Inmunofluorescencia

JULIETA GUTIERREZ SALOMON

Inmunofluorescencia
 La fluorescencia es una propiedad de ciertas
moléculas que, al ser irradiadas con energía
electromagnética de longitud de onda
adecuada, emiten radiación de longitud de
onda característica permitiendo su
cuantificación
Inmunofluorescencia
 Las moléculas de un colorante fluorescente
absorben luz en una longitud de onda y convierten
la luz absorbida de alta energía (longitud de onda
más corta) en luz de menor energía (longitud de
onda más larga).
 Cada fluorocromo tiene un espectro de emisión y
excitación característicos; si se utilizan dos con el
mismo espectro de excitación pero distinto espectro
de emisión, se pueden medir dos características al
mismo tiempo (fluorescencia de dos colores).
Inmunofluorescencia

Los fluorocromos reciben luz a una determinada longitud de

onda, y emiten a otra longitud de onda que podrá ser detectado
dentro de un espectro y otra en el rango de un color.
 La inmunofluorescencia se utiliza
esencialmente en la detección de
autoanticuerpos y anticuerpos contra
antígenos de superficie de células y tejidos.

 Para ello se emplean anticuerpos preparados

frente a la proteína que se desea detectar
marcados con moléculas fluorescentes
 Técnica de Inmunofluorescencia

 Utiliza Ac marcados (“Conjugados”) con

colorantes fluorescentes o fluorocromos
(fluoresceína [FITC] o rodamina) como
sistema indicador.
 Cuando se aplica luz ultravioleta en el
microscopio de fluorescencia, el fluorocromo
emite luz visible verde o naranja.
Inmunofluorescencia Directa:

 Se detecta antígenos en células, tejidos o cultivos

celulares. También se emplea para identificar bacterias.
 En esta técnica el anticuerpo está marcado directamente
con el fluorocromo.
 Sobre un portaobjetos depositamos una muestra en la que
buscamos la presencia de un determinado antígeno.
Añadimos un suero específico del antígeno problema
marcado con isotiocinato de fluoresceína (conjugado). Si
el antígeno problema se encuentra presente en la muestra,
se une el conjugado. En caso contrario el conjugado se
elimina con un lavado del porta.
Inmunofluorescencia Indirecta (IFI):

 Se utiliza un conjugado anti-inmunoglobulina

marcado con fluorocromo para detectar los Ac
específicos unidos al Ag. Es más sensible que la
técnica directa. Se utiliza en diagnóstico de muchas
enfermedades infecciosas y parasitarias

 Si pensamos que el enfermo detecta partes propias

(Enfermedades antiinmunes), ponemos tejidos
humanos y añadimos suero del enfermo. El
anticuerpo primario será el del suero, y el
secundario será frente a inmunoglobulinas humanas.
Inmunofluorescencia Indirecta (IFI):

 Sobre un portaobjetos que lleva pegado un antígeno

conocido, añadimos el suero problema. Si éste contiene
anticuerpos específicos, se unen al antígeno.
 Los anticuerpos del suero no específicos del antígeno del
porta se eliminan mediante un lavado.
 Posteriormente se añade un suero anti-inmunoglobulina
humana marcada con isotiocianato de fluoresceína
(conjugado).
 El conjugado se une a los anticuerpos específicos o se
elimina mediante lavado había anticuerpos específicos en el
suero.
Inmunofluorescencia Indirecta (IFI):
Citómetro de flujo.

 La técnica de inmunofluorescencia se suele

utilizar en el estudio de poblaciones de
células de sangre periférica.
 Utiliza Ac monoclonales fluorescentes para
la detección de Ag de superficie celular
mediante un láser de luz que separa
específicamente las células marcadas
Citrometro de flujo
 Este aparato pretende analizar una a una todas las
células que pasan por una capilar muy fino donde
incide in rayo láser, y donde habrá filtros y espejos
que nos dirán el tamaño que tiene esa célula, su
complejidad y si va rodeada con fluorocromos de un
color, otro o ambos.
 Los resultados salen en una gráfica tal y como
nosotros le indiquemos. Por ejemplo, en una gráfica
de tamaño frente a complejidad obtendríamos esta
gráfica en una persona sana.
Citómetro de flujo.
Enfermedad de Lyme
Aspergilosis pulmonar
Citomegalovirus
Leishmania donovani
Plasmodium falciparum