FACULTAD DE Bioquímica I Ingeniería en

INGENIERIA QUÍMICA Biotecnología

CINETICAS DE POLIFENOLOXIDASAS

Introducción
El oscurecimiento desarrollado en superficies cortadas o golpeadas de frutas, vegetales y
mariscos que están expuestos al aire es llamado oscurecimiento enzimático debido a que las
reacciones iniciales involucradas están catalizadas enzimáticamente. La enzima responsable de la
iniciación de esta reacción de oscurecimiento recibe varios nombres incluyendo fenolasa,
fenoloxidasa, tirosinasa, polifenoloxidasa y catecolasa. Estas oxidasas están presentes en:
• Animales: En este caso es comúnmente llamada tirosinasa porque la tirosina es uno de sus
substratos. Una función importante de la tirosina es catalizar la formación de pigmentos
café melanina, los cuales imparten color a la piel, cabellos y ojos.
• Vegetales: Llamada polifenoloxidasa (PPO) sugiriendo que sus principales sustratos son
compuestos fenólicos. La función de esta enzima en las plantas es desconocida, pero es la
responsable de los significativos cambios de color (benéficos o no deseados) en muchos
alimentos.
La actividad de la PPO puede ser determinada por la medición de oxígeno consumido,
consumo de sustrato, o formación de indol-5,6-quinona que es producto de la oxidación de la
tirosina catalizada por PPO. La tirosina siendo un monofenol primero es hidrolizada a 3,4-
dihidroxifenilalanina (dopa) y luego es oxidada a indol-5,6-quinona (IQ).

Tirosina 3,4-dihidroxifenilalanina (dopa) Indol-5,6-quinona

Fig. 1 La acción de PPO en tirosina para producir indol-5,6-quinona

Objetivo general
Determinar la actividad y parámetro cinéticos de la PPO extraída de papas usando 3,4-
dihidroxifenilalanina (dopa) como sustrato y monitoreando la reacción por la formación de indol-5,6-
quinona (IQ).

Objetivos específicos
• Revisar conceptos básicos de cinética enzimática.
• Realizar la preparación de un extracto enzimático crudo.
• Realizar un ensayo enzimático
• Estudiar la cinética de la polifenoloxidasa.

Material por equipo Reactivos por equipo

1 Probeta de 50 ml 50 ml Buffer A frío.
1 Vaso para licuadora. 30 ml Buffer B
1 Matraz kitasato de 125 mL. 15 ml de DOPA. Protegerlo de la luz.
1 Embudo Buchner (para el matraz de 125 ml) Prepararlo un hora antes de la práctica.

2 Papel filtro Whatman No. 1

Papas crudas (Mantener refrigeradas
1 Manguera de latex.
toda la noche). Suministrado por los
1 Matraz Erlenmeyer de 125 ml estéril.
alumnos.
1 Pipeta automática de 200 µl.
1 Pipeta automática de 1000µl.
25 Puntas de 200. Estériles.
25 Puntas de 1000µl. Estériles.
Equipos
5 celdas de plástico de 3.5 ml.
Balanza portátil.
1 caja para celdas vacía
Licuadora.
1 Baño con Hielo frapé.
Espectrofotómetro 475 nm.
01 Cronómetro.
01Tabla para cortar.
01 Cuchillo.
1 Celda de plástico 3.5 ml
1 Pizeta con agua destilada
Preparación de soluciones
Buffer A
Pesar 4.199 g de NaF (0.1 M) y disolver en un poco de buffer B. Aforar a 1000 ml con buffer B.

Buffer B. Fosfato de sodio 0.1 M

Pesar 14.2 g de Na2HPO4 y disolver en aproximadamente 900 ml de agua destilada, ajustar el pH a
6.8 con ácido fosfórico o NaOH y aforar a 1000 ml.

Dopa (3,4-dihidroxifenilalanina)
Preparar una solución de 4 mg dopa/ml en buffer B como se describe a continuación.
Pesar 400 mg de dopa y agregar 10 ml de HCl 0.1 N, adicionar 80 ml de buffer B y ajustar el pH a 6.8
con KOH 1.0 N, diluir a 100 ml con buffer B. Puede ser necesario calentar ligeramente la solución
con HCl sólo hasta que se disuelva el dopa.
Preparar esta solución el mismo día en que se vaya a utilizar, mantenerla tapada y protegida de la luz.

Ácido clorhídrico 0.1 N (PM 36.16 g/mol, pureza 37.2% y densidad 1.19 g/L)
A 8.16 ml de HCl añadir agua destilada lentamente y aforar a 1000 ml.

Hidróxido de potasio 1.0 N (PM 56.11, pureza 87%)

Pesar 64.49 g de KOH y disolver en 500 ml de agua destilada y aforar posteriormente a 1000 ml.

Buffers preparados por los alumnos en la práctica de “Preparación de buffers”, pH 4, 5, 8 y 9. Se

necesitan 2 ml de cada uno.
Desarrollo
A) Preparación de extracto enzimático crudo
1. Pelar una o varias papas crudas y cortar en pequeños trozos.
2. Pesar rápidamente 10 g de papa y mezclar con 50 ml de buffer A en un baño con hielo.
3. Licuar la mezcla durante aproximadamente 1 min.
4. Filtrar la mezcla con papel Whatman No. 1.
5. Mantener el filtrado en un matraz Erlenmeyer de 125 ml sumergido en un baño de hielo hasta
que se vaya a utilizar.
B) Ensayo enzimático
1. Preparar los tubos para el ensayo con las soluciones y cantidades que se indican en el siguiente
cuadro.
Soluciones
Buffer B Dopa Extracto
Tubo
(µl) (µl) enzimático(µl)
1 1250 0 250
2 1200 50 250
3 1175 75 250
4 1150 100 250
5 1100 150 250
6 1050 200 250
7 1000 250 250
8 950 300 250
9 250 1000 250
10 400 1000 100
11 350 1000 150
12 300 1000 200

2. Preparar el espectrofotómetro a 475 nm y blanquear con agua destilada. Blanquear antes de

cada ensayo.
3. Iniciar la reacción adicionando el extracto enzimático, mezclar y leer la absorbancia
inmediatamente. Tomar lecturas a intervalos de 15 segundos durante 2 minutos para cada
tubo.
Datos
Absorbancia 475 nm
Tubo 0 seg 15 seg. 30 seg 45 seg. 60 seg. 75 seg. 90 seg 105 seg 120 seg
1
2
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4
5
6
7
8
9
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Bibliografía consultada.
Miller D. Dennis (1998).Food chemistry. A laboratory Manual. USA. Ed.. John Wiley. 44-53.

Haschemere H. Rudy and Hanschemeyer E. V. Audrey. (1973). Proteins: A guide to study by

physical and chemical methods. Edit. John Wiley and Sond, New York, London, Toronto. Principles
and practice. Second edition, Springer-Verlang.