Técnicas de detección de anticuerpos

1.1 INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

Es una técnica en la que los anticuerpos tienen la capacidad
de unirse a ciertos colorantes fluorescentes sin alterar sus
propiedades inmunológicas.
Primero se hace la incubación del suero del paciente sobre
un sustrato antigénico constituido por finas secciones de
tejido. También, se puede usar como sustrato antigénico
monocapa de células cultivadas o parásitos. Las monocapa
son preparadas mediante el cultivo de células en un
portaobjetos. La línea celular más empleada es el
carcinoma humano laríngeo (HEp-2). Después de la
incubación del suero problema con el sustrato antigénico,
los componentes del suero que no se han unido al sustrato
son eliminados mediante un lavado.
A continuación, se añade sobre el sustrato antigénico un
reactivo constituido por anticuerpos anti-inmunoglobulina
humana conjugados a un fluorocromo, que suele ser el
isotiocianato de fluoresceína (FITF). Estos anticuerpos se
unen a cualquiera de los autoanticuerpos que puedan
haber sido capturados por el antígeno del sustrato.
Los anticuerpos anti-inmunoglobulina humana, unidos a
través de los autoanticuerpos al sustrato antigénico, se
visualizan con un microscopio de fluorescencia. La
fluorescencia (verde amarillento, si se utiliza FITC)
observada en el sustrato antigénico indica la presencia de
autoanticuerpos.
PATRONES DE FLUORESCENCIA:
Con esta técnica se forman una serie de imágenes
fluorescentes características, que son patrones de
fluorescencia. Estos se producen por la unión de los
autoanticuerpos a estructuras intracelulares y predicen el
tipo de partícula a la cual se fijan (de una forma
imperfecta). El interés de estos patrones radica en su
correspondencia con determinados anticuerpos y
enfermedades autoinmunes. Asociaciones más
importantes:
•PATRON DE NUCLEOPLASMA HOMOGÉNEO: se ve
como una fluorescencia homogénea de todo el núcleo
de la célula. Los autoanticuerpos que producen un
patrón homogéneo son los anti-DNA y los
antishistonas.
•PATRON DE NUCLEOPLASMA MOTEADO: Se ve en
forma de numerosos puntos uniformes de
fluorescencia de diferentes tamaños esparcidos por
todo el núcleo y con márgenes nucleares bien
definidos. Los autoanticuerpos que producen un
patrón moteado son los anti- Sm, los SS- A y los SS-B.
•PATRON NUCLEOLAR: Se ve como una fluorescencia
homogénea intensa de los nucléolos, frecuentemente
asociada a fluorescencia homogénea pálida del resto
del núcleo. Los autoanticuerpos que producen un
patrón nuclear son la anti- fibrilina y los anti- RNA
polimerasa.
 •PATRÓN CITOPLASMÁTICO: Se producen en
numerosas enfermedades autoinmunes
multisistémicas.
La IFI tiene una elevada sensibilidad y es la prueba de
laboratorio más fiable para descartar enfermedades
autoinmunes. La interpretación de los resultados es
subjetiva por lo que sí es positiva habría que hacer otras
pruebas como ELISA o el inmunoblot.

1.2 AGLUTINACIÓN
Es la agregación de partículas mediante la reacción Ag-Ac
para formar una masa visible. Estas partículas pueden ser
vitales (bacterias, eritrocitos, etc) o inertes (esferas de
látex, partículas de carbón, etc)
*Aglutinación DIRECTA (reacciona Ag-Ac
directamente)
*Aglutinación INDIRECTA: Ag + suero anticuerpos (en
él hay partículas vitales e inertes)
*Detección de autoanticuerpo: FACTOR REUMATOIDE
en artritis reumatoide
-Es una prueba fácil, rápida y de alta sensibilidad analítica
-Permite detectar ENORME VARIEDAD DE Ac
-Es semicuantitativa: puede haber Falsos Negativos (FN)
por PROZONA, que es un exceso de Ac que da lugar a una
malla aglutinante deficiente, ya que se saturan los
anticuerpos y no se pueden unir más Ag
EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
Antes de realizar la técnica IFI, la muestra de suero se
diluye con una dilución isotónica de pH neutro. A
continuación, pueden efectuarse diluciones dobles
seriadas a partir de la dilución inicial del suero del paciente.
Después del análisis de las diluciones de la muestra, los
resultados se expresan en forma de título, siendo este la
mayor de las diluciones efectuadas a la muestra que
proporciona fluorescencia específica apreciable.
En la detección de los ANA se consideran títulos negativos
a los inferiores a 1/40, títulos de baja positividad a los
superiores a 1/40 e inferiores a 1/160, y títulos de alta
positividad a aquellos que son superiores a 1/60.
Tanto el título como el patrón de IFI de los ANA sobre
células HEp-2 son parámetros útiles para discriminar entre
individuos sanos con ANA y pacientes con enfermedades
autoinmunes sistémicas.
ENFERMEDADES RELACIONADAS CON LOS
AUTOANTICUERPOS
• (ANCA) Anticuerpos anticitoplasma del neutrófilo –
Vasculitis sistémica necrosante
• (AMA) Anticuerpos contra organelas citoplasmáticas –
Cirrosis biliar primaria
• (ANA) Anticuerpos antinucleares – Artritis reumatoide
• (AACE) Anticuerpos anticélula endotelial – Vasculitis
sistémica primaria
1.3 INMUNOBLOT
Pasos para la técnica.
La muestra se somete a detergentes y métodos
disgregantes, pero con inhibidores de las proteasas.
Electroforesis en PAGE.
Transferencia de la electroforesis a una lámina de
nitrocelulosa.
Esta lámina se recorta en tiras. Cada tira contiene toda la
serie de bandas separas.
Incubación de las tiras, controles positivos y negativos con
el suero del paciente. Si cuando se está centrifugando el
suero del paciente tiene autoanticuerpos se unirá a la tira.
Se lava, y se introduce un suero compuesto por
anticuerpos anti-inmunoglobulina humana conjugados a
una enzima. Esta enzima al unirse a un sustrato emite color.
TECNICA INMINOBOT PERFECIONAMIENTO
Los antígenos utilizados son obtenidos mediante
recombinación genética. Es una técnica más específica y
sensible que la anterior y se usa poco por su elevado coste.
AUTOANTICUERPOS
Detección de FR para la Artritis reumatoide
Detección de autoanticuerpos ANA para la enfermedad LES
1.4 ELISA
Se utilizan mezclas de antígenos purificados, no purificados
e incluso recombinante.
El antígeno es adsorbido por un soporte solido inerte, la
unión de ambos de conocer como inmunoabsorbente.
Cuando se pone en contacto el inmuabsorbente con la
muestra, si esta contiene autoinmunes anticuerpos
específicos para los antígenos, se fijan a ellos. El resto de
los anticuerpos que no se unen son eliminados mediante
lavados.
Los complejos (Ag-Ac) son detectados mediante un
segundo anticuerpo que reconoce los anticuerpos unidos y
produce una reacción detectable (cambio de color) que es
medida mediante espectrofotometría.
La absorbancia es directamente proporcional a la cantidad
de autoanticuerpos.
● Se considera positivo, si sobrepasa como mínimo, el
doble de absorbancia del control negativo.
● Se considera positivo si la absorbancia es igual o
superior al valor de corte.
Es una técnica más sensible que las de aglutinación.
ENFERMEDADES:
• Anticuerpos anticardiolipina (AAC)
o SINDROME ANTIFOSFOLIPIDICO
o LUPUS ERITROMATOSO SISTEMATICO
• Anticuerpos anticélula endotelial (AACE)
 o LUPUS ERITROMATOSO SISTEMATICO
o SÍNDROME DE SJÖGREN
1.5 INMUNOPEROXIDASA INDIRECTA
PROCESO
1. Se incuba el suero (muestra) sobre un sustrato
antigénico. El sustrato antigénico suele ser una
monocapa de células porque contiene un número
mayor de antígenos. Tras la incubación del suero los
componentes del suero no Unidos al mismo son
eliminados con un lavado.
2. Se añaden anticuerpos antiinmunoglobulina humana
conjugados con la enzima peroxidasa, que son
capaces de unirse al complejo Ac-Ag que se ha
formado previamente.
3. Se añade un reactivo (sustrato cromogénico) actúa
con la peroxidasa dando un precipitado rojizo que se
ve al microscopio óptico.
ANTICUERPOS IMPLICADOS
ANA (anticuerpos antinucleares)
Los autoanticuerpos ANA están dirigidos contra
autoantígenos del núcleo de la enfermedad de Graves,
Artritis Reumatoide y Tiroiditis de Hashimoto