Práctica

Q. Iris Torres Muñoz

Preparación y Análisis del ADN genómico

Objetivo

Conocer las diferentes técnicas de extracción de ADN, parámetros de calidad para el análisis del ADN y conocimientos
básicos de cálculos de concentración de ADN.

Introducción

Gracias al desarrollo de las técnicas de Biología Molecular, la Medicina Molecular busca establecer las causas de las
enfermedades a nivel molecular y la identificación de los genes involucrados en éstas. Al conocer la secuencia
nucleotídica y las mutaciones más frecuentemente observadas, el diagnóstico oportuno se hace posible, permitiendo el
desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento.

La obtención del ADN es el primer paso clave para el éxito de los estudios moleculares. El ADN de alto peso molecular
puede obtenerse de diversas fuentes como lo son: sangre, células de mucosa oral, líquido amniótico, tejidos en fresco y
embebidos en parafina, líquidos corporales, entre otras.

El objetivo extraer el ADN, es evitar la degradación de los ácidos nucléicos por acción de las nucleasas, por lo que debe
tenerse especial cuidado en la preparación de las soluciones y los materiales que se van a emplear. Hablando de las
muestras de sangre periférica, estas deben de ser tomas en un tubo lila con EDTA y una vez tomada la muestra es
importante mantener la muestra en refrigeración a 4 oC mientras esta no sea procesada, conforme va transcurriendo el
tiempo desde que la muestra ha sido tomada, la cantidad y calidad del ADN se ve disminuida. Para las muestras de
mucosa oral o sangre en papel filtro, es importante mantenerlas secas en un sobre de papel, con el fin de evitar el
crecimiento de hongos o bacterias que dañarían el ADN.

Fundamento de las técnicas de extracción del ADN

Existen diversas técnicas para la extracción del ADN, sin embargo todos básicamente consisten en:

1. Lisis celular
2. Desproteinización
3. Precipitación, lavado y resuspensión del DNA.

Técnicas comunes de purificación de ADN

Extracción orgánica.
Es una técnica muy económica y la más comúnmente empleada en los laboratorios de biología molecular, debido a que
puede ser empleada en muestras escasas, parcialmente dañadas y con elevada concentración de contaminantes,
recuperándose una buena cantidad. Esta técnica es relativamente laboriosa, utiliza solventes orgánicos tóxicos, como el
fenol y el cloroformo, que pudieran comprometer la pureza del ADN pudiendo afectar las aplicaciones subsiguientes
tales como la PCR.

Se basa en la lisis celular por acción desnaturalizante de los detergentes SDS y Tritón 100X. Las proteínas son
desnaturalizadas empleando una mezcla de solventes inmiscibles, uno acuoso (cloroformo) y uno orgánico (fenol), por
lo que el DNA tiende a permanecer en la fase acuosa debido a la hidrofobicidad de los grupos fosfato, mientras que
proteínas y lípidos permanecen en la fase orgánica. El ADN purificado suele ser recuperado por precipitación con etanol
o isopropanol. El protocolo de Fenol-Cloroformo, técnica de Salado, Chelex, Easy-DNA® Kit (Invitrogen), Gentra
Puregene Kit (Qiagen), son algunos ejemplos que utilizan esta metodología.
Extracción en columnas de sílica.
Esta técnica es la más utilizada en los kits comerciales. Es una técnica de extracción basada en un sistema de separación
por centrifugación en columnas. No requiere del uso de solventes. El ADN se une específicamente a la membrana de
sílica gel mientras los contaminantes pasan a través de ella. Inhibidores de la PCR, tales como iones divalentes y
proteínas son completamente removidas en 2 pasos eficientes de lavado, dejando el ácido nucleico puro, para
posteriormente ser eluído en agua o buffer.

Este método, tiene un procedimiento más simple y rápido que la extracción orgánica y es compatible con la
automatización. Algunos kits basados en esta técnica incluyen: el Purelink Genomic DNA extracción kit (Invitrogen) y el
QIAamp Blood Mini Kit (Qiagen).

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Extracción con perlas magnética

Esta técnica está basada en la unión reversible del ADN a unas partículas sólidas magnéticas, las cuales han sido
recubiertas con un anticuerpo que une ADN o un grupo funcional que interactúa específicamente con el ADN. Tras la
unión del ADN, las esferas son separadas de otros componentes celulares y contaminantes por medio de lavados y
finalmente el ADN purificado es eluído con etanol. Esta técnica es rápida y puede ser automatizada, sin embargo, puede
ser más costosa que otras metodologías. Ejemplos: el kit Agencourt DNAdvance (Beckman Coulter), el Magnetic Beads
Genomic DNA Extraction Kit (Geneaid) y EZ1 DNA Blood Kit (Qiagen).

Análisis de DNA por Pureza Cantidad Integridad

espectrofotometría

La absorbancia es una propiedad natural del ADN, ARN, nucleótidos libres, proteínas y algunos aminoácidos y muchos
otros compuestos también. La espectrofotometría es un método científico para medir cuanta luz absorbe una sustancia
química

Los ácidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta a una longitud de onda de 260 nm. La concentración de
ácidos nucleicos en una muestra se calcula desacuerdo a las siguientes consideraciones: D.O.=1 corresponde
aproximadamente a 50ug/uL de ADN de doble cadena, 40ug/uL ADN de cadena sencilla y 20ug/uL de oligonucleótidos.
La cual es calculada de la siguiente manera:
[DNA] en ng/uL=(50)(D.O.260)

Nota: Debido a que muchas moléculas absorben a 260 nm, esta medición podría estar sujeta a algunas imprecisiones debido a la presencia de otras
moléculas en la muestra.

Las proteínas tienen un máximo de absorción a 280 nm (principalmente por residuos de triptófano) por lo cual lecturas
a esta longitud pueden mostrar si existe algún contaminante proteico. De tal manera, que la relación A 260 /A280 es una
manera común para expresar la pureza del DNA. Un valor de 1.8 a 2.0 indican una muestra pura, mientras que valores
menores indican la presencia de contaminantes tales como fenol y/o proteínas.

A continuación se describen algunos equipos que actualmente son utilizados para la cuantificación de ácidos nucleicos.

Thermo Scientific™ NanoDrop es un espectrofotómetro de UV visible de espectro completo utilizado

para cuantificar y evaluar la pureza de ADN, ARN, proteínas, etc. El NanoDrop mide la absorbancia
total de la muestra, es decir, no puede medir selectivamente ssDNA, dsDNA; no requiere
preparación previa de la muestra y no es necesario hacer una curva estándar.

Invitrogen™ Qubit® es un fluorómetro diseñado para cuantificar de manera específica la

concentración de ácidos nucleicos y proteínas, con la ayuda de colorantes específicos para cada
analito. Se agrega una cantidad específica del “colorante de ADN” a la solución
que se va analizar; la señal de fluorescencia emitida por esa mezcla es
directamente proporcional a la concentración de ADN en esa solución, incluso
en presencia de otras biomoléculas “contaminantes”. El Qubit recoge la señal
de fluorescencia y la convierte en una medición de concentración de ADN, que
hace referencia a una curva de calibración con estándares de concentración
conocida. Ahora la nueva versión del Qubit 4 Fluorometer, puede medir
fácilmente la integridad y la calidad.

The Agilent © 2100 Bioanalyzer System, es una electroforesis automatizada en un chip de

microfluídos específico para el análisis de ADN, ARN o proteínas. Esta electroforesis
altamente precisa permite el análisis de los diferentes amplicones de una PCR multiplex,
fragmentos de restricción, bibliotecas de NGS; midiendo el tamaño y la concentración
precisa de todos los fragmentos de ADN con un amplio rango dinámico para detectar de
pequeñas impurezas en las purificaciones de PCR. La cuantificación de ácidos nucleicos y
proteínas se realiza mediante lecturas de absorbancia tradicionales (A260nm o A280mn).

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La PCR cuantitativa (qPCR) en tiempo real, es una variante de la PCR, utilizada para amplificar y
simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación. Además de los
ingredientes de una PCR convencional, la qPCR utiliza fluoróforos que permita medir ciclo a ciclo los
amplicones generados en un termociclador provisto de sensores de fluorescencia. Podemos clasificar la
qPCR según el empleo de “fluorocromos no específicos” (SYBR Green) o bien por el uso de “Sondas
específicas marcadas con un fluorocromo” (TaqMan, Scorpion, Beacons).

Análisis de DNA por electroforesis en gel.

La electroforesis es un método de separación basado en el empleo de corriente eléctrica

controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica a través de
una matriz (agarosa). Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas 
en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga
opuesta, por lo tanto las moléculas de DNA se desplazaran hacia el polo positivo. La electroforesis
nos permite ver cuántos fragmentos hay de ADN de distintos tamaños. Los ácidos nucleicos que
emigran a mayor velocidad en los geles de agarosa son los que encuentran menor resistencia en
su avance (los de menor tamaño y de conformación más compacta).

Teoría

1. Explica que tipo de carga tiene el ADN. Fundamenta tú respuesta.

2. ¿A partir de cuáles células o tipos de muestras podemos extraer DNA?

3. Menciona 3 metodologías de extracción de DNA.

4. ¿A qué longitud de onda absorbe el ADN y el RNA?

5. En base a los parámetros de calidad del ADN, completa la siguiente tabla.

NanoDrop Qubit BioAnalizar qPCR Gel de Agarosa

Calidad
Cantidad
Integridad

6. Se extrajo ADN de un cepillo con mucosa oral ¿Qué método les aconsejarías utilizar para obtener una cuantificación
exacta de ADN del paciente? Argumenta tu respuesta.

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Ejercicios:

1. La Residente de la especialidad de Genética, realizó las siguientes extracciones de ADN.

a) Calcula la concentración de ADN en base a la absorbancia medida. [DNA] en ng/uL=(50)(D.O.260)
b) Evalúa la eficiencia de las extracciones y argumenta tu respuesta.
c) La Residente dice que eluyó las extracciones de ADN en un volumen de 150uL. Indica la concentración final de
cada muestra.

Resultados:

Concentración Conc. Final

Código Tipo de mtra Abs 260 nm ng/uL
260/280 260/230 ug
Evaluación del ADN

GER0216 SPF 0.25 12.5 1.6 1.2 1.875

GER0217 Leucocitos 3.57 178.5 1.8 1.9 26.775

GER0218 Tejido Fresco 5.794 289.7 1.7 1.9 43.455

GER0219 MO 0.536 26.8 1.7 1.8 4.02

GER0220 FFPE 0.456 22.8 1.4 0.5 3.420

GER0221 SC 1.05 52.5 1.8 1.8 7.875

2. Para la realización de un estudio de exoma, la Clínica Mayo requiere una cantidad de 4 ug de ADN con una calidad
óptima. Explica la situación de cada muestras en base a los requerimientos de la Clínica Mayo e indica que muestras
cumplen con los requisitos.

3. En la siguiente tabla, indica que pruebas se pueden realizar con los DNAs de la tabla anterior e indica que método de
extracción usarías para cada prueba.

PCR punto
Paternidad MLPA Secuenciación NGS CGH qPCR
Final
0.01ug 0.5ug 0.5ug 1 ug 0.1ug 1ug 0.1ug
Calidad > 1 Calidad ≥ 1.8 Calidad > 1 Calidad > 1 Calidad ≥1.8 Calidad ≥1.8 Calidad ≥ 1.8

GER0216
GER0217
GER0218
GER0219
GER0220
GER0221

Método de
Extracción

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