BIOLOGÍA MOLECULAR

TALLER 3
REPLICACIÓN DEL ADN

Para leer: Karp capítulo 13.1 y 13.2 - Watson: Capítulo 8.

Revise los siguientes conceptos:
• Replicón • Cadenas Continua y discontinua
• Origen de replicación – Ori C – Secuencia • Primer / cebador
ARS • Actividad polimerasa 5’-3’
• Replicación bidireccional • Actividad exonucleasa 3’-5’ y 5’-3’
• Cadenas antiparalelas • Telomerasa
Lesión y reparación del ADN

TALLER

1. ¿Cuál es la secuencia del iniciador (primer o cebador) de 9 nucleótidos que será sintetizado de manera
complementaria a la secuencia indicada, durante el proceso de replicación? No olvide señalar los extremos
5´y 3´del primer. ¿Cuál es la enzima encargada de sintetizar este iniciador en los procariotas y en los
eucariotas?
5´ AGGCCTCGAATTCGTATAGCAAATCGA 3´

2. En el siguiente esquema, relacionado con el proceso de replicación, señale en los recuadros, los
siguientes elementos: topoisomerasa, proteínas de unión al ADN de cadena sencilla (SSBP), helicasa, primer
o cebador, horquilla de replicación, primasa y extremos 5´y 3´ de las cadenas de ADN. Dibuje en la horquilla
de la derecha el complejo de la ADN polimerasa y las cadenas continua y discontinua. ¿En dónde se ubicaría
el origen de replicación? (puede indicarlo con una flecha)

3. Lebowitz y McMacken realizaron experimentos para determinar cuáles proteínas intervienen en el inicio
de la replicación en E. coli. Con el fin de identificar las proteínas con actividad helicasa, realizaron un ensayo
combinando las técnicas de electroforesis y de marcaje radioactivo (32P) de un fragmento de ADN lineal
(color rojo), complementario al ADN genómico del fago M13, de cadena sencilla circular (color azul).Como
resultado del experimento, lograron confirmar la actividad helicasa de la proteína DnaB y el efecto de las
otras proteínas en la replicación. Los resultados del ensayo empleando este sistema y evaluando las
proteínas DnaA, DnaB y SSB por separado y en combinación se muestran en la siguiente figura.
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(Fuente: LeBowitz, J.H. and R. McMacken, The Escherichia coli DnaB replication protein is a DNA helicase. Journal of Biological Chemistry 261, 5 April 1986. figs. 2,
3, pp. 4740–41. American Society for Biochemistry and Molecular Biology.)

Con base en lo observado en la figura (a):

- Señale la banda que corresponde al ADN circular del fago M13 y la que corresponde al ADN en su
conformación lineal.
- Explique por qué se observa una banda de bajo peso molecular en el carril 2.

Con base en los resultados observados en la figura (b):

- ¿A qué podrían corresponder los carriles 1 y 2? ¿Por qué estos dos ensayos (controles) son necesarios?
- Analice ahora los resultados de los carriles 3, 8 y 9 los cuales corresponden al ensayo en presencia de una
sola proteína. ¿Qué observa? ¿Qué concluye entonces de este primer conjunto de resultados?
- Analice ahora los resultados de los carriles 4, 5, 6 y 7 comparándolos con el carril 3. ¿Qué observa y qué
concluye?
- Cómo interpreta ahora estos resultados conociendo la función de las SSBP. ¿Qué proteína podría ser
DnaG?

4. Blackburn y colaboradores obtuvieron el premio Nobel por sus estudios sobre la telomerasa. Ellos
determinaron que la actividad telomerasa es clave en el alargamiento y mantenimiento de los telómeros
en los cromosomas eucariotas.

Durante el ensayo se le adicionó a la telomerasa ADN de doble cadena (sustrato) lineal (—) o circular
(O) que portaba una secuencia específica reconocida por la telomerasa. El ADN (sustrato) y la telomerasa
se incubaron en presencia o ausencia de otros componentes para determinar los requerimientos de la
enzima y poder determinar su actividad. En la electroforesis, se observan los
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resultados del ensayo donde se evidencia la síntesis de diversos fragmentos del ADN molde, de mayor
tamaño que lo observado en el control sin telomerasa (carril 1).
a. ¿Qué puede concluir de los resultados obtenidos en los carriles 2, 3 y 4?
b. Compare los resultados del carril 4 con los obtenidos en el carril 7 (recuerde que el ADN circular
puede estar relajado y superenrrollado). ¿Qué indican estos resultados? Justifique brevemente