TECNICAS

INMUNOENZIMATICAS
Lic. Martín Landriel
Lic. M. Soledad Sarniguet
Lic. M. Eugenia Vignolo
 Las respuestas inmunitarias contra la mayoría de los
antígenos inducen la producción especifica de anticuerpos y
linfocitos T efectores.
 Este reconocimiento entre el antígeno – anticuerpo o la
función del linfocito sienta las bases del diagnostico
inmunológico.
 El estudio de las inmunoreacciones se realiza mediante el
empleo de técnicas inmunológicas basadas en la detección de
y evaluación de la respuesta humoral ( anticuerpos y
complemento) o de base celular (linfocitos T y fagocitos).
 SEROLOGIA

La medición de las interacciones Antígeno-

Anticuerpo con fines diagnósticos.
Se realizan en 2 vías:
 Utilización de anticuerpos específicos para
detectar el antígeno.(diagnostico directo)
 Utilización de antígenos específicos para
detectar anticuerpos. (diagnostico
indirecto)
 La reacción entre el Ag y el Ac es de
naturaleza física y química.
 La fuerzas que los mantienen unidos, son
de tipo no covalente, como la atracción
electrostática, los puentes de hidrógeno y
las fuerzas de Van der Waals y la
exclusión del agua.
 Afinidad de un anticuerpo es la fuerza o
intensidad de la unión, entre un sitio de
unión del anticuerpo y un determinante
antigénico.
 Especificidad; capacidad de los anticuerpos
de distinguir y reaccionar con una
estructura química entre muchas.
Capacidad de no dar falsos positivos
 Reactividad cruzada: el anticuerpo
reacciona con otro antígeno, cuando este y
el antígeno que estimulo la producción del
anticuerpo especifico comparten un epitopo
idéntico o muy similar.
 Sensibilidad: Mínima cantidad de analito
(microorganismo en microbiología) que
puede detectar un método. Capacidad de
no dar falsos negativos.
Inmunoensayos
TECNICA DE ELISA

ENZYMED LINKED INMUNOSORBENT ASSAY

En el ELISA, la reaciión Ag-Ac se pone de manifiesto por una
reacción de color generada por una enzima conjugada a los
inmunocomplejos.
Hay diferentes variantes: directos e indirectos, sándwich, de
competencia
Se pueden utilizar para detección (presencia o ausencia) o
para cuantificación
En clínica se utiliza para detectar generalmente anticuerpos en
sangre. Pero su uso es amplio.
En alimentos se utiliza para detectar y/o cuantificar
microorganismos, residuos de ATB, hormonas de usos
veterinario, toxinas y alérgenos.
 Se utilizan ENZIMAS como marcadores, que permiten
detectar las uniones primarias antígeno-anticuerpo.
 Las enzimas son moléculas estables, económicas.
 Son fácilmente conjugables (se unen a) con anticuerpos o
con antígenos.
 Actúan como un sistema indicador de la presencia de
inmunocomplejos al combinarse con sustratos de diversos
tipos.
 El producto de la reacción enzimática da lugar a una
emisión de color (cromogénico), fluoresencia o
quimioluminisencia.
 La intensidad de la coloración o de la inmunofluoresencia
es proporcional a la cantidad de elemento analizado
presente en la muestra.
PRUEBA INMUNOENSAYO
LIGADA A ENZIMAS (ELISA)
En alimentos:
 Se puede cuantificar.
 El grado de transformación del sustrato incoloro a un
producto coloreado se cuantifica objetivamente por
espectrofotometría y es proporcional a la cantidad de
inmunocomplejos formados.

 Se puede detectar presencia/ausencia

 Microorgasnimos patógenos
VENTAJAS

 Método sensible.
 Bajo costo (relativo).
 Fácil manejo.
 Permite desarrollar un gran número de muestras en un
corto período de tiempo.
 Buen equilibrio entre sensibilidad y especificidad.
 COMPONENTES DEL KIT DE
ELISA
SOL.
DILUYENTE

SOL.
STOP
PLACA
SOL. CON
SUSTRATO POSILLOS
(Wells)

CONJUGADO
CONTROLES
MATERIALES Y EQUIPO

PUNTAS DESCARTABLES
RECOMENDACIONES

 MANTENER UN CONTROL ESTRICTO DEL

TIEMPO EN CADA INCUBACIÓN Y
RESPETARLO!!!!
 Colocar la cantidad exacta de reactivo y
muestra a analizar.
 Los lavados deben ser realizados
correctamente
 No deben haber burbujas de aire en las
micropipetas ni en los posillos (Wells) de
la placa.
ELISA DIRECTO (sándwich)
CAPTURA DE ANTIGENO
SANDWICH (procedimiento)

1. Sembrar la muestra
2. Incubar. Tirar sobrenadante. Lavar
3. Agregar el CONJUGADO
4. Incubar. Tirar sobrenadante. Lavar
5. Agregar el SUSTRATO
6. Incubar. Leer
 CAPTURA DE ANTIGENO
SANDWICH
 En la placa de poliestireno (pocillo) se encuentra el anticuerpo
especifico para detectar el antígeno en la muestra.
 La solución de CONJUGADO contiene un segundo anticuerpo
especifico que se une por otro epitopo (zona) al antígeno. Este
conjugado lleva unido una enzima.
 El antígeno queda capturado en un “SANDWICH” de anticuerpos.
 Al agregar el sustrato para la enzima, este lo romperá y liberara
un cromógeno. El cambio de color al agregar el sustrato
demostrara la presencia del antígeno.
 La intensidad de la reacción cromática se relaciona directamente
con la cantidad de antígeno.
 Los lavados son fundamentales para evitar falsos positivos
Inmunocromatográfico
 Fundamento
 La inmunocromatografía se basa en la migración de una muestra a través de
una membrana de nitrocelulosa. La muestra es añadida en la zona del
conjugado, el cual está formado por un anticuerpo específico contra uno de
los epítopos del antígeno a detectar y un reactivo de detección.
 Si la muestra contiene el antígeno problema, éste se unirá al conjugado
formando un complejo inmune y migrará a través de la membrana de
nitrocelulosa. Si no hay antígeno, migrará el conjugado y la muestra sin
unirse.
 En zona de test (o reacción) un segundo anticuerpo específico se une a otro
epítopo del antígeno. Al llegar la muestra a esta zona, los complejos
formados por la unión del antígeno y conjugado quedarán retenidos y la
línea se coloreará (muestras positivas). Si no hay color las muestras
son negativas.
 En zona control, un tercer anticuerpo reconoce al reactivo de detección. El
anticuerpo se unirá al conjugado libre. Esta línea es un control de que el
ensayo ha funcionado bien, porque se colorea siempre, con muestras
positivas y negativas.
INMUNOCAPTURA
Técnicas de barrido o
screening
 Se usan en caldos de enriquecimiento selectivos o no
 Se usan métodos de inmuno ensayos que permitan capturar o
pescar antígenos mediante captura “sándwich” de anticuerpos
 Deben ser métodos específicos y sensibles
 Validados internacionalmente
 Las muestras que resulten negativas se descartan (finaliza la
investigación)
 Las muestras que resultan positivas deben ser confirmadas por
aislamiento en placa y posteriores ensayos de indentificación