Práctica No 6 y 7: Determinación de la actividad enzimática

Práctica No 6 y 7: Determinación de la
actividad enzimática

INTRODUCCION

Prácticamente todas las reacciones químicas que tienen lugar en los seres vivos están catalizadas
por enzimas. Las enzimas son biocatalizadores específicos: cada enzima cataliza un solo tipo de
reacción, y casi siempre actúa sobre un único sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos. En
una reacción catalizada por un enzima, se puede describir que:

1. La sustancia sobre la que actúa la enzima se llama sustrato.

2. El sustrato se une a una región concreta del enzima, llamado sitio activo. El sitio activo
comprende un sitio de unión formado por los aminoácidos que están en contacto directo
con el sustrato y un sitio catalítico, formado por los aminoácidos directamente implicados
en el mecanismo de la reacción.
3. Una vez formados los productos el enzima puede comenzar un nuevo ciclo de reacción.

Las enzimas, a diferencia de los catalizadores inorgánicos catalizan reacciones específicas. Sin
embargo, hay distintos grados de especificidad. La enzima alfa-amilasa es muy específica: y solo
rompe el enlace alfa- glucosídico del almidón o de compuestos muy similares. Así, para la enzima
sacarasa, la sacarosa es su sustrato natural, mientras que la maltosa y la isomaltosa son sustratos
análogos. La enzima actúa con máxima eficacia sobre el sustrato natural y con menor eficacia sobre
los sustratos análogos. Entre las enzimas poco específicas están las proteasas digestivas como la
quimiotripsina, que rompe los enlaces amida de proteínas y péptidos de muy diverso tipo.

La catalasa es un enzima que está presente en casi todas las células animales, en órganos como:
eritrocitos, hígado y riñón. Está presente también en todos los materiales vegetales y en casi todos
los microorganismos diferentes de los anaerobios obligados. En todos los casos, la catalasa impide
la acumulación de peróxido de hidrogeno (H 2O2) que se forma por la oxidación aeróbica de las
flavoproteínas reducidas en muchas oxidaciones biológicas. Las catalasas son enzimas ferro-
porfirinicas, tienen un peso molecular de 230000-250000 y contienen cuatro grupos hemo por
molécula de enzima. Sus subunidades no tienen actividad y la velocidad de recambio para esta
enzima es una de las más altas conocidas; una molécula de catalasa puede descomponer 44000
moléculas de H2O2 por segundo y su pH óptimo es 7.0.

La catalasa es muy específica y cataliza la siguiente reacción:

La presencia de inhibidores como los iones cianuro que forman complejos muy estables con enzimas
que tienen hierro férrico, lo inactivan. Los citocromos y la catalasa por ejemplo, contienen hierro
férrico por tanto el cianuro las inhibe de manera no competitiva.

OBJETIVOS

1. Determinar la actividad enzimática de la catalasa sobre el peróxido de hidrógeno.

2. Observar el efecto de los iones cianuro (CN-) sobre la actividad enzimática.
3. Observar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática

MATERIALES Y REACTIVOS

10 Tubos de ensayo y una gradilla 550 ml de Agua destilada

1 pipeta de 5 ml 100 ml de Solución de Hidroquinona al 0.5% recién pre

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1 pipeta de 1ml 100 ml de Cianuro de sodio

2 Tubos de centrifuga (plásticos) 100 ml de HCl al 1%
1 mortero con su mazo 100 ml de NaOH al 1%
1 espátula 100 ml de Peróxido de Hidrogeno 0.5%
1 pipeteador. Cubeta con hielo
1 cuchilla

Una Papa cruda pelada y picada, y, una papa cocinada pelada y picada (Traído por
estudiantes)
Una Habichuela cruda y picada (Traída por los estudiantes)

PROCEDIMIENTO

1. Parte A- Experimental:

A. ACCION DE LA CATALASA EN EXTRACTOS VEGETALES

1. Extracción y preparación de la Enzima:

- Pesar 5 gramos de un extracto vegetal (habichuela) y macerarlo con 5mL de agua destilada,
hasta formar una masa homogénea y fina.
- Pasar el macerado o extracto a un tubo de centrifuga y centrifugar a 5000 rpm por 5 minutos.
- Del centrifugado separar el sobrenadante en un tubo de ensayo, marcarlo y conservarlo en
frio.

2. Determinación de la actividad enzimática:

Marcar siete tubos de ensayo del 1 al 7 y agregue en orden los reactivos que se encuentran en la
siguiente tabla:

Reactivos 1 2 3 4 5 6 7
Sol. de Hidroquinona (ml) 0 1 1 1 1 1 1
Sol. de H2O2 (ml) 0 1 1 1.5 2 2.5 3
Agua destilada (ml) 4 3 2 1.5 1 0.5 0
Sol. de Enzima (ml) 1 0 1 1 1 1 1

Observar lo que ocurre en cada uno de los tubos. Determine el tiempo que tarda cada uno de los
tubos en cambiar de color. Es posible que este proceso se tarde algunos minutos. Anote sus
resultados.

B. FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Para determinar el efecto de la temperatura, el pH y otros agentes químicos sobre la actividad de la

enzima proceda de la siguiente manera:

1. Efecto de la temperatura sobre la actividad de la catalasa:

Tome 4 tubos de ensayo. Enumérelos y coloque en cada uno de ellos las siguientes sustancias:

Reactivos 1 2 3 4
Sol. De H2O2 (mL) 1 1
H2O destilada (mL) 1 1
Trozo de papa cruda 1 1
Trozo de papa cocinada 1 1

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Observe cada uno de los tubos y anote sus resultados

2. Efecto del pH sobre la actividad de la catalasa:

Tome cuatro tubos de ensayo, enumérelos y coloque en cada uno de ellos las siguientes sustancias.
Tenga la precaución de colocar de último la enzima

Reactivos 1 2 3 4
Sol. De H2O2 (mL) 1
H2O destilada (mL) 1
NaOH (mL) 1
HCl (mL) 1
Trozo de papa cruda 1 1 1 1

Observe cada uno de los tubos y anote sus resultados

3. Efecto de inhibidores sobre la actividad de la catalasa:

Tome dos tubos de ensayo, enumérelos y coloque en cada uno de ellos las siguientes sustancias.
Tenga la precaución de colocar de último la enzima.

Reactivos 1 2 3
Sol. De H2O2 (mL) 1
H2O destilada (mL) 1 1
Cianuro de sodio (mL) 1 1
Trozo de papa cruda 1 1 1

Observe cada uno de los tubos y anote sus resultados

2. Parte B- Uso de Simuladores:

C. ACTIVIDAD ENZIMATICA: DETERMINACIÓN DEL pH Y TEMPERATURA OPTIMA DE UNA

ENZIMA

1. Ingresar a http://biomodel.uah.es/en/lab/abs/activ_enz.htm
2. Lea las instrucciones de uso.
3. Selecciones 10 valores de pH y 10 valores de T, y registre los valores de absorbancia
4. Grafique la variación de la absorbancia en relación con el pH. ¿Cuál es el valor de pH óptimo?
5. Grafique la variación de la absorbancia en relación con la T. ¿Cuál es el valor de T óptima?
6. Con el valor de pH óptimo calculado, cambie los valores de T y registre los valores de
absorbancia
7. Con el valor de T óptima calculado, cambie los valores de pH y registre los valores de
absorbancia
8. Vuelva a realizar las gráficas y compare los resultados.
9. Consulte los valores teóricos del pH y T óptimos para la enzima estudiada, Compárelos con
os resultados obtenidos en el experimento.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué influencia tiene la concentración del sustrato sobre la velocidad enzimática?

2. Elabore la gráfica de concentración de sustrato versus tiempo de la reacción.
3. ¿Por qué los factores como temperatura, pH y metales pesados inciden en la actividad de la
enzima?

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4. ¿En qué tejidos animales y vegetales se encuentra esta enzima? ¿Qué ocurriría si un
organismo carece de la enzima?
5. ¿Qué tipo de inhibidor es el Mercurio? Sustente su respuesta.

BIBLIOGRAFIA

BOHINSKY R. Bioquímica. Quinta edición. Editorial ADDISON-WESLEY IBEROAMENRICANA. 1991.

KARP, G. Biología Celular y Molecular. Editorial McGraw-Hill Interamericana. 1998.
MATHEWS, C., HOLDE, K., AHERN, K. Bioquímica. Tercera Edición. Editorial Addison Wesley. 2002.
MELO, V., CUAMATZI, O. Bioquímica de los Procesos Metabólicos. Editorial REVERTE, S.A. 2006.

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