración de
antibióticos (como cuando se intenta aislar el virus de una muestra de heces).
Un hallazgo en gran parte olvidado es que los antibióticos pueden suprimir el
crecimiento de algunos virus. Este concepto es anti-dogmático, pero siempre debe
considerarse cuando los intentos de aislamiento de un virus en particular no tienen
mucho éxito. Un ejemplo reciente se describe en [ 74 ].
Algunos virus permanecen asociados a las células, como se mencionó
anteriormente, y para un aislamiento eficaz del virus, los viriones deben liberarse
del material al que están unidos. Esta es una de las razones por las que algunas
muestras clínicas designadas para el aislamiento del virus se "agitan" en presencia
de perlas de vidrio antes de la inoculación de la muestra en las células. En lugar de
la interrupción del cordón, en algunos casos, la congelación-descongelación de la
muestra se puede utilizar para disociar los viriones de las células o los desechos a
los que están unidos. La congelación y descongelación no se puede usar para los
virus del herpes y otros virus que se inactivan rápidamente por este proceso.
Algunos virus como el virus JC pueden disociarse de los desechos celulares
mediante el pretratamiento de la muestra con neuraminidasa. En cualquier caso, es
aconsejable explorar si hay opciones mecánicas o bioquímicas disponibles para
mejorar el aislamiento del virus. Sin embargo,
11. Observaciones finales
En este artículo, hemos discutido parte del arte detrás del aislamiento del virus a
través del cultivo celular. Debido a las complejidades del cultivo celular y la
naturaleza de los biomateriales utilizados, no es posible lograr los mismos
resultados finales en todo momento. Además, los virus mutan constantemente y,
por lo tanto, las "reglas del juego" pueden cambiar. Por lo tanto, la práctica del cultivo
celular para el aislamiento del virus es en parte arte, en parte ciencia y en parte
suerte. Sin embargo, siguiendo los principios mencionados en este manuscrito,
hemos logrado mantener células cultivadas durante largos períodos y hemos
aislado y propagado muchos virus "difíciles".

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