PRUEBAS

INMUNODIAGNÓSTICAS

Máster. Rosita Chiriboga Ponce

Definición

Las respuestas inmunitarias

contra la mayoría de los
antígenos
inducen la producción
especifica de anticuerpos y
linfocitos T efectores.
Este reconocimiento entre el
antígeno – anticuerpo o
linfocito sienta las bases del
diagnóstico inmunológico.

Máster. Rosita Chiriboga Ponce

 El estudio de las
inmunoreacciones ( anticuerpos y
se realiza complemento) o
mediante el basadas en la
empleo de detección de y
técnicas evaluación de la de base celular
inmunológicas respuesta humoral (linfocitos T y
fagocitos).

Máster. Rosita Chiriboga Ponce

 La medición de las
interacciones Antígeno-
Se realizan en 2 vías
Anticuerpo con fines
diagnósticos.

Utilización de antígenos Utilización de anticuerpos

específicos para detectar específicos para detectar
anticuerpos. el antígeno.
(diagnóstico indirecto) (diagnóstico directo)

Máster. Rosita Chiriboga Ponce

La reacción entre el Ag y el Ac es de
naturaleza física y química.

La fuerzas que los mantienen

unidos, son de tipo no covalente.

Los enlaces no covalentes son

enlaces en los que los electrones
no se comparten por igual átomos,
originándose moléculas cargadas

Máster. Rosita Chiriboga Ponce

 Enlaces como

la exclusión la atracción
del agua electrostática,

las fuerzas de
los puentes de
Van der Waals
hidrógeno y
y

Máster. Rosita Chiriboga Ponce

Afinidad de un anticuerpo Avidez: es la fuerza y la
es la fuerza o intensidad rapidez con la que el
de la unión, entre un sitio anticuerpo multivalente
de unión del anticuerpo y se une a un antígeno
un determinante multivalente.
antigénico.

Máster. Rosita Chiriboga Ponce


Especificidad; capacidad de los
anticuerpos de distinguir y
reaccionar con una estructura
química entre muchas.
Reactividad cruzada: el
anticuerpo reacciona con otro
antígeno,
cuando este y el antígeno que
estimulo la producción del
anticuerpo especifico
comparten un epitopo idéntico
o muy similar.

Máster. Rosita Chiriboga Ponce

 PRUEBAS SEROLOGICAS

• Evalúan la respuesta inmune

humoral en líquidos orgánicos.

• Ninguna prueba serológica permite

descubrir la totalidad de los casos

• Importancia del diagnóstico poblacional en

programas de control y erradicación

Máster. Rosita Chiriboga Ponce

 CLASIFICACION DE LAS
PRUEBAS SEROLOGICAS
• Tamiz o de
• Cualitativas:
“screening”
(resultados + ó -)

• Cuantitativas: • Confirmatorias

(resultados en títulos: 1/8, • De vigilancia

1/32) epidemiológica

Máster. Rosita Chiriboga Ponce

Pruebas de Screening/ Tamiz
Alta sensibilidad: pocos o ningún falso negativo

Pruebas cualitativas

Sencillas

Prácticas: fácil realización

Económicas

Máster. Rosita Chiriboga Ponce

Pruebas confirmatorias

Más específicas

Son cuantitativas

Mayor número de casos diagnosticados

Máster. Rosita Chiriboga Ponce

Pruebas de vigilancia

Son cualitativas

Son de realización rápida

Pruebas poblacionales

Máster. Rosita Chiriboga Ponce

CATEGORÍAS DE LAS
PRUEBAS
DIAGNÓSTICAS

Máster. Rosita Chiriboga P

 Pruebas de
unión primaria Pruebas de unión
secundaria

Máster. Rosita Chiriboga P

PRUEBAS DE UNIÓN
PRIMARIA

Máster. Rosita Chiriboga P

Concepto
• Las pruebas de laboratorio que detectan la unión
directa (o interacción molecular) entre un Ag
determinado y el Ac específico para ese Ag se
conocen como pruebas de interacción primaria

Máster. Rosita Chiriboga P

Estas pruebas se Normalmente,
basan en el uno de los dos y el otro reactivo
reconocimiento componentes (Ag está "marcado"
de un Ag por o Ac) está para facilitar la
parte de los Ac, adsorbido detección del
formando (inmovilizado,
inmunocomplejos inmunocomplejo
fijado) en una fase formado
sólida

como por ejemplo un tubo de

poliestireno, una placa
multipocillos de plástico, un portaobjetos
conteniendo tejidos o células o una
membrana de
nitrocelulosa

Máster. Rosita Chiriboga P

 Utilizando
radioisótopos,

Colorantes
Inmunofluorescencia. fluorescentes o
enzimas.

Miden la cantidad de
inmunocomplejos (unión antígeno-
anticuerpo)

Radioinmunoanalisis
ELISA
(RIA)

Máster. Rosita Chiriboga P

Inmunofluorescencia

La unión Ag-Ac es revelada utilizando anticuerpos

conjugados a sustancias fluorescentes (Isotiocianato de
fluoresceina) que al ser expuestas a la luz UV emiten un
color verde.

U. Benavides - EUTM - 2007 20

Inmunofluorescencia

IFD IFI

U. Benavides - EUTM - 2007 21

Inmunofluorescencia

Negativo Positivo
U. Benavides - EUTM - 2007 22
Inmunofluorescencia
Ventajas Desventajas

Se debe utilizar

Permite identificar Ag microscopio UV.
específicos de patógenos
en tejidos, cultivos de Personal capacitado.
células y secreciones
(IFD). Infraestructura
necesaria.
Permite identificar Ac
específicos en suero (IFI). Fundamentalmente
cualitativa y
semicuantitativa

U. Benavides - EUTM - 2007 23

Inmunofluorescencia

• Inmunoanálisis de fluorescencia de particulas (cuantificación con

espectrofluorómetro).

• Inmunoanálisis de fluorescencia de polaridad (IFP)

• Citometría de flujo.

U. Benavides - EUTM - 2007 24

Inmunoenzimáticas

Revelan la unión Ag – Ac utilizando anticuerpos conjugados a

enzimas (Peroxidasa, Fosfatasa alcalina) que al agregarle su
sustrato lo degradan y provocan una reacción cromogénica.

U. Benavides - EUTM - 2007 25

Pruebas Inmunoenzimáticas

Sustrato para la enzima con

sustancia cromógena
Incubación y lavados
Antiglobulinas conjugadas a
enzimas
Incubación y lavados
Anticuerpos

Soporte sólido sobre el cuál se pega un Ag o Ac

(microplacas, tejidos, nitrocelulosa)
U. Benavides - EUTM - 2007 26
Inmunoenzimáticas

• ELISA (Ensayo Inmunoabsobente Ligado a Enzimas)

• Inmunohistoquimica (IHQ)

• Dot Blot

• Western Blot

U. Benavides - EUTM - 2007 27

ELISA

La unión Ag-Ac es revelada utilizando

antiglobulinas conjugadas a una enzima, que al
unirse a su sustrato, desencadena una reacción
cromogénica en solución.

U. Benavides - EUTM - 2007 28

 Los anticuerpos
Los anticuerpos o
conjugados suelen
antígenos marcados
ser monoclonales o ELISA
reciben el nombre de
antinmunoglobulinas
conjugado
especificas

Máster. Rosita Chiriboga P

 Se establece
añadido al ensayo a
competencia por
Se les llama concentración
los sitos de unión
sistemas limitada, y el
disponibles entre el
competitivos elemento a
reactivo conocido,
investigar.
(Ag, o Ac)

Máster. Rosita Chiriboga P

 ELISA en microplacas (Ac)

Reacción cromogénica
Lectura proporcional al anticuerpo
unido.

Incubación y lavado

Incubación y lavado

Sensibilización y
bloqueo
U. Benavides - EUTM - 2007 31
 ELISA de emparedado (Ag)

Lectura Reacción cromogénica

proporcional al antígeno
unido.
Incubación y lavado

Incubación y lavado

Incubación y lavado

Sensibilización y
bloqueo
U. Benavides - EUTM - 2007 32
ELISA

U. Benavides - EUTM - 2007 33

ELISA
Ventajas
Desventajas
Utiliza muestras de facil
recolección (suero, sangre, Espectrofotómetro
leche).
Infraestructura
Lenta. necesaria.

Personal técnico.

Alta sensibilidad y
especificidad depende del
antigeno

Permite cuantificar.
U. Benavides - EUTM - 2007 34
Inmunohistoquimica

Evidencian la presencia de antígenos específicos sobre

tejidos, utilizando inmunoglobulinas conjugadas a enzimas
que degradan el sustrato y este precipita.

U. Benavides - EUTM - 2007 35

Inmunohistoquimica

POSITIVO NEGATIVO
U. Benavides - EUTM - 2007 36
Inmunohistoquimica
Ventajas Desventajas

Pone en evidencia Ag en el Tratamiento de la

propio tejido. muestra.

La relación estructural Infraestructura

entre las células es más necesaria.
sencilla de evaluar.
Personal capacitado.
Visualización en M.O.

U. Benavides - EUTM - 2007 37

Dot blot

El Ag se adsorve a una membrana de nitrocelulosa,

sobre la cuál se agregan inmunoglobulinas
conjugadas a enzimas que frente a su sustrato
desarrollan un color (precipitado) en el lugar de la
unión AgAc.

U. Benavides - EUTM - 2007 38

Dot blot

Incubación y lavado POSITIVO

Incubación y lavado

NEGATIVO

Sensibilización y
bloqueo
U. Benavides - EUTM - 2007 39
Dot blot

U. Benavides - EUTM - 2007 40

Western blot

Técnica para separar Ag complejos, e identificar sus

componentes.
Se realiza en tres etapas:

Electroforesis

Transferencia (Blotting)

Inmunoanálisis enzimático

U. Benavides - EUTM - 2007 41

Western blot

Electroforesis Transferencia Inmunoanálisis

enzimático
-

+
U. Benavides - EUTM - 2007 42
Western blot

U. Benavides - EUTM - 2007 43

Radioinmunoanálisis (RIA)

La unión Ag – Ac se revela mediante el marcado de

antiglobulinas con radioisótopos (14C, 125Y).

U. Benavides - EUTM - 2007 44

 Radioinmunoanálisis (Ac)

Disco de celulosa con Ag Medición de

radioactividad

U. Benavides - EUTM - 2007 45

Radioinmunoanálisis (Ac)

Ventajas Desventajas

Equipamiento costoso.
Alta sensibilidad.
Manejo de sustancias
Permite cuantificar.
radioactivas peligrosas.

Manejo de desechos

U. Benavides - EUTM - 2007 46

PRUEBAS DE UNIÓN
SECUNDARIA

Máster. Rosita Chiriboga P

Pruebas de Union secundaria

La union Ag – Ac provoca una segunda reacción

que pone en evidencia el complejo formado.

U. Benavides - EUTM - 2007 48

 Pruebas de Unión
Secundaria

La reacción antígeno – anticuerpo va seguida de

una segunda reacción

Si el antígeno es soluble la Los complejos se agregan y

Si el antígeno es
reacción que se da es de originan fenómenos
particulado(suspensión) la
precipitación perceptibles visualmente.
reacción es de aglutinación.
 de los electrolitos
Dependen en presentes en la
proporción entre
gran medida del reacción, de la
Son reacciones ambos, tipo de
estado físico del afinidad y avidez
no reversibles. inmunoglobulina
antígeno, de la en la interacción
presente
temperatura antígeno-
anticuerpo.

Máster. Rosita Chiriboga P

Pruebas de Union secundaria
• Precipitación : el Ag y el Ac son solubles, y si se forman
complejos en solución estos precipitan.

• Aglutinación : uno de los componentes Ag o Ac es

particulado (bacterias o Ac unido a latex) y al tomar
contacto se forman grumos.

• Lisis por Complemento : si se forma un complejo Ag – Ac

sobre una superficie celular y el complemento se activa el
resultado será la lisis de una célula .

U. Benavides - EUTM - 2007 51

 Precipitación (principio)
Los anticuerpos son bivalentes (unen dos epitopos a la
vez), los antígenos complejos son multivalentes (poseen
muchos epitopos).

Cuando se forman grandes complejos estos se hacen

insolubles y precipitan.

U. Benavides - EUTM - 2007 52

 Precipitación
Precipitado (mg)

Zona de
proporciones
Exceso de Ac óptimas Exceso de Ag
(complejos (complejos (complejos
solubles) insolubles) solubles)

Antígeno (mg)

U. Benavides - EUTM - 2007 53

IDGA (Inmunodifusión en AGAR)

Los Ag y Ac colocados en una placa de gel de agar

difunden radialmente, y en la zona de proporciones
óptimas se produce una banda de precipitación.

U. Benavides - EUTM - 2007 54

IDGA

Ag Ac

Zona de
proporciones
óptimas (banda
de precipitación)

U. Benavides - EUTM - 2007 55

IDGA

U. Benavides - EUTM - 2007 56

IDGA

U. Benavides - EUTM - 2007 57

Inmunodifusión radial

Si al agar se incorpora un antisuero específico, y se

deja difundir una solución de Ag, se formara un anillo
de precipitado que indica la zona de proporciones
óptimas. El área de este anillo tendrá en relación
directa con la [Ag].

U. Benavides - EUTM - 2007 58

Inmunodifusión radial

U. Benavides - EUTM - 2007 59

Precipitación

Ventajas Desventajas

Baja sensibilidad.
Técnicas sencillas, poco
equipo y fácil lectura.

Personal técnico

Muestras de facil obtención.

U. Benavides - EUTM - 2007 60

Aglutinación
Reacción producida por la unión de los Ac con un Ag particulado o
insoluble.

Al igual que en la precipitación existe una falta de reactividad o

aglutinación a altas concentraciones de Ac (prozona).

U. Benavides - EUTM - 2007 61

Aglutinación pasiva

Podemos transformar un sistema precipitante en

uno aglutinante, uniendo químicamente Ag
solubles a partículas inertes como bacterias,
eritrocitos, partículas de látex.

U. Benavides - EUTM - 2007 62

 Aglutinación pasiva (Brucella)

Brucella
Suero problema
+ colorante Aglutinación

U. Benavides - EUTM - 2007 63

Aglutinación pasiva (Brucella)

U. Benavides - EUTM - 2007 64

Hemoaglutinación pasiva

El Ag se une a eritrocitos y estos son los encargados de particular el

Ag.

Eritrocitos con Suero problema

Ag pegado Hemoaglutinación
U. Benavides - EUTM - 2007 65
 Hemoaglutinación y su Inhibición

Virus hemoaglutinante Hemoaglutinación (HA)

Eritrocitos

Inhibición de
Suero problema
Hemoaglutinación (IHA)
U. Benavides - EUTM - 2007 66
Fijación de Complemento

La reacción que sobreviene luego de la unión Ag – Ac es la

activación de la vía clásica del complemento, MAC y lisis
de la célula (hemólisis).

Esto puede utilizarse para medir [Ac] en suero.

U. Benavides - EUTM - 2007 67

Fijación de Complemento

C
C

C C
C
Antígeno
Complemento
(SNC) Eritrocitos cubiertos
de Ac

POSITIVO NEGATIVO
Suero Consumo de C y C disponible y
descomplementado ausencia de hemólisis
hemólisis
U. Benavides - EUTM - 2007 68
PRUEBAS DE UNIÓN
TERCIARIA

Máster. Rosita Chiriboga P

 que el sistema
Se basan en la
inmune
medición de las
desarrolla frente
manifestaciones
a un antígeno en
biológicas
el animal

incluyendo la
o su capacidad
evaluación del
de neutralizar la
efecto protector
acción biológica
real de los
del antígeno
anticuerpos

Máster. Rosita Chiriboga P

 Evalúan la capacidad de los
anticuerpos

De neutralizar la capacidad
Identificación de toxinas biológica de un antígeno
Identificación de virus (virus, toxina)

Medir la actividad de los

Prueba de protección
anticuerpos para neutralizar
(anticuerpos)
a un microorganismo

Máster. Rosita Chiriboga P

Pruebas en Sistemas vivos

Valoran la respuesta inmune y el efecto

neutralizante o protector de la misma,
utilizando animales o células.

U. Benavides - EUTM - 2007 72

Neutralización

Se utilizan para estimar la capacidad de los

anticuerpos de neutralizar la actividad biológica del
antígeno (toxinas bacterianas , virus) cuando se
mezcla con el in Vitro.

U. Benavides - EUTM - 2007 73

Seroneutralización in Vitro

NEGATIVO POSITIVO
Muerte celular Neutralización
(ECP) viral

Virus citopático
+
Suero problema

Línea celular
U. Benavides - EUTM - 2007 74
Pruebas de protección

Se utilizan para evaluar la protección que produce la

respuesta inmune in vivo.

U. Benavides - EUTM - 2007 75

Pruebas de protección

Animales muertos o con

sintomatología (Rabia,
Dosis 1 Dosis 2 Desafío HVB, HVE Clostridios
U. Benavides - EUTM - 2007 76
Aislamiento Viral (células, tejidos, animales de
experimentación)

Detección por IF
Cultivos Efecto y otras pruebas
celulares citopático

Enfermedad Identificación
Parálisis por pruebas
Encefalitis serológicas
Muerte con antisueros
Otros efectos específicos
Animales de
laboratorio
CONCLUSIÓN

1. PRIMARIAS Miden la cantidad de complejo Ag-Ac formado

Miden la unión Ag-Ac in vitro

2. SECUNDARIAS

3. TERCIARIAS Miden las consecuencias o el efecto protector de

anticuerpos en el animal (in vivo)
Prueba
• Responder a las siguientes • 4) Dos tipos de pruebas
preguntas: 0,5 secundarias.

• 1) Cuantos tipos de pruebas • 5) Dos tipos de pruebas terciarias.

serológicas existe.
• 6) Pruebas de aglutinación son
• 2) En que se diferencian. tipo…….

• 3) Dos tipos de prueba primaria • 7) Pruebas de ELISA son de

tipo………

Máster. Rosita Chiriboga Ponce