En presencia de un inhibidor se precisa una concentración de sustrato M para

alcanzar la saturación de una enzima. La km en ausencia de inhibidor es M y la

concentración óptima de inhibidor es M, calcular la constate de inhibición.

[S] = M

V=Vmax

Km = M

[I] = M

Inhibición competitiva

La desoxiadenosin quinasa cataliza la transferencia de un grupo fosforilo del ATP a la

desoxiadenosina. La reacción es inhibida por el desoxi ATP. Se ha medido la velocidad de
reacción de transferencia a diferentes concentraciones de desoxiadenosin, en ausencia de
desoxi ATP (experimentación A) y en presencia de una concentración de 0,05 mM del mismo
(experimenmtación B), las velocidades aparecen en la siguiente tabla.

Desoxiadenosin (mM) A B
0,15 2,65 1,3
0,25 3,9 1,9
0,35 4,8 2,3
0,50 5,9 3
1,0 8 4
 a) Determinar la km de la desoxiadenosin
b) Determine el tipo de inhibición y ki

Experimentación A Experimentación B

y = 0,0804 + 0,0444 x y = 0,1539 + 0,0923 x

Vmax = 1/0,0804 = 12,43 Vmax = 1/0,1539 = 6,49

Km = Vmax * b = 0,5522*10¯³ Km = Vmax * b = 0,5995*10¯³

Se trata de una inhibición no competitiva porque la Vmax disminuye y el km se mantiene

constante.

[I] km m

0 0,5522*10¯³ 0,0444

0,05 0,5995*10¯³ 0,0923

m = km/ki

ki = 0,5995*10¯³/0,0923 = 5,98*10¯³

Una determinada enzima presenta baja actividad in vitro en el plasma de un paciente. Las
pruebas inmunológicas con aticuerpos específicos para esta proteína dieron como resultado que
la cantidad expresada de esta enzima era semejante a la encontrada en individuos normales.
¿Cómo se podrá explicar estos resultados teniendo en cuenta que al incrementar la
concentración del sustrato en el ensayo se puede llegar a medir una actividad normal de la
enzima?

Si existe un baja actividad de la enzima in vitro se debe principalmente por la presencia de un

inhibidor, dicho inhibidor serán los anticuerpos específicos que se están utilizando en el ensayo ya
que estos evitan que a baja concentración de sustrato se forme el complejo ES y se dé la reacción,
por consiguiente es importante utilizar mayor cantidad de sustrato que de anticuerpos para que se
dé la reacción y para que el inhibidor y el sustrato no sean mutuamente excluyentes, en el caso de
que haya más concentración del inhibidor se realizará una inhibición de tipo competitiva.
Como se puede explicar el efecto de la disminución de la Vmax y no afectar el km por un
inhibidor no competitivo

Un inhibidor competitivo siempre se une a la enzima por un sitio diferente al centro activo de la
enzima. Esto afecta a la tasa de la reacción catalizada por la enzima ya que la presencia del
inhibidor produce un cambio en la estructura y la forma de la enzima. Este cambio en la forma
implica que la enzima deja de ser capaz de unirse correctamente al sustrato. Esto reduce la
concentración de enzima "activa" resultando en una disminución de la Vmax. En este tipo de
inhibición, no hay competición entre en inhibidor y el sustrato, así que incrementar la
concentración del sustrato no produce un aumento de la tasa de actividad enzimática. Ya que el
inhibidor puede unirse tanto al enzima libre como al complejo ES no va a cambiar la afinidad
aparente de unión del enzima por el sustrato

En la purificación de enzimas en general en otros procedimientos de aislamiento de proteínas se

utiliza inhibidores de proteasa, un ejemplo, uno de los inhibidores de proteasa más utilizado en
el floruro de fenilmetil-sulfonio que se trata de un inhibidor irreversible para proteasa que
contiene un residuo de serina en su centro activo. ¿Cuál puede ser el mecanismo de inhibición
para el floruro de fenilmetil sulfonio y con qué fin se inhibe las proteasa?

Es un inhibidor de proteasas de serina usado comúnmente en la preparación de lisados celulares,

en los que preserva a las proteínas celulares de su digestión por proteasas. Aunque actúa
específicamente sobre proteasas de serina, no inhibe todas las enzimas conocidas de este tipo. Se
descompone rápidamente en agua (vida media de 110 min a pH 7 y 35 min a pH 8) de modo que
es preparado en disoluciones de alcohol anhidro, isopropanol, aceite de maíz o DMSO. La
inhibición de la proteólisis ocurre cuando se utiliza a una concentración de entre 0,1 y 1 mM.

El compuesto se une específicamente a la serina del sitio activo de la proteasa, no uniéndose al

resto de residuos de serina de la proteína. Su especificidad por este residuo concreto se debe a las
especiales condiciones fisicoquímicas en las que éste se encuentra en el sitio activo de la proteína,
que posibilitan su actividad enzimática. La molécula de PMSF se une covalentemente a la enzima,
lo que posibilita que el complejo pueda ser visualizado mediante cristalografía de rayos X, siendo
por tanto utilizado como marcador químico para identificar el sitio activo de las proteasas de esta
clase.
La toxicidad de este compuesto es alta, su LD50 es menor de 500 mg/kg. El PMSF es un compuesto
químico citotóxico que debe ser manejado en campana de extracción tomando todas las
precauciones de seguridad necesarias.

Esquema de reacción

Enzima(activa)Ser-O-H + F-SO2CH2C6H5 → Enzima(inactiva)Ser-O-SO2CH2C6H5 + HF

Ser-proteasa + PMSF → Complejo irreversible enzima-PMS + HF
a) Descríbase el efecto de la variación de pH sobre Km y Vmax

El efecto que ejerce el Pb sobre la constante km es inversamente proporcional como se muestra

en la tabla, a medida que disminuye el pH, km se incrementa, mientras que la incidencia del pH
sobre la velocidad máxima es irrelevante, Vmax se mantiene por lo tanto la variación del pH incide
sobre km y Vmax, como un inhibidor competitivo.

b) Qué significa el hecho de que un sustrato no cargado casi no altere la actividad del enzima a
valores de pH entre 6-8

Las enzimas para alcanzar sus actividad máxima requieren un pH óptimo donde la enzima no tiene
carga global ya que existe igual número de radicales ácidos y básicos; el pH óptimo está
condicionado por el tipo de enzima y el sustrato, ya que el pH influye en el grado de ionización de
los radicales del sustrato, por lo tanto un sustrato no cargado que casi no altere la actividad de la
enzima al pH indicado, significa que el grupo activo de la enzima no se va a encontrar cargado
debido a que el sustrato no posee grupos ácidos o básicos y por lo tanto al variar la concentración
de H la actividad no se ve afectada. : H no afecta actividad de la enzima

c) Propóngase un esquema de reacción que sea coherente con los resultados

S + E ↔ SE ↔ EP
↕
SH

d) Calcúlese la constante de disociación relevante del complejo hidrógeno reactivo

y = a + bx
x= 0 y=a=km real

ke = km/m
DESPROTONIZADO

a) Determinar ka, kb, ka’, kb’

ka = [E] [H] / [EH]

kb= [EH] [H] / [EH2]
ka’= [ES] [H] / [EHS]
kb’= [EHS] [H] / [EH2S]

b) Vmax = kcat [E]

[E] = 1umol/ 10^-6umol = 10^-6 mol

Vmax = 7, 05 * 10^-4 mol/min

Kcat = (7, 05 * 10^-4 mol/min)/ 10^-6 mol

Kcat = 705 min^-1 = 11,75 s^-1