Ejercicios hechos en clase de Fenol (2021-22)

1. Observa las siguientes construcciones diseñadas para generar organismos transgénicos y

razona si contienen fusiones transcripcionales, traduccionales o ambas. ¿Qué se puede decir
de los patrones de expresión de los reporteros en cada caso?

a) Tenemos un promotor 35S, un gen GFP y un gen de polyA. Es transcripcional porque

fusionamos un promotor distinto con los genes. En cualquier condición, se traduce la proteína
GFP en cualquier condición en el citosol al ser una proteína estable.

b) Modificamos la regulación de la transcripcional y al tener una región codificante del gen de

interés. El gen GFP está fusionada con el gen de interés (con vida corta y del núcleo). La
proteína GFP es muy estable y de vida larga. Sin embargo, al estar unido a este gen GOI, no
está expresada la proteína GFP mucho tiempo. Entonces, sería transcripcional y traduccional.

c) En el tercer caso, sucede lo mismo que en el segundo. Solo cambia el orden de traducción.

d) Estamos codificando un promotor quimérico (promotor mínimo) al cual hemos pegado un

elemento cis para que responda a la respuesta de etileno. Entonces, nos da a entender que se
trata de una fusión transcripcional. A su vez, se fusionan las proteínas GOI y GFP, es decir, es
también una fusión traduccional.

e) Hay una fusión génica (tenemos una proteína quimérica=unión de módulos de forma
artificial) es decir, una fusión traduccional. No es una fusión transcripcional porque no le
hemos añadido un promotor no correspondiente. (El gen GUS y GFP se expresan siempre
cuando se active el promotor X)

2. Esta línea transgénica de Arabidopsis presenta actividad GUS y GFP en un conjunto de

células específicas dentro del meristemo apical de la raíz, que es totalmente normal.

¿Qué puedes deducir sobre el gen X y su función en dicho meristemo?

Si no se expresa en un órgano, nos indica que no es esencial ese gen en ese órgano.

El promotor X presenta la expresión de GFP y GUS. Quiere decir que no se transcribir el gen X
porque hay una cola de polyA en la fusión génica. Entonces, no es esencial el gen X en el
crecimiento y la supervivencia del meristemo apical de la raíz.
Ejercicios hechos en clase de Fenol (2021-22)

3. Diseña una fusión génica para sobreexpresar constitutivamente el gen X. ¿Puedes predecir
si esta línea tuviera un fenotipo normal o anormal en la raíz basándote en el resultado
anterior? ¿Por qué?

Tendría un fenotipo anormal porque se expresaría ese gen X que no suele expresarse ahí
habiendo consecuencias.

Para ello, podemos añadir un promotor muy fuerte (35S).

4. Diseña un fusión traduccional para identificar la localización subcelular de la proteína X,

bajo el control de su propio promotor. ¿Es posible que cuando transformes plantas con esta
fusión las células marcadas en la raíz no sean las mismas que en experimento 7?

Básicamente, fusionaríamos la región codificante del gen X con el gen de GFP. Esto implica la
expresión del gen X produciendo la proteína X fusionada con la proteína GFP (c).

Sería posible que la proteína se transcriba en un conjunto de células, pero no ejerce la función
en esas células. Sino que se transportan por los plasmodesmos a otras células donde se dará la
función.

5. Analiza la siguiente construcción y predice las consecuencias de insertarla en un genoma

celular (se omiten las señales de polyA y la fusión génica para selección).

GFP: se expresa GFP en el dominio del promotor X.

Proteína X: se expresa bajo el promotor de levadura UAS. Este promotor se activa con la GAL-4.
La GAL-4 no se puede producir porque no hay un promotor para este gen GAL-VP.

Por tanto, está mal diseñado.

6. Analiza la siguiente construcción y predice las consecuencias de insertarla en un genoma

celular (se omite las señales de polyA y la fusión génica para selección) cada una por
separado y posteriormente combinarlas por cruzamiento de 2 en 2.
Ejercicios hechos en clase de Fenol (2021-22)

1 No le hemos puesto promotor al GAL-VP, pero nosotros lo insertamos al azar. Y como está en
el borde y se insertarse cerca de un promotor génico, ese promotor podría expresar el gen
GAL-VP16. Por ello, tanto GFP como la proteína X se expresarían porque dependen del GAL-4.

2 El GAL-4 se produce donde se exprese el promotor X.

3 No va a funcionar porque UAS necesita de GAL-4 para funcionar.

4 Se expresa GAL-4 donde se exprese el promotor X y dará la proteína GFP.

5 No tiene diana, no veremos proteínas.

6 Pasa lo mismo que el ejercicio 5.

7 Como no tenemos GAL-4, no habrá expresión de UAS. El promotor está muy cerca de la
posición de inserción. Entonces, si en el genoma celular hubiese una región genómica, no se
activaría el promotor porque falta el factor de transcripción (GAL-VP16). Por ello, lo tenemos
que combinar con algunas de las secuencias de arriba.

Cruzando algunas obtendremos secuencias interesantes. Si cruzamos con la línea 5, vamos a

tener un planta en la que estamos produciendo GAL-4 en dominio del promotor X expresando
el gen UAS.

7. Diseña una línea de ratones transgénicos con el sistema Cre-LoxP para determinar si el gen
BRCA1 es un supresor tumoral en riñón.

Se generaría dos líneas de ratones. Uno tiene el gen que estudiamos con sitios LoxP
flanqueantes en los intrones (no puede ser en exones porque introducimos mutaciones en el
gen BRCA1) y la otra que expresase la recombinasa Cre.

Y tenemos que regular la expresión de Cre con un promotor específico de riñón para que se
regule la actividad de la recombinasa solamente en ese órgano.

Cuando cruzamos los ratones, se eliminan el gen supresor tumoral BRCA1 en el riñón con el fin
de determinar la función del gen.
Ejercicios hechos en clase de Fenol (2021-22)

8. Incluye en el diseño una fusión que permita monitorizar mediante GFP la efectividad de la
recombinasa Cre para asegurarnos de que el sistema Cre-loxP ha funcionado.

Se puede introducir una fusión génica (con promotor) que exprese GFP a la vez que
introducimos los Lox.

Entonces, en el riñón se eliminará tanto el gen BRCA1 como el GFP.

Otra opción es usar PROMOTOR RIÑÓN-CRE-BFP (otra proteína fluorescente). Veríamos

fluorescencia azul en el riñón verificando la actividad de recombinasa como esperábamos.

9. Modifica el diseño anterior para comprobar si BCRA1 tiene un efecto similar en otros
órganos del ratón

La cepa de ratones que está loxeado, no nos sirve.

Entonces, habría que cambiar simplemente el promotor por uno que se exprese en el tipo
celular que queramos.

10. Comenta las consecuencias de la inserción en un genoma de estas construcciones

El factor de transcripción es XVE. (Con beta-estradiol metemos el producto genómico en el

núcleo). Este factor hace que se exprese OlexaA. Entonces, no se va a expresar este factor ya
que carece de promotor.

En este caso, si que se expresa cDNA porque tiene promotor X.

XVE se expresa donde esté activo el dominio del promotor X. Y como OlexA se activa por XVE,
se expresará GFP gracias a la expresión de OlexA.

Solas no se van a expresar.

Pero, las cruzamos con y se expresan en cualquier

sitio.
Ejercicios hechos en clase de Fenol (2021-22)

En este caso, se expresa en cualquier lugar el factor XVE (regulado por estrógenos). Esto
permite que se exprese GAL-4 represor con el promotor OlexA. Y al haber GAL4 represor, no se
puede activar el promotor UAS y reprimiría la expresión de cDNA X.

Pero, incluso si no se expresa el GAL4 represor, se sigue sin expresar el cDNA X.

En esa ocasión, además de utilizar beta-estradiol para que esté activo el promotor amarillo,
tenemos que promover un choque térmico.

XVE se expresará si se da un choque térmico que activa al promotor. Este factor activa OlexA
que promueve la expresión de GAL4 activador que activa el promotor UAS que codificará el
cDNA X.

Se diseña un ACTIVADOR que se solo se una al promotor diana tras la unión del ligando
inductor.

11. ¿Se puede usar un factor de transcripción represor para activar de modo condicional
(inducible) la expresión de un transgén? ¿Cómo?

Es posible. Podemos diseñar un sistema en el cual haya un represor que suele reprimir la
transcripción de un gen. Y si creamos un ligando, se inactiva al represor.

12. ¿Se puede usar un factor de transcripción activador para silenciar de modo condicional
(inducible) la expresión de un gen?

Se basan en el operón. Se diseña un activador que se une al promotor diana, activándolo. El

activador se inactiva por unión de un ligando, silenciando el transgén.

13. En el diseño de un vector para realizar iRNA se introduce la secuencia deseada para
producir un miRNA que interfiera con el tránscrito Gag del HIV. Como los miRNAs no
contienen colas de poliA, ¿crees que es necesario incluir una señal de poliadenilación en el
vector? Razona la respuesta

El miRNA se utiliza como antiviral. Para producir un miRNA, no hace falta colas de poliA.
Ejercicios hechos en clase de Fenol (2021-22)

Los miRNA se producen a partir de un tránscrito que tienen una cola poliA. Por ello, el vector
deber una cola para que se transcriba este miRNA.

Con esta tecnología de iRNA, ¿se consigue el mismo efecto que generando una mutación KO
en el gen que queremos silenciar?

En primer lugar, el genoma en el organismo que usemos sigue poseyendo el gen que
queremos codificar. En realidad, no se modifica el gen. Entonces, obtenemos varias las líneas
transgénicas que producen diferentes cantidades de miRNA. Habrá algunas líneas que se
degradan a diferentes niveles y podemos así actuar sobre la proteína más adecuada.

14. Tras transformar arabidopsis con un transgen que produce un iRNA contra el gen que
codifica la subunidad pequeña de la RuBisCO (gen nuclear), ¿se modificará el locus genómico
de dicho gen?

No se modifica el gen de la RuBisCO porque el que se modifica es el que está en contra de

dicho gen. (Se modifica la expresión de dicho gen, no su secuencia de DNA=objetivo del iRNA)

15. ¿Es posible utilizar un iRNA dirigido contra el mRNA del gen que codifica la subunidad
grande de la RUBISCO (gen cloroplástico)?

La RuBisCO es una proteína muy grande que consta de varias subunidades. Una de ellas se
codifica en el cloroplasto. El sistema celular que emplea la interferencia del RNA es en el
núcleo y en citoplasma. Por tanto, no se puede utilizarlo para un gen cloroplástico y
mitocondrial.

19. En el esquema se muestra la estructura de un gen, el mRNA maduro derivado de él y la

proteína resultante de la traducción de éste. Diseña una estrategia para:

1. Eliminar del genoma solamente el exón 3 con nucleasas de diseño. Indica a qué sitio o
sitios del gen dirigirías las nucleasas y describe básicamente cómo lo harías

Se dirigen las nucleasas a los flancos del exón 3 o a los intrones que se encuentras
subyacentes al exón 3 fijándonos en el genoma. (Ej: Cre-lox)

2. ¿Es posible usar el sistema CRISPR-Cas para eliminar con precisión el exón 3?

Tenemos que diseñar dos RNA guía que nos corten a la izquierda y a la derecha del
exón 3.
Ejercicios hechos en clase de Fenol (2021-22)

3. Si se quiere utilizar un sistema de interferencia de RNA para silenciar este gen, ¿sería
necesario diseñar el iRNA específicamente sobre las regiones transcritas alguno de los
3 exones? ¿Por qué?

Debemos etiquetar el DNA para que se degrade el RNA. Para ello, hay que diseñar el
iRNA que sea complementario a algunos de los exones fijándonos en el mRNA maduro
y no en la secuencia del gen.

4. Si la función de la proteína solo requiere un dominio A intacto, ¿qué resultados

esperas de las estrategias 1, 2 y 3?

En el 1, la proteína seguiría siendo funcional. En el 2, también seguiría siéndolo. Y en el

3, no podemos responder frente a la actividad de los dominios porque se degrada todo
el mRNA.

16. Tanto las nucleasas de diseño como el sistema CRISPR-Cas permiten efectuar un corte en
el DNA genómico en una secuencia específica del mismo. ¿Dónde reside esta especificidad
en cada uno de los sistemas?

En el caso de las nucleasas de diseño, la especificidad se da por el dominio de aa que tiene la

nucleasa.

En el CRISP-Cas presenta esa especificidad en el RNA guía.

17. Una limitación muy importante del sistema CRISPR-Cas es que la secuencia genómica
específica a la que se dirige la nucleasa Cas es de tan solo 20 nt, lo que hace probable que se
produzcan cortes no deseados en otros sitios del genoma. ¿Cómo puede minimizarse esto?

La misma estrategia de las nucleasas de diseño flanqueando la secuencia diana pasa. Lo que
hacemos que evitamos el corte de doble hebra. Entonces, mutamos la Cas que carece de las
actividades nickasa permitiendo el diseño de 2 gDNA para una secuencia dada.

Utilizamos un RNA guía que dirige un complejo y a otro RNA guía que dirige a otro complejo a
un sitio cercano del primero.

18. Usando CRSIPR se ha obtenido en un solo paso una línea de células humanas
pluripotentes en la que CCR5 (que codifica un receptor del HIV) ha perdido su función.
¿Sería posible con la misma tecnología restaurar también en un solo paso la versión silvestre
de CCR5?

Se puede hacer el reemplazo génico con CRISPR-Cas. Se introduce cortes y se espera que los
mecanismos de restauración actúen. Si nosotros presentamos un oligonucleótido que presenta
una secuencia que nosotros queremos con los extremos compatibles con los extremos del
corte, se puede introducir esa secuencia (recombinación homóloga inducida).
Ejercicios hechos en clase de Fenol (2021-22)

Debemos utilizar dos RNA guía y un DNA bicatenario que tenga la secuencia deseada. Aunque
no es tan eficiente como la producción de mutaciones en los genes implicados en la
enfermedad.

20. ¿Sería posible inactivar en un animal o una planta los dos alelos de un gen pero
solamente en un tipo celular concreto mediante nucleasas de diseño o CRISPR?

Si porque el transgénico es introducido en todas las células. Aunque la proteína se da donde se

active el promotor.

21. ¿Se podría usar el sistema CRISPR para activar o reprimir la transcripción de un gen
específico de un genoma?

Si porque nosotros podemos usar versiones de CRISPR Cas deficientes de la actividad de

nucleasa.