DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

Universidad de Córdoba

Prácticas de Bioquímica
Grado de Veterinaria. 1er curso

Práctica de Laboratorio nº 3
ANÁLISIS CUANTITATIVO DE GLUCOSA MEDIANTE EL MÉTODO DE LA
GLUCOSA OXIDASA

INTRODUCCIÓN
La sangre es un tejido orgánico en forma de líquido viscoso de color rojizo, constituido por elementos celulares libres
(eritrocitos, glóbulos blancos y plaquetas) que son transportados por el plasma, un fluido traslúcido y amarillento que
representa la matriz extracelular. El plasma también contiene hormonas, solutos de bajo peso molecular como gases,
sales, glucosa, etc., además de proteínas. La sangre completa es inestable y, de no tomar precauciones, se coagula y
hemoliza rápidamente alterándose su composición. Así, en ausencia de anticoagulantes (e.g. oxalato sódico, EDTA,
heparina, etc.) se activa la cascada de zimógenos implicados en la coagulación sanguínea. De este modo, se forma un
coágulo que se retrae, liberándose un líquido llamado suero. La mayoría de determinaciones analíticas se hacen en
suero, en vez de en sangre completa o en plasma, debido a la facilidad de su obtención y conservación (se mantiene casi
indefinidamente a ̶ 20°C) y por la ausencia de sustancias que puedan interferir en dichas determinaciones.
Los glúcidos son las biomoléculas más abundantes en la Naturaleza y componentes esenciales de los seres vivos,
desempeñando funciones muy variadas e importantes: reserva energética, estructural, reconocimiento celular, etc. Son
las primeras biomoléculas sintetizadas en la fotosíntesis y las principales vías metabólicas transcurren a través de ellos.
La glucosa (un monosacárido del tipo aldohexosa) es el glúcido más abundante en los seres vivos y constituye el eje
central del metabolismo celular. En los animales, la principal fuente de glucosa es la degradación de los carbohidratos
incorporados a través de la dieta diaria, aunque también contribuyen los procesos de gluconeogénesis (síntesis de novo a
partir de precursores no glucídicos) y glucogenolisis (degradación del depósito de glucógeno hepático). El nivel de
glucosa en sangre se regula mediante la actuación coordinada de diversas hormonas (insulina, glucagón, adrenalina,
etc.). La hiperglucemia (aumento anormal en la concentración de glucosa sanguínea), hipoglucemia (disminución anormal
de la concentración de glucosa sanguínea), y la variabilidad en los niveles de glucosa son problemas importantes en
clínica ya que se asocian con un incremento en la tasa de morbilidad y mortalidad. Así, en animales sanos se produce un
aumento de glucosa en sangre después de la ingesta, durante una situación de estrés o excitación, o durante la
anestesia general, aunque también puede ser indicativa de diferentes enfermedades (e.g. diabetes mellitus, lesiones
hepáticas, etc.) o de disfunciones metabólicas (hiperactividad de las glándulas adrenales, tiroides o pituitaria,
hiperadrenocorticalismo, etc.). Por el contrario, la hipoglucemia se observa en tumores secretores de insulina,
hipopituitarismo, disfunciones de las glándulas suprarrenales, condiciones que interfieren con su absorción, inanición, etc.
Por todo ello, los métodos precisos de determinación y cuantificación de glucosa son muy importantes ya que
proporcionan a los veterinarios una importante herramienta de evaluación y diagnóstico clínico.

OBJETIVO
El principal objetivo de esta práctica es familiarizarse con técnicas analíticas usadas en los laboratorios clínicos para
determinar la concentración de glucosa en sangre, conocer su fundamento así como adquirir destreza en el cálculo de
concentraciones y diluciones.

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 FUNDAMENTO
A diferencia de otras biomoléculas (ácidos nucleicos, proteínas, etc.), la glucosa no tiene un espectro de absorción
característico que permita su medida espectrofotométrica directa. Sin embargo, el interés clínico de su determinación,
tanto en sangre como en orina, ha impulsado el desarrollo de varios métodos químicos y de diversos ensayos
enzimáticos para la valoración precisa de este azúcar.
A este respecto, los ensayos enzimáticos para la determinación de biomoléculas son específicos, reproducibles,
sensibles y rápidos, y por tanto, son idóneos para las determinaciones analíticas de metabolitos. Entre los ensayos
enzimáticos para la determinación de la concentración de glucosa en muestras biológicas destaca el método de la
glucosa oxidasa. Éste se basa en el esquema que se resume a continuación:
La glucosa oxidasa cataliza la oxidación del grupo
aldehído del C1 de la glucosa originando ácido
glucónico (gluconato) y peróxido de hidrógeno. En una
segunda reacción el peróxido de hidrógeno generado
reacciona con un cromógeno consistente en una mezcla
de fenol y 4-amino-fenazona (que es prácticamente
incolora). Esta reacción, denominada Reacción de
Trinder, éstá catalizada por una peróxidasa, y en la
misma se genera una quinonimina de color rosa intenso
que presenta un máximo de absorción a una λ =
505 nm. La intensidad del color es proporcional a la
concentración de glucosa presente en la muestra.
Puesto que se trata de un método indirecto, la
concentración de glucosa en una muestra problema se
determina por comparación con una recta de calibrado
(o recta patrón) preparada con una solución de glucosa
de concentración conocida. Cada grupo preparará una
recta de calibrado y determinará la concentración de glucosa en muestras de suero de vaca o cerdo.

MATERIAL
• Agua destilada
• Solución patrón de glucosa comercial al 0,2 % (p/v) en agua destilada.
• Suero problema de vaca y/o cerdo.
• Reactivo de trabajo: glucosa oxidasa 10 U/ml; fenol 5 mM; 4-amino-antipirina 0,4 mM; peroxidasa 1 U/ml; fosfato
potásico 100 mM pH 7,5.
• Tubos de ensayo y tubos Eppendorf
• Pipeta de vidrio de 5 ml.
• Propipeta
• Micropipetas p200 y p1000
• Puntas amarillas y azules.
• Vortex
• Espectrofotómetro ajustado a λ = 505 nm.
• Cubetas espectrofotómetro
• Rotuladores para vidrio
• Papel de laboratorio
• Frascos lavadores

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 PROTOCOLO
Para elaborar la recta de calibrado necesaria para poder estimar la concentración de glucosa en el suero problema,
cada grupo preparará en seis tubos de ensayo marcados desde la A hasta la F, las siguientes disoluciones de glucosa
diluyendo en agua una solución de glucosa comercial estándar al 0,2% (p/v):

DILUCIONES DE LA SOLUCIÓN PATRÓN DE GLUCOSA COMERCIAL AL 0,2 % (p/v)

Reactivos A B C D E F
Agua destilada (ml) 4,95 4,9 4,8 4,7 4,6 4,5
Glucosa comercial estándar 0,2 % (p/v) (ml) 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Agitar las soluciones en el vortex

A continuación, se prepara una serie de tubos Eppendorf marcados como se indica en la siguiente Tabla. Añadir a
cada tubo 0,9 ml del reactivo de trabajo y 0,1 ml de la dilución de glucosa correspondiente de entre las preparadas
anteriormente (A-F), de manera que el volumen final sea 1 ml. Incluir también tres tubos sin glucosa: uno para el blanco
con 0,1 ml de agua destilada y otros dos con 0,1 ml de cada uno de los sueros problemas (SP1 y SP2) previamente
diluidos.

TUBO Nº
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5 6 SP1 SP2

Reactivo de trabajo (ml) 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9

Agua destilada (ml) 0,1 --- --- --- --- --- --- --- ---
Solución de glucosa --- 0,1 (de A) 0,1 (de B) 0,1 (de C) 0,1 (de D) 0,1 (de E) 0,1 (de F) --- ---
comercial diluida (ml)

Suero problema diluido (ml) --- --- --- --- --- --- --- 0,1 0,1

Agitar en el Vortex para mezclar bien

Incubar durante 20 min a temperatura ambiente (el color es estable al menos 2 horas tras los 20 min)
Leer la absorbancia a λ = 505 nm, ajustando previamente el espectrofotómetro con el Blanco

Las muestras se leen en el espectrofotometro a λ = 505 nm con una cubeta de plástico apropiada para las celdillas
de los espectrofotómetros.
Se ajusta el espectrofotómetro con el Blanco a cero de absorbancia y a continuación se leen las restantes muestras y
los correspondientes valores de A505 nm obtenidos se anotan en la tabla de la última página del protocolo.
Se representará la recta de calibrado con los resultados de los tubos 1 al 6 (A505 nm frente a mg/dl de glucosa
comercial). Para calcular la concentración de glucosa en estos tubos hay que calcular previamente las concentraciones
de glucosa (mg/dl) en los tubos A a F.
La concentración total de glucosa del suero problema se obtendrá interpolando sobre la recta de calibrado el valor de
A505 nm obtenido en el tubo problema y teniendo en cuenta el factor de dilución total aplicado durante la ejecución de la
práctica.

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 Los valores normales de glucosa en el suero de distintos animales son:

Especie animal Glucosa (mg/dl)

Perro 70-110
Gato 50-75
Caballo 75-115
Vaca 45-75
Oveja 50-80
Cabra 50-75
Cerdo 85-150

Al finalizar el proceso experimental el alumno analizará sus resultados y contestará a las cuestiones que se
plantean en la última hoja que deberá entregar al finalizar la práctica

PREVENCION DE RIESGOS Y MEDIDAS DE SEGURIDAD

Antes de realizar esta práctica de laboratorio es necesario haber leído detalladamente y comprendido el documento
“PREVENCIÓN DE RIESGOS Y MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA”
que se encuentra a disposición del alumnado. De forma general, durante la realización de las prácticas de laboratorio de
esta asignatura se seguirán de forma estricta las normas que se detallan en el mismo.
De manera específica, en esta práctica se guardará especial atención al uso de las pipetas de cristal y a la
colocación de las propipetas en las mismas para evitar posibles accidentes por rotura de las pipetas.
En cuanto a los reactivos empleados en esta práctica, en las fichas de datos de seguridad de los mismos se recoge
que “no son peligrosos según el reglamento (CE) No. 1272/2008”, ya que “sus componentes no son peligrosos o se
encuentran en muy pequeñas concentraciones”. Además, “los productos empleados no conllevan reacciones peligrosas
si se usan adecuadamente”. No obstante, durante la realización de la práctica además de la bata de laboratorio se
llevará protección de manos (guantes desechables) y en caso de sospecha de contacto con la piel u ojos, se lavará la
zona afectada con agua abundante.
Los residuos generados durante la práctica se eliminarán siguiendo las indicaciones del profesorado, de acuerdo con
la normativa del SEPA (Servicio de protección Ambiental) de la Universidad de Córdoba en función de la naturaleza de
los mismos.

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 APELLIDOS Y NOMBRE: ................................................................................. DNI:............................. Firma:...............................
Fecha: ............................................................................................................... Grupo y Puesto de trabajo: ................................

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[Glucosa patrón]
Tubo Nº A505 nm
1. Completa la tabla y representa la recta de calibrado: mg/dl
A505 nm en función de la concentración de glucosa (mg/dl). Blanco
Explica detalladamente con alguno de los tubos de la recta
1
patrón (1 a 6) como has calculado la concentración de
glucosa final partiendo de la solución de glucosa comercial 2
al 0,2% (p/v). 3
4
5
6
Suero 1 diluido
Suero 2 diluido

2. Calcula la concentración final de glucosa (mg/dl) en los sueros problema (explica detalladamente como lo haces y
prestando atención a las unidades). Razona a cuál especie (vaca o cerdo) pertenece cada uno.

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