“TÉCNICAS

INMUNOLOGICAS”
M.C. MURILLO JAIME ANTONY
JIMY
MÉDICO RESIDENTE DE PRIMER AÑO DE
M. DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS Y
TROPICALES
 GENERALIDADES
• La exquisita especificidad de los anticuerpos por antígenos
particulares .
• convierte a los anticuerpos en reactivos muy valiosos para detectar,
purificar y cuantificar antígenos.
• Como pueden producirse anticuerpos contra casi cualquier tipo de
macromolécula y sustancias químicas pequeñas, pueden utilizarse
técnicas basadas en anticuerpos para estudiar casi cualquier tipo de
molécula en solución o celular.

UPTODATE.Una visión general del sistema inmune adap Autor:Richard B Johnston, Jr, MD
Editor de la sección:Jordan S Orange, MD, PhDEditor Adjunto:Anna M Feldweg, MD
• Existen diversos métodos basados en procedimientos distintos para
visualizar la unión Ag-Ac . Así tenemos:

TÉCNICAS DE la reacción Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el

AGLUTINACIÓN. aglutinado celular o bacteriano formado.

Para la realización de estas técnicas el anticuerpo se marca con

TÉCNICAS DE FLUORESCENCIA
un fluorocromo detectándose la formación del complejo Ag-Ac
Y CITOMETRÍA DE FLUJO.
por la fluorescencia emitida.

TÉCNICAS DE . En estas técnicas al anticuerpo se une un isótopo radiactivo

RADIOINMUNOENSAYO. siendo posible la cuantificación del complejo Ag-Ac a través de la
radiactividad emitida

CROMATOGRAFÍA DE La especificidad de la unión Ag-Ac puede utilizarse para

AFINIDAD. obtener Acs y Ags puros.

INMUNOPRECIPITACIÓN E Permite detectar la presencia y cantidad de antígenos y

INMUNOBLOTTING. anticuerpos específicos
 1. DE
TÉCNICA Técnicas de aglutinación
AGLUTINACIONES

Cuando el antígenos se encuentra unido o

formando parte de células, bacterias o partículas,
la reacción Ag-Ac se puede detectar y cuantificar
por el aglutinado celular o bacteriano formado.

Cellular and Molecular Immunology. Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman, Shiv Pillai, MBBS, 2012 Elsevier España,
S.L. Travessera de Gràcia, 17-21 – 08021 Barcelona, España.
 AGLUTINACION
AGLUTINACIONES

Son útiles para la detección de antígenos y anticuerpos.

Existen varios tipos de aglutinación en donde se destacan:

AGLUTINACION CUALITATIVA -: Consiste en mezclar Ag y Ac y observar la

aglutinación. Ej. Prueba de aglutinación rápida para la brucelosis, test de
determinación de grupos sanguíneos, test de Coombs para la anemia
hemolítica autoinmune, etc.
AGLUTINACION CUATITATIVA

Para la “titulación” de un suero: se diluye el suero y se enfrenta a una cantidad

fija de Ag .

la máxima dilución del suero en el que

TITULO
la aglutinación es positiva.

Elexceso de Ac no se forma la red que

EFECTO permite la aglutinación. Puede también
PROZONA deberse a la presencia de Ac “no
aglutinantes”.
• AGLUTINACION PASIVA: los anticuerpos se dirigen contra
moléculas que se han adherido intencionalmente a una partícula
que actúa como medio de soporte pasivo (látex). Una variante es
la aglutinación pasiva reversa, en donde lo que se detecta es el
antígeno y las partículas están recubiertas por el anticuerpo.
 CITOMETRIA
CITOMETRIA DE FLUJO DE FLUJO
• Es una técnica de análisis celular que implica medir las características de
dispersión de luz y fluorescencia que poseen las células conforme se las
hace pasar a través de un rayo de luz. Para su análisis por citometría de
flujo, las células deben encontrarse individualmente en suspensión en un
fluido.

• INFORMACION OBTENIDA POR CITOMETRIA DE FLUJO

•Básicamente podemos obtener los siguientes datos:
•- Tamaño y numero de la célula
•- Complejidad de la membrana celular

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• Detectar la fluorescencia emitida por las células sueltas en suspensión
y así determinar el numero de ellas.

la suspensión se da con sondas que llevan marcadores fluorescentes

Lo más habitual es que estas sondas sean anticuerpos específicos frente a una molécula
de la superficie celular y estén marcados con fluorocromos.
 2SISTEMA
DE FLUJO: El
paso 1 población de células
individualiza marcadas con anticuerpos
do de cada florescentes
célula

3. Laser:focalización
hidrodinamica

4.Sistema óptico :se ilumina

las partículas de la muestra se
obtiene las señales de luz
Son captadas por los
fotomultiplicadores

5.Sistema eléctrico:
Se convierte las señales
de luz en electrónicas.

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S.L. Travessera de Gràcia, 17-21 – 08021 Barcelona, España.
 INMUNOFLUORESCENCIA
INMUNOFLUORECENCIA
Es una técnica utilizada para visualizar la distribución de una proteína o antígeno específico en células o
secciones de tejidos utilizando la especificidad de los anticuerpos por su antígeno para dirigir marcadores
fluorescentes a las biomoléculas dianas de forma específica.

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA:
El marcaje directo en el que el anticuerpo primario está marcado con marcador fluorescente.

INMUNOFLUORESCENTE INDIRECTA:
El marcaje indirecto en el que un anticuerpo secundario marcado con un fluorcromo se
utiliza para reconocer un anticuerpo primario.

NOTA: Las muestras marcadas inmunofluorescencia se examinan bajo un microscopio de fluorescencia o

un microscopio confocal.
CUANTIFICACIÓN DEL ANTÍGENO POR INMUNOANÁLISIS

• Todos los métodos

inmunoquímicos modernos
de cuantificación se basan
en disponer de un antígeno
o anticuerpo puro cuya
cantidad pueda medirse
mediante una molécula
indicadora (o marca).
CUANTIFICACIÓN DEL ANTÍGENO POR INMUNOANÁLISIS

Cuando se marca el antígeno o el anticuerpo con un

radioisótopo, puede cuantificarse con instrumentos
llama radioinmunoanálisis (RIA).
que detecten fenómenos de desintegración
radioactiva

Cuando el antígeno o el anticuerpo se unen de forma

enzimoinmunoensayo de adsorción
covalente a una enzima, pueden cuantificarse
(ELISA).
determinando con un espectrofotómetro la intensidad
con que la enzima convierte un sustrato transparente en
un producto coloreado;
RADIOINMUNOENSAYO
•El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA
del inglés Radioimmunoassay) es un
método radioinmunométrico que se basa
en la formación específica de los complejos
Antígeno- Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le
dota de una gran especificidad unido a la
sensibilidad de los métodos radiológicos.
La técnica ha sido prácticamente
reemplazada por el método ELISA el cual
mide la unión Ag-Ac mediante
colorimetrías en lugar de radiometrías

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enzimoinmunoensayo de adsorción
PRUEBA(ELISA).
ELISA
Es una técnica de inmunoensayo en la cual
un antígeno inmovilizado se detecta
mediante un anticuerpo enlazado a un
enzima capaz de generar un producto
detectable como cambio de color o algún
otro tipo.
La interacción antígeno- anticuerpo en el
laboratorio puede ser utilizada para
determinar si un paciente tiene una
infección o una enfermedad autoinmune.
 enzimoinmunoensayo de adsorción 1ro se sensibiliza la
(ELISA). placa :se vierte
anticuerpos

Se lava para la
eliminación de
antígenos no unidos

Se agrega un
conjugado(anticuerpo unido a
una enzima)

Se retira los conjgados sin unir

mediante lavado

Cellular and Molecular Immunology. Abul K. Se valora la cantidad de

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2012 Elsevier España, S.L. Travessera de
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IDENTIFICACIÓN Y PURIFICACIÓN DE
PROTEÍNAS

• Los anticuerpos pueden utilizarse

para purificar proteínas a partir de
una solución o para identificarlas y
caracterizarlas.
• Dos de los métodos empleados a
menudo para identificar y purificar
proteínas son la inmunoprecipitación
y la cromatografía por afinidad.
INMUNOPRECIPITACIÓN

• La inmunoprecipitación es una técnica en la que se usa un anticuerpo

específico frente a un antígeno proteínico en una mezcla de proteínas
para identificar este antígeno específico

Desnaturaliza
Adiciona un cion para
anticuerpo extraer el
especifico antigeno

Los AC se unen a la Los AC se unen a la Las proteínas que

Mezcla proteínica Proteínas diana Proteínas diana no se unieron se
eliminan por
lavado
• Las proteínas pueden detectarse después de la electroforesis tiñendo
el gel de poliacrilamida con una tinción de proteínas o mediante un
análisis Western blot.
• En el caso de que las proteínas sean marcadas con la sustancia
radiactiva, las proteínas específicas inmunoprecipitadas por el
anticuerpo pueden revelarse mediante autofluorografía o
autorradiografía.
CROMATOGRAFIA POR AFINIDAD

• La especificidad de la unión Ag-Ac puede utilizarse para obtener

Acs y Ags puros.

Los anticuerpos
específicos frente
al antígeno Se pasa una mezcla el antígeno unido se libera
deseado suelen compleja de antígenos a cambiando el pH o
través de las exponiéndolo a condiciones
unirse a microesferas para salinas altas.
microesferas de permitir que el Las moléculas sin
agarosa. anticuerpo reconozca a unir se lavan .
su antígeno
WESTERN BLOTTING

• se utiliza para identificar y determinar la cantidad relativa y la masa

molecular de una proteína dentro de una mezcla de proteínas u otras
moléculas.
• esta técnica separa proteínas por electroforesis en gel de
poliacrilamida y después se transfieren electroforéticamente a un
papel de nitrocelulosa o una membrana similar, donde son
detectadas con anticuerpos que reconocen los antígenos que hay en
ellas.
1er desnaturalización
de proteínas gel de
policralidamida.(SDS)

3ro hay una transferencia

de antígenos separados a la
membrana de celulosa

Cellular and Molecular Immunology.

Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman,
Se coloca el suero del paciente sobre la Shiv Pillai, MBBS, 2012 Elsevier
membrana
España, S.L. Travessera de Gràcia, 17-
21 – 08021 Barcelona, España.
GRACIAS