EXTRACCIÓN Y

PURIFICACIÓN DE
ÁCIDOS NUCLEICOS
PRETRATAMIENTO DE LAS
MUESTRAS

APC.BMC 1 11/3/2020
 *La extracción de ADN es el primer
paso de cualquier análisis
molecular: una vez que se ha aislado
el material genético, se pueden:
- identificar variantes genéticas
- diagnosticar a un paciente
- construir mapas genéticos
- identificar a un individuo.

APC.BMC 2 11/3/2020
 * MUESTRA
ESQUEMA GENERAL DE
LAS TÉCNICAS DE
BIOLOGÍA MOLECULAR
EXTRACCIÓN DE ADN

ELECTROFORESIS Y ESPECTROFOTOMETRÍA (verificación

de la extracción , estudio de la pureza y cuantificación del
ADN extraído)

PCR (amplificación del

gen de interés)
Hibridación

ELECTROFORESIS (verificación, secuenciación

pureza)
Otros: RFLP, STRs,
técnicas de ADN
recombinante…
APC.BMC 3 11/3/2020
 CONCEPTOS BÁSICOS
• Los ácidos nucleicos se encuentran
confinados en el interior de las
células:

• Dentro del núcleo en células eucariotas

• En el citoplasma de células procariotas
• Dentro de orgánulos celulares como
mitocondrias (células animales) y
cloroplastos (células vegetales)

APC.BMC 4 11/3/2020
 CONCEPTOS BÁSICOS
• Los ácidos nucleicos están aislados del
medio exterior por:
• Membranas celulares (bicapa lipídica) en
células animales
• Paredes celulares en bacterias, hongos,
levaduras y células vegetales

Las membranas y paredes son una barrera

para acceder a los ácidos nucleicos, que
han de ser extraídos y purificados para su
análisis y manipulación mediante técnicas
de biología molecular.
APC.BMC 5 11/3/2020
 la célula procariota (A), célula eucariota
APC.BMC animal (B) y célula eucariota
6 vegetal (C). 11/3/2020
 CONCEPTOS BÁSICOS
• ¿Qué es la extracción de los AN?:
• Método que los hace accesibles a los
reactivos y enzimas que se emplearán en las
técnicas de biología molecular.
• Consiste en el AISLAMIENTO y
PURIFICACIÓN de los ácidos nucleicos
basándose en sus características físico-
químicas
• Tres fases:
• Pretratamiento de la muestra
• Aislamiento o extracción de los AN
• Purificación

APC.BMC 7 11/3/2020
• El ADN se pueden obtener prácticamente de
cualquier tipo de muestra:
• Sangre
• Tejidos blandos
• Semen
• Saliva y células epiteliales
• Pelos
• Uñas
• Huesos y dientes
• Orina
• Muestras límite: sudor, manchas, objetos…
APC.BMC 8 11/3/2020
•El ARN* sólo de :
• Sangre
• Tejidos blandos
Aislamiento inmediato
 Congelación del tejido en LN2 (NL)
 Empleo de soluciones estabilizadoras

• Se degrada rápidamente por la actividad de

las ARNasas (carece de la protección que
tiene el ADN)
APC.BMC 9 11/3/2020
• El pretratamiento supone, en la mayoría de las
ocasiones, la obtención de una suspensión de
células (células sueltas o agregadas, flotando
en un medio líquido)
• Veremos los pretratamientos en las muestras
más usuales:
• Sangre
• Cultivos celulares
• Tejidos frescos
• Tejidos fijados en formol
• Otras muestras: orina, esputos, células de la
mucosa oral, levaduras y bacterias
APC.BMC 10 11/3/2020
 LA SANGRE

• Una de las muestras biológicas más habituales

para estudiar los ácidos nucleicos de un individuo
• Se obtienen a partir de los leucocitos.
• Muchos de los componentes sanguíneos
interfieren en las técnicas de biología molecular:
• El grupo hemo de la hemoglobina es un potente
inhibidor de la PCR, por lo que un objetivo común en
los distintos pretratamientos es la eliminación de la
hemoglobina por medio de la lisis de los hematíes.

APC.BMC 11 11/3/2020
 LA SANGRE

• Muestra ideal: sangre total anticoagulada con

EDTA, pero la heparina y el citrato sódico
también se pueden usar como anticoagulantes.
• Tiempo para realizar la extracción: en las 24
horas siguientes a la obtención de la muestra
• Se puede conservar en refrigeración a 4º C durante
cinco días.
• Las técnicas que requieren moléculas intactas de ADN
sin fragmentar, como el Southern blot, en nevera no
más de tres días.

APC.BMC 12 11/3/2020
 LA SANGRE
1. La lisis de los hematíes:
• Se rompen los hematíes con una solución o tampón de
lisis en la proporción 1:3
• Se usan soluciones de lisis comerciales, la mayoría de
ellas basadas en fenómenos osmóticos y/o en
detergentes suaves
Solución de lisis de eritrocitos estándar (ósmosis).
Cloruro de amonio (NH4Cl): 150 mM.
Bicarbonato potásico (KHCO3); 10 mM.
EDTA: 1mM.

Solución de lisis de eritrocitos con detergente.

Tris-HCl: 10 mM, pH 8.
Triton X-100: 1%.
Sacarosa: 11%.
APC.BMC 13 11/3/2020
 LA SANGRE

2. Centrifugado de la muestra. Se centrifuga la muestra

lisada y se obtiene un sedimento o pellet y un
sobrenadante.
3. Eliminación del sobrenadante. Se elimina la fracción
líquida sobrenadante con una pipeta Pasteur. Con esto se
eliminarán los componentes del plasma sanguíneo y la
hemoglobina, liberada por la rotura de los hematíes.
4. Conservación del sedimento. En el sedimento habrán
quedado los leucocitos. Continuamos la extracción con
él.
Este pretratamiento también es válido para muestras de
médula ósea.
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APC.BMC 15 11/3/2020
APC.BMC 16 11/3/2020
 LA SANGRE
(investigación de AN de virus)

• La sangre se puede utilizar también como material de

partida para detectar, aislar y estudiar ácidos nucleicos
de algunos retrovirus que infectan linfocitos:
• VIH
• Virus linfotrópicos humanos de células T (HTLV).
• Interesa aislar la células mononucleadas (PBMC, peripheric
blood mononuclear cells): linfocitos y monocitos
• Se separan utilizando la centrifugación en gradiente de
densidad (ficoll-paque®, y otros)

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APC.BMC 18 11/3/2020
APC.BMC 19 11/3/2020
 CULTIVOS CELULARES

• Son un buen material para estudios genómicos y

de expresión génica en determinadas condiciones
y bajo ciertos estímulos.
• Deben recolectarse las células antes de proceder
a la extracción
• Dos situaciones:
• Cultivos en suspensión
• Cultivos en monocapa

APC.BMC 20 11/3/2020
 CULTIVOS CELULARES
EN SUSPENSIÓN
1. Recolectar en un tubo.
2. Eliminar el medio de cultivo mediante centrifugación
3. Lavar las células con tampón o suero fisiológico antes de
iniciar la extracción y purificación de ADN y/o ARN.
EN MONOCAPA
1. Retirar del frasco el medio de cultivo
2. Lavar la monocapa con tampón o solución salina.
3. Iniciar in situ, en el propio frasco, el proceso de
extracción.
4. También puede hacerse pasando parte de la células a un
tubo utilizando un rascador o solución de tripsina
APC.BMC 21 11/3/2020
APC.BMC 22 11/3/2020
 TEJIDOS ANIMALES Y
VEGETALES
• Se requiere homogeneización
• La cantidad de tejido que se va a procesar
dependerá de
• el tipo de tejido (10-25 mg en animales para 10-40 µg ADN)
• el método de homogeneización
• el procedimiento de extracción y purificación de ácidos
nucleicos.

La homogeneización es el tratamiento
mecánico o químico al que se somete un
tejido para liberar las células que lo integran.
APC.BMC 23 11/3/2020
 TEJIDOS ANIMALES Y
VEGETALES

•La homogeneización puede ser

• Mecánica automatizada
• Mecánica manual con mortero
• Química

APC.BMC 24 11/3/2020
 TEJIDOS ANIMALES Y
VEGETALES
• La homogeneización mecánica automatizada:
• El tejido se corta primero en pequeños fragmentos
• Se homogeneiza por la acción mecánica de:
• trituradores mecánicos
• adición de agentes abrasivos y agitación
• por esferas de vidrio o cerámica que colisionan
violentamente contra la muestra mediante un
movimiento de oscilación
• o por sonicación.
• El tejido se coloca en tubo limpio para extracción
• ¡¡Cuidado con la proteasas liberadas!! Usar frío o
inhibidores enzimáticos!!
APC.BMC 25 11/3/2020
 SONICADOR

APC.BMC 26 11/3/2020
 MagNa Lyser (Roche Life Science). Instrumento de mesa
para la homogeneización completa de tejidos mediante el
uso de esferas de cerámica.
APC.BMC 27 11/3/2020
 TEJIDOS ANIMALES Y
VEGETALES
•La homogeneización mecánica manual con
mortero:
• Supone menos degradación
• Se colocan los fragmentos de tejido en un
mortero y se cubren con nitrógeno líquido
• La baja Tª por NL evita formación de cristales, rotura y
degradación por liberación enzimática de otros métodos de
congelación
• Se pulverizan los fragmentos hasta polvo fino y se deja
evaporar el NL
• Se conserva el material hasta la extracción en tubo
limpio
APC.BMC 28 11/3/2020
 TEJIDOS ANIMALES Y
VEGETALES
•La homogeneización mecánica química:
• Se somete el tejido a la acción de proteasas y
detergentes que degradan los componentes tisulares,
disgregando las células.
• Para muestras pequeñas y cortes de tejido en
congelación obtenidos con un criostato
• Se añade a la muestra la mezcla de incubación y se
incuba 37-56 ºC durante 12-24 horas.
• Posteriormente, se retira la muestra y se sigue con el
proceso de extracción

APC.BMC 29 11/3/2020
 TEJIDOS FIJADOS EN
FORMOL E INCLUIDOS EN PARAFINA

APC.BMC 30 11/3/2020
 TEJIDOS FIJADOS EN
FORMOL E INCLUIDOS EN PARAFINA
• El pretratamiento de los tejidos FFPE (formalline fixed
paraffin embedded) consiste en la desparafinización e
hidratación.
• Se procede de la manera siguiente:
1. Se obtienen cortes finos (5-10 µm) del tejido.
2. Se transfieren, unos 5-10 mg de cortes, a un tubo
eppendorf.
3. Se incuba secuencialmente con SUSTITUTO de xilol u otro
agente desparafinante, etanoles de concentración
decreciente y agua destilada, según protocolo.
4. El tejido desparafinado y rehidratado, se somete a
homogeneización química
APC.BMC 31 11/3/2020
APC.BMC 32 11/3/2020
 OTRAS MUESTRAS: BACTERIAS

• El pretratamiento consiste en situar las bacterias y

levaduras en un tampón de suspensión.
• Dos situaciones:
CULTIVOS EN MEDIO LÍQUIDO:
1. Se centrifuga el tubo para eliminar el medio de cultivo
sobrenadante.
2. El sedimento se resuspende en el tampón de
suspensión.
COLONIAS AISLADAS SOBRE UN MEDIO SÓLIDO (PLACA DE
AGAR):
1. Se recoge una colonia de la superficie de la placa con
un asa de siembra estéril.
2. Se resuspende la colonia en el tampón de suspensión
APC.BMC 33 11/3/2020
APC.BMC 34 11/3/2020
 OTRAS MUESTRAS: CÉLULAS
DE LA MUCOSA ORAL
• Mediante raspado de la mucosa oral con torunda o
cepillo.
• la muestra se sumerge en una solución conservante
para que las células se desprendan.
• Mediante enjuague con una solución conservante.
• Recolectando directamente saliva.
• El pretratamiento de las muestras de células de la
mucosa oral, antes de iniciar la extracción,
consistirá en centrifugar la suspensión celular y
eliminar el sobrenadante.
APC.BMC 35 11/3/2020
APC.BMC 36 11/3/2020
 OTRAS MUESTRAS: ESPUTO

• Material de partida para detectar o confirmar

la presencia de microorganismos patógenos
causantes de infecciones respiratorias.
• El pretratamiento consiste en la fluidificación
con un agente mucolítico del tipo de la N-acetil-
L-cisteína (NALC) en una disolución de citrato
sódico.
• Si el microorganismo que se quiere detectar es
una micobacteria se puede añadir también
hidróxido sódico para descontaminar la muestra.
• Solución mucolítica y descontaminante para
esputos
APC.BMC 37 11/3/2020