Trabajo Práctico

Nº 5
IFI
INMUNOLOGIA CLINICA 2019

Bioq. Escobar, Héctor

Objetivos
 Definir
los conceptos básicos de
INMUNOFLUORESCENCIA.

 Conocer los distintos tipos de sustratos

antigénicos utilizados en el laboratorio para
el diagnostico de distintas enfermedades
infecciosas y de tipo autoinmunes (AI).
Un poco de historia…
 En la década de 1940 se implementa
 La inmunofluorescencia directa: La globulina utilizada se
combina con el fluorocromo y el conjugado se aplica
directamente al tejido. Este método fue perdiendo importancia
porque es el menos seguro, el menos sensible y es necesario
realizar la conjugación de los sueros específicos en forma
individual, lo que lo hace demasiado tedioso.

 La inmunofluorescencia indirecta: Es la que más se utiliza

y fue implementada en 1954. El tejido que se va a utilizar es
tratado con el suero del paciente al que se le une un suero con
una anti-inmunoglobulina humana marcada con fluoresceína.
Este método es más seguro, más versátil, mas fácil de
controlar y el conjugado que se utiliza es una globulina
antihumana que se puede utilizar con el suero de muchos
pacientes.
 ¿Qué es la Fluorescencia?
 La fluorescencia es una propiedad de ciertas moléculas que,
al ser irradiadas con energía electromagnética de longitud
de onda adecuada, emiten radiación de longitud de onda
característica permitiendo su cuantificación.
 Las moléculas de un colorante fluorescente absorben luz en
una longitud de onda y convierten la luz absorbida de alta
energía (longitud de onda más corta) en luz de menor
energía (longitud de onda más larga).
 En si.. Es la CAPACIDAD QUE TIENEN ALGUNAS
MOLECULAS DE EMITIR LUZ MIENTRAS ESTAN
SIENDO ESTIMULADAS DE MODO ADECUADO.
 No Confundir como FOSFORESCENCIA ...
Fluorescencia
Es el resultado de un proceso que ocurre en tres etapas en
algunas moléculas (fluoróforos).

1°: Excitación: se entrega un fotón de energía

por una fuente externa a un fluoróforo que
absorbe, pasando a un estado electrónico
excitado S1’
2°: Duración del estado excitado: existe por
un período de tiempo de 1-10 x 10-9
segundos, donde sufre cambios
conformacionales. La energía de S1’ es
parcialmente disipada produciendo un
estado excitado relajado desde el que se
emite la fluorescencia.
3°: Emisión de fluorescencia: un fotón se emite, lo que permite el
retorno al fluoróforo al nivel S0.
Fluoróforos
Generalmente son compuestos heterocíclicos o hidrocarbonos poliarómaticos:
moléculas rígidas con varios niveles de energía a los cuales pueden ser
excitados y en el retorno, al no rotar no emite calor y sí luz.

Rodamina 6G Fluoresceína Rodamina B

Cada fluorocromo tiene un espectro de
emisión y excitación característicos; si se
utilizan dos con el mismo espectro de
excitación pero distinto espectro de
emisión, se pueden medir dos Isotiocianato
características al mismo tiempo. fluoresceína
 Forman uniones con las proteínas
pero sin afectar los grupos de
combinación específica del
anticuerpo.

 La reacción de unión ocurre entre los

grupos amino y carboxilo de la
proteína y los grupos tiocianato o
cloruro de sulfonilo de los colorantes

 Cuando el lapso de tiempo entre la

absorción de la luz activamente y la  El pH afecta la fluorescencia
emisión de la nueva luz es mayor de 10-5 y por esta razón se debe
segundos el fenómeno se define como trabajar a pH estable y
fosforescencia, pero cuando el adecuado dependiendo del
fenómeno es menor de 1x10-5 segundos colorante : fluoresceína (pH 8),
se define como fluorescencia. rodamina (pH 7)
Fluoróforos y sus espectros de absorción y
emisión
En la selección de
los fluorocromos,
uno está limitado
por la
disponibilidad del
juego de filtros del
microscopio a
utilizar. Muchos
juegos de filtros
son más
compatibles
con rodamina o
fluoresceína.
Microscopía

De
Fluorescencia
Tipos de Filtros
Tipos de Reacciones

Directa: Utiliza un Ac marcado

dirigido hacia el Ag de interés.

Indirecta: Utilizan un Ac
primario sin marcación
seguido por un Ac
secundario o terciario
marcado.
El procedimiento se realiza en un solo paso básico de reacción.
La muestra clínica que presuntamente contiene los antígenos en estudio
se incuba con un anticuerpo específico monoclonal dirigido contra el
mismo, conjugado con fluoresceína.
Si el antígeno esperado está presente se formará un complejo antígeno-
anticuerpo.
La reacción positiva puede verse con la ayuda de un microscopio de
fluorescencia.
Se puede detectar la presencia de antígenos microbianos en muestras
biológicas, así como de inmunocomplejos fijados a tejidos (biopsia de piel,
riñón).
 Tipos

Depósito lineal en un paciente

con Lupus eritematoso crónico.

Inmunofluorescencia directa
para T. pallidum en una
muestra de chancro genital.
Es una técnica de dos etapas
donde se aplica el anticuerpo
sin marcar directamente
sobre el sustrato antigénico y
se visualiza por tratamiento
con un suero anti-
inmunoglobulina conjugado
con fluorocromo:
ANCA c ANCA p

Crithidia
Luciliae
En las Enfermedades Infecciosas…

IFI de
Trypanosoma
cruzi,agente
etiológico de la
Enfermedad de
Chagas-Mazza.

IFI donde se
observa el
toxoplasma gondii, IFI donde se
agente etiológico de observa la
la espiroqueta del
Toxoplasmosis. Treponema
pallidum,
agente etiológico de
la
Sífilis.
En las Enfermedades
Autoinmunes…
DETECCION DE ANTICUERPOS
ANTINUCLEOCITOPLASMATICOS,
utilizando distintos sustratos:

1. Improntas combinadas

2. Línea celular Hep-2

3. Crithidia luciliae.
 Estos anticuerpos se detectan por
inmunofluorescencia sobre sustrato celulares

HOY se emplea la línea celular Hep-2

obtenida a partir de cultivo de células de
epitelioma de laringe.

Hep-2
La preparación Hep-2 debe incluir células en
todas las fases mitóticas, para diferenciar
autoanticuerpos reactivos a proteínas asociadas a
la cromatina.

Anafase

Metafase
Descripción:

Estas imágenes se proporcionan como ejemplos de lo que se considera ANA negativo.

Dado que un ANA negativo puede representarse mediante una serie de imágenes diferentes, debe quedar claro
que AC-0 no debe considerarse como un ejemplo definitivo, sino que debe utilizarse solo con fines de
comparación.
La característica de guía que vincula estas posibilidades variables es la ausencia de una tinción clara en
cualquier estructura subcelular dada. Esta definición es tanto subjetiva como semi-cuantitativa en el mejor
de los casos.
Debe haber una discusión sobre cómo se determina el corte ANA-positivo vs ANA-negativo.
Existe un consenso general de que dichos límites deben determinarse experimental y localmente con
controles de población normal. El corte depende en gran medida de los sustratos de HEp-2 utilizados por los
laboratorios individuales, incluidos los factores específicos de los fabricantes de portaobjetos de HEp-2 y las
variaciones de lote a lote, reactivos de anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromo, ajustes de
cámara y microscopio, diluciones de suero y otras variables. Al ver estas imágenes de AC-0 en línea utilizando
una pantalla de computadora, tenga en cuenta que la configuración de brillo predeterminada de la pantalla
puede variar de una computadora.
 Las células Hep-2 pueden usarse para detectar
Ac anti-dsDNA pero los patrones raramente son
específicos por la superposición de Ac anti-
ssDNA y otros antígenos.
 Lo más usado es la IFI- sobre el protozoo
monoflagelado Crithidia luciliae.
 Contiene una mitocondria gigante (el
kinetoplasto) que contiene dsDNA y nada de
ssDNA, histonas y otros autoantígenos comunes.

Crithidia
luciliae
 Lectura positiva:

 Fluorescencia del kinetoplasto sólo o el

kinetoplasto y el núcleo.

 Si el suero es positivo se hacen diluciones para

encontrar el título.
FUTURE TECHNOLOGY
 ¿ Qué
haremos
en el
laboratorio?
Procedimiento de tinción

Diluir el suero problema y los controles.

Alicuotar 20 µl de cada suero sobre la
preparación correspondiente.
Incubar unos 30 minutos en cámara
húmeda.
Lavar los portaobjetos con solución PBS
3 veces.
 Añadir 20 µl del anticuerpo conjugado
con FITC e incubar en cámara húmeda
y oscura durante 30 – 45 minutos.
Lavar los portaobjetos con solución PBS
3 veces.
Secar y montar la preparación con
solución de glicerina-fosfato.
Examinar con un microscopio de
fluorescencia en busca de la
fluorescencia verde manzana del
FICT.
•Gamarra AI & cols. Revista Colombiana de Reumatología 2002; 9
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