LABORATORIO DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA III

PRÁCTICA No. 3
EFECTO DEL pH Y LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
INTRODUCCIÓN
En los sistemas biológicos existen los catalizadores que termodinámicamente funcionan de forma parecida a los
catalizadores químicos, es decir reduciendo la energía de activación de la reacción. De otra manera, con la
participación de las enzimas se puede llevar a cabo, reacciones químicas que, sin su presencia, podrían ser muy
prolongadas o imposibles. Los catalizadores biológicos y los químicos tienen características fisicoquímicas muy
diferentes, que pueden ser parametrizadas siguiendo los cambios de pH o temperatura La temperatura afecta a
las reacciones químicas; sin embargo, debido a la naturaleza proteica, la desnaturalización térmica hará que
disminuya su concentración efectiva proteica y por lo tanto también su velocidad de reacción. La velocidad de
muchas reacciones enzimáticas se duplica aproximadamente por cada 10 °C de aumento de temperatura (Q 10=2).
Sin embargo el coeficiente de temperatura Q 10 varía de una enzima a otra, debido a la energía de activación (E a)
catalizada, es decir de la altura de la barrera de energía para pasar al estado de transición.
OBJETIVO
Que el alumno evalúe el efecto del pH y temperatura en la actividad enzimática

MATERIALES REACTIVOS
20 Tubos con tapa de rosca (pequeños) 2,6-dimetoxifenol (2,6-DMP) (profesor)
1 Gradilla para tubos Reactivo de Bradford (profesor)
1 Probeta de 100 mL Fosfato Monobasico de Potasio
4 Vasos de precipitados de 100 mL Fosfato Dibasico de potasio
1 Micropipeta de 100-1000L Glicina
1 Micropipeta de 10-100L HCl
1 Piceta con agua destilada Acido Cítrico
1 Vortex Citrato de Sodio
1 Baño María con temperatura controlada Acido Acético
1 Palangana Acetato de Sodio
1 Termómetro 0-100ºC ALUMNOS
1 Espectrofotómetro Tijeras
2 Celdas de acrilico (profesor) Franela
Pipeta Pasteur Maskintape y Plumón con tinta Indeleble
Papel Seda
Puntas para Micropipeta (profesor)

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES (traer cálculos de la soluciones)

(UN ALUMNO DE CADA EQUIPO SE PRESENTARA AL LABORATORIO PREVIO A LA PRACTICA )

1. Preparar 50mL de soluciones amortiguadoras de glicina-HCl pH 2.0, citratos pH 3.0 y 4.0, acetatos pH 5.0,
fosfatos 50 mL pH 6.0 y pH 7.0, Tris-HCl pH 8.0, a una concentración de 50mM.
2. Solución de Sustrato Enzimático:2,6 dimetoxifenol (2,6DMP) 0.5 mM, 250 mL en H2O destilada.
3. Solución de enzima: 50 mL de Solución de enzima lacasa MtL en amortiguador de fosfatos 0.5mM a pH 6.0.

PROCEDIMIENTO

Ensayo enzimático para pH (EQUIPOS PARES)

A. Disponer 7 tubos de ensaye y su duplicado (14 tubos totales) de la forma siguiente: No adicione la solución
de enzima hasta que prepare todas las diluciones.
Tubo pH Amort. (µL) 2,6 DMP(µL)
1 2 400 500
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2 3 400 500
3 4 400 500
4 5 400 500
5 6 400 500
6 7 400 500
7 8 400 500

B. Prepare un Blanco de calibración con 500µL de H2O y 500 µL de 2,6-DMP.

C. Encender y elegir la opción de cinética en el espectrofotómetro con la siguientes condiciones: 469 nm,
tiempo de retardo = 0 minutos, intervalos de 25 segundos, tiempo total 5 minutos.
D. Una vez preparados todos los tubos, ajustar el blanco espectrofotométrico y adicionar al tubo con
amortiguador pH 2 (tubo 1), la cantidad correspondiente de 100 µL de solución de enzima, agitar
rápidamente, depositar esta en una celda de acrílico y tomar las lecturas de la absorbancia vs tiempo, cada 25
segundos hasta que se cumplan los 5 minutos. Efectuar el mismo proceso para demás tubos adicionando 100
µL de solución de enzima hasta el momento en que se determine la actividad.

Ensayo enzimático para temperatura (EQUIPOS NONES)

E. Disponer 9 tubos de ensaye y su duplicado (18 tubos totales) de la forma siguiente:
Tubo T (ºC) Amort pH 6.0 (µL) µL 2,6-DMP
1 25 800 100
2 30 800 100
3 40 800 100
4 50 800 100
5 55 800 100
6 60 800 100
7 70 800 100
8 75 800 100
9 80 800 100
F. Prepare un Blanco de calibración con 900µL de amortiguador respectivo y 100µL de 2,6-DMP.
G. Incube a la temperatura correspondiente los siguientes tubos: el tubo con enzima, un tubo con 2 mL de
2,6DMP, y el tubo blanco a cada temperatura, durante 2 minutos exactos.
H. Una vez acondicionados los tubos a la temperatura indicada, ajustar el blanco espectofotométrico y adicionar
al tubo que contiene la enzima, 1.5 mL de 2,6-DMP, agitar rápidamente y tomar las lecturas de la
absorbancia vs tiempo, cada 25 segundos hasta completar 5 minutos. Efectuar el mismo proceso para demás
tubos, ajustando con el blanco respectivo a la temperatura correspondiente.

Ensayo de Proteina (Bradford)

En otros tubos efectuar 3 diluciones para los extractos de hongo hasta obtener un volumen final de 800L de
extracto. Una vez efectuadas las diluciones, se adicionan 200L de Reactivo de Bradford, agitar y reposar los
tubos durante 10 minutos y tomar la lectura de la absorbancia de cada tubo en la longitud de onda de 595 nm,
previamente ajustando el espectrofotómetro con un blanco de amortiguador de fosfatos tratado en la misma
forma
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
a) Reportar una tabla y un gráfico de las curvas de progreso en unidades internacionales específicas vs tiempo
(min).
b) Reportar la gráfica de actividad óptima que obtuvo (UIE vs pH) y el pH óptimo correspondiente y comparar
el resultado obtenido experimentalmente con el investigado en literatura.
c) Reportar la gráfica de actividad óptima que obtuvo (UIE vs T) y la T óptima correspondiente y comparar el
resultado obtenido experimentalmente con el investigado en literatura.
CUESTIONARIO
1. ¿Qué diferencia existe entre la actividad y la estabilidad de una enzima?

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2. ¿Qué influencia tiene a nivel molecular el pH y la fuerza iónica del medio sobre las enzimas, su actividad y
en la conformación del sitio activo?
3. ¿Qué parámetros calcularía para establecer las diferencias correspondientes al efecto de la temperatura sobre
la actividad y que modelo aplicaría?
4. ¿Qué es el Q10 y que significado tiene?
5. ¿ A que temperatura se encuentra la actividad óptima de la lacasa y a cual se desnaturaliza?
6. Si efectuáramos la determinación de Bradford a temperatura alta ¿Porque se detecta proteína soluble a altas
temperaturas pero la actividad enzimática disminuye?
BIBLIOGRAFÍA
1) Aiba S., Humphrey A. E. y Millis N. F. (1973) Biochemical Engineering, Second Edition. Academic Press
Inc. London.
2) Segel C. (1976) Enzyme Kinetics. Edition, John Wile & Sons. NY, USA.
3) Wang D. I., Cooney C. L., Demain A. L., Dunnill P., Humphrey A. E. and Lilly M. D. (1979) Fermentation
and Enzyme Technology. John Wiley & Sons. NY. USA.
4) Chung Lo S., Sze Ho Y., Buswell J. A. (2001) Effect of phenolic monomers on the production of laccases by
the edible mushroom Pleurotus sajor-caju, and partial characterization of a major laccase component.
Mycologia: 93 (3): 413–421.

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