PRUEBAS DIAGNÓSTICAS

SEROLÓGICAS

Carrera: Medicina Veterinaria- UST

MSc. Evelin Troncoso
 SEROLOGÍA

“ Estudio de los anticuerpos de la

sangre (suero) y sus reacciones con los
antígenos” Abras et al., 2014

El suero es el líquido libre de células que permanece cuando

la sangre forma un coágulo.
 PRUEBAS DE
INMUNODIAGNÓSTICO

PRUEBAS DE UNIÓN PRIMARIA PRUENAS DE UNIÓN SECUNDARIA

(miden directamente la unión de (miden el resultado de la interacción
antígeno al anticuerpo) antígeno - anticuerpo)
 PRUEBAS DE UNIÓN SECUNDARIA

Son aquellas en las cuales la reacción antígeno-anticuerpo da lugar a una

manifestación visible lo cual permite una lectura visual macroscópica.

Son, generalmente económicas y sencillas.

Se caracteriza por la aparición de un fenómeno visible como la aglutinación

o la precipitación.
 AGLUTINACIÓN

Se basan en la unión de antígenos particulados a los anticuerpos.

Como los anticuerpos son bivalentes, pueden establecer enlaces cruzados

con antígenos particulados, como una bacteria o eritrocitos extraños,
originando su agrupamiento o aglutinación.

Son muy sencillas de realizar, no requieren de ningún equipamiento para

su lectura, son rápidas y fáciles de implementar.
Se utiliza regularmente en la Serotipificación bacteriana
o la Hemoclasificación.
– REACCIÓN POSITIVA: Los Ac frente a esos epitopos producirán la correspondiente
aglutinación y formación de Inmuno complejos (IC), evidenciándose mediante la aparición de un
velo malla característico en el medio.

– REACCIÓN NEGATIVA: sí no hay Ac, no se formaran los IC y en consecuencia los Ag

particulados sedimentan formándose un anillo o botón bien definido en el fondo del tubo o
pocillo de reacción.

*Antisuero: Conjunto de anticuerpos presentes en el suero de un animal que ha sido inmunizado

con un antígeno.
Resultado de la prueba de aglutinación: suero
de una perra infectada con Brucella canis
https://www.youtube.com/watch?v=LYLqC5bevIk
 PRUEBAS DE PRECIPITACIÓN

Interacción de antígenos solubles y

anticuerpos específicos que llevan
a la formación de complejos (Ag-
Ac) que frecuentemente llegan a
ser insolubles y precipitan en
solución.
 TECNICA DE INMUNODIFUSIÓN

Basada en la reacción de
precipitación
En una capa de agar se perforan
pocillos redondos.
Un pocillo se llena con un antígeno
soluble y el otro con un antisuero.
Ambos antígeno y antisuero difunden
en forma radial, de manera que donde
los reactivos se encuentran, aparece
una línea blanca opaca de precipitado
Ejemplo de Inmunodifusión en gel de agar (IDGA) en detección de
Brucelosis canina.
INMUNODIFUSIÓN RADIAL

En una matriz semisólida de

agar se encuentra disuelto el
Ac específico. La muestra
(antígeno) se introduce en los
orificios cilíndricos excavados en
el agar y a medida que el
antígeno difunde en forma radial,
se alcanza la relación Ag-Ac que
permite la formación
precipitados visibles. Una vez
finalizada la difusión se mide el
radio de los precipitados que es
proporcional a la concentración
de antígeno.
EL área de precipitación es proporcional a la concentración de antígeno
https://www.youtube.com/watch?v=ko3cCY2EHHg
 INMUNOELECTROFORESIS
(IEF)

Es una técnica cualitativa que permite la identificación de diferentes componentes proteicos

(antígenos) presentes en distintas muestras biológicas (suero, orina, etc) a través de arcos
de precipitación.
La técnica se realiza preferentemente en geles de agarosa y se distinguen dos etapas:
• 1) La muestras se someten a una separación electroforética.
• 2) Terminada la electroforesis, las proteínas interaccionan con los Acs específicos
aplicados en el agar en un canal paralelo al eje de migración. Luego de un período de
difusión de los Acs, se observan arcos de precipitación cuya forma y posición dependen
de las características inmunoquímicas y de la concentración de cada proteína.
https://www.youtube.com/watch?v=w3NtwXOa2Ow
 PRUEBAS DE UNIÓN PRIMARIA

En este tipo de prueba la interacción Ag-Ac no es visible.

La estrategia consiste en "marcar" al Ac o al Ag mediante la unión

covalente (conjugación) de determinadas moléculas, tales como
FLUOROCROMOS, ISOTOPOS RADIOACTIVOS o ENZIMAS.

Estas técnicas no son tan sencillas y económicas como las que vimos
anteriormente, sin embargo, son mucho más sensibles, es decir, son
capaces de detectar menores concentraciones de Ag o Ac.
 INMUNOFLUORESCENCIA

Un fluorocromo (como la rodamina o la fluoresceína) se une en forma

covalente (conjugada) con un anticuerpo para producir un anticuerpo
fluorescente que puede emplearse a fin de establecer la localización de una
proteína específica dentro de la célula.
Inmunofluorescencia Directa en detección de la rabia.

El anticuerpo marcado se incuba con el tejido sospechoso de infección con

el virus de la rabia y si es positivo se une a los antígenos que están presentes,
si es negativo no habrá fluorescencia.
INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA

Un corte de un tejido o un frotis que

contenga el microorganismo se fija en
un portaobjetos de vidrio.
Se incuba con el antisuero marcado.
Se examina con iluminación de campo
oscuro en un microscopio con una
luz ultravioleta, el microorganismo
al que se une el anticuerpo
marcado presentará un brillo
fluorescente.

Esta prueba puede identificar:

Por ejemplo, Mycobacteriu avium paratuberculosis en heces, o para detectar bacterias como
Dichelobacter nodosus, Listeria monocytogenes, o clostridios en tejidos con lesiones .
También se puede emplear para detectar virus en un cultivo celular o en los tejidos tomados de
animales enfermos (ejemplo virus de la rabia en los encéfalos de animales infectados o del virus de
la leucemia felina en los leucocitos infectados.
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

Estas pruebas pueden utilizarse para detectar anticuerpos en el suero o para identificar
antígenos específicos en los tejidos o en los cultivos tisulares.
El antígeno presente en un corte de un tejido, o de un cultivo celular, se coloca sobre un
portaobjetos.
Este se incuba con el suero sospechoso de contener anticuerpos frente a ese antígeno.
Después se lava el suero, quedando solo los anticuerpos específicos unidos al antígeno.
Estos anticuerpos unidos se observan incubando el frotis con antiglobulina marcada con
FITC.
Se retira la antiglobulina marcada sin unir mediante lavado y se examina el portaobjetos.
La presencia de fluorescencia indica que hay anticuerpos en el suero analizado.

La prueba de
inmunofluorescencia indirecta
tiene dos ventajas sobre la técnica
directa. La fluorescencia será
considerablemente más brillante
que en la prueba directa, ya que
varias moléculas de antiglobulinas
marcadas pueden unirse a cada
molécula de anticuerpo.
Asimismo, también se puede
determinar la clase del anticuerpo
específico si se usan antiglobulinas
específicas para cada clase de
inmunoglobulinas.
 CITOMETRÍA DE FLUJO

Permite medir la
cantidad de anticuerpo
fluorescente unido a
cada célula en forma
individual, facilitando la
identificación y tipificación
de diferentes subgrupos de
poblaciones celulares con
una extraordinaria
sensibilidad, eficiencia y
rapidez.

En el citómetro de flujo las células atraviesan un rayo láser.

Las células dispersan la luz de un láser de acuerdo a sus características.
La molécula de fluorocromo unida al anticuerpo absorbe luz del rayo láser y emite
luz en otra longitud de onda, la que es captada por otro detector que está en ángulo
recto al rayo.
Ambos sucesos facilitan la correcta identificación de las poblaciones celulares.
Esquema de como una Inmunoglobulina marcada con fluorocromo se
puede utilizar para identificar marcadores de superficie celular

Poblaciones Linfocitarias y sus marcadores de superficie

https://www.youtube.com/watch?v=gEdZvuDrWo4
 INMUNOCROMATOGRAFÍA DE
FLUJO LATERAL

Es una de las técnicas de inmunodiagnóstico más

modernas cuyas principales ventajas son la simplicidad y
rapidez de la prueba.

La inmunocromatografía se basa en la migración de una

muestra a través de una membrana de nitrocelulosa.
La zona de captura está formada
por un segundo anticuerpo
específico contra otro
epítopo del antígeno. .El
antígeno y conjugado
quedarán retenidos y la línea
se coloreará en este caso
(muestras positivas). En el caso
contrario las muestras
son negativas.

La zona control está formada

por un tercer anticuerpo que
reconoce al reactivo de
detección. Esta línea es un
control de que el ensayo ha
funcionado bien, porque se
colorea siempre, con muestras
positivas y negativas.

La muestra es añadida en la zona del conjugado, el cual está formado por un anticuerpo específico contra uno
de los epítopos del antígeno a detectar y un reactivo de detección.
Se usan kit de diagnóstico analítico
rápido, por ejemplo, para el virus de
FeLV (leucemia felina) y para el virus de
FIV (inmuno deficiencia felina).
 ELISA

Entre las pruebas más

importantes de
inmunoanálisis empleadas
en medicina veterinaria
está el análisis de
inmunoadsorción
ligada a enzimas
(ELISA).
La técnica de ELISA utiliza
Acs marcados con una
enzima (generalmente la
peroxidasa) para poder
visualizar la reacción Ag-
Ac.
La técnica se utiliza tanto
para la determinación de
Ags como de Acs.
Determinación de Ag por ELISA

La modalidad más frecuente del método

ELISA para la determinación de Ags es el (muestra)

modelo ELISA "Sandwich" directo.

En este modelo, el Ac específico para el Ag

de interés, se encuentra adsorbido en un
soporte sólido (placa de petri), sobre el
que se añadirá la muestra biológica.

El producto coloreado que producirá un

color observable a simple vista, es
cuantificable mediante un
espectrofotómetro.
Determinación de Acs por ELISA

Para la determinación de Acs

específicos para un determinado Ag
se utiliza normalmente la modalidad
de ELISA indirecto en donde el Ag
de interés se encuentra adsorbido
en la placa de ELISA.

Se pueden utilizar como antígenos,

proteínas virales o bacterianas e
incluso virus completos.

Esta es una de las técnicas de

elección para buscar Acs contra
proteínas del virus HIV en sueros de
pacientes.
 WESTERN BLOT

También conocida como "Immunoblotting"

Es una técnica muy sensible que permite estudiar cualitativa y

cuantitativamente las reacciones antígeno- anticuerpo.
Se basa en la separación
electroforética de proteínas en geles
de poliacrilamida.

Posteriormente se transfiere
(blotting) las proteínas a un soporte
sólido (membrana de nitrocelulosa o
nylon) y la posterior detección de
una o más bandas identificadas por
Acs específicos.

Es la prueba confirmatoria de
elección para los casos en que los
sueros de los pacientes dieron un
ELISA positivo para VIH.
Es utilizado para enfermedades
de autoinmune e infecciones
(Brucella Canis)
A: cis'cercosis, B: hida'dosis y C: fascioliasis.
https://www.youtube.com/watch?v=HocmMZUieFg