BIOLOGÍA MOLECULAR Y

CITOGENÉTICA
UNIDAD DIDÁCTICA 1

Laboratorios de Biología Molecular y Citogenética

Daniel Brell Martín

Ldo. Biología y Bioquímica
Ciclo Formativo de Grado Superior en Anatomía Patológica y Citodiagnóstico
BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA
■ Biología Molecular: parte de la Biología que estudia la composición, estructura y
función de las moléculas biológicas, así como los procesos en los que actúan.
– Biología Molecular → ácidos nucleicos.
– Proteómica → proteínas
■ Citogenética: parte de la Genética que estudia la estructura, función y
comportamiento de los cromosomas en metafase.
– Citogenética molecular → se sirve de técnicas características de la Biología
Molecular.
■ Unidad de Genética: unidad asistencial que, bajo la responsabilidad de un
facultativo con formación adecuada, está dedicada a la realización de pruebas
genéticas y la emisión de dictámenes correspondientes con fines diagnósticos.
(RD 1277/2003, de 10 de octubre, por el que se establecen las bases generales
sobre autorización de centros, servicios y establecimientos sanitarios)
EQUIPAMIENTO EN LAB. BIOLOGÍA MOLECULAR
■ Equipamiento específico: permite realizar técnicas exclusivas propias de este tipo de
laboratorio. Destacan:
■ Termociclador (máquina de PCR) → realiza secuencialmente un n.º elevado de
ciclos repetitivos programables con temperaturas diferentes y a distintos tiempos de
incubación, todo controlado por un microprocesador.
– Bloque incubador: soporte metálico con múltiples pocillos para colocar los tubos
de reacción de PCR. Es la parte más importante del termociclador. El rango de
temperaturas que alcanza oscila entre 4 ºC y 96 ºC.
- Sistema de aire caliente y frío o resistencias eléctricas (aparatos más antiguos).
- Materiales semiconductores en conjunción con
el efecto Peltier (termocicladores actuales).
– Tapa del bloque incubador: tapa termostatizada
a 102 - 105 ºC que entra en contacto directo con
los tubos una vez cerrada y evita evaporación del
agua de la mezcla de reacción de PCR.
EQUIPAMIENTO EN LAB. BIOLOGÍA MOLECULAR
■ Equipamiento específico:
■ Termociclador a tiempo real → incorpora, además, un
sistema láser y detección de fluorescencia capaz de excitar
y medir la fluorescencia emitida por cada tubo de reacción
individualmente.
¡Permite la detección de síntesis de productos de
amplificación en tiempo real!

■ Efecto Peltier: efecto termoeléctrico que

produce transferencia de calor entre 2 metales
o semiconductores diferentes unidos por una
corriente continua. Permite a los
termocicladores actuales aumentar o disminuir
rápidamente la tª del bloque de incubación de
los tubos de reacción PCR por inversión de la
polaridad que alimenta el circuito.
EQUIPAMIENTO EN LAB. BIOLOGÍA MOLECULAR
■ Equipamiento específico:
■ Equipo de electroforesis → técnica de separación de moléculas por aplicación
de un campo eléctrico en una disolución tampón de pH conocido (≈ 7.5 – 7.8)
tras sumergir una matriz conteniendo las muestras.
- Permite la separación de moléculas de ácidos nucleicos (o proteínas) de
distintos tamaños.
- El análisis de productos de amplificación obtenidos tras la PCR.
- La purificación y obtención de fragmentos de tamaños concretos de ADN.

Los factores limitantes al paso de las moléculas por la matriz son

1. La carga neta → negativa a ese pH (proteínas / ácidos nucleicos).
2. El tamaño de la molécula.
3. La conformación tridimensional.
EQUIPAMIENTO EN LAB. BIOLOGÍA MOLECULAR
■ Equipamiento específico:
La localización final de las moléculas migradas en el gel se realiza por la adición
de un agente intercalante (bromuro de etidio → ¡ojo!: cancerígeno / teratógeno).
➢ Las partes en que se divide el sistema de electroforesis son:
■ Soporte plástico → permite la solidificación del gel.
■ Cubeta de electroforesis → compuesta por:
– Soporte central conteniendo el gel.
– Dos depósitos de tampón de electroforesis situados en cada extremo
del sistema.
– Electrodo + (ánodo) y – (cátodo) a cada lado de la cubeta.
■ Fuente de alimentación → suministra corriente eléctrica continua a la
cubeta de electroforesis. Debe tener un sistema de graduado de la
intensidad de corriente transmitida.
EQUIPAMIENTO EN LAB. BIOLOGÍA MOLECULAR
■ Equipamiento específico:
Matrices utilizadas en electroforesis de ácidos nucleicos
➢ Geles de agarosa [0.5% y 2%] → se utilizan para separar fragmentos de
mayor tamaño (↑V vs ↓R).
➢ Geles de poliacrilamida (PAGE) → formados
por la polimerización de dos componentes:
Acrilamida + Bisacrilamida.
Óptimos para separar moléculas de menor
tamaño, puesto que al variar la [gel] varía el
tamaño del poro:
(↑ [gel] → ↓ diámetro del poro = ↑R).
EQUIPAMIENTO EN LAB. BIOLOGÍA MOLECULAR
■ Equipamiento específico:
■ Equipo de electroforesis (una vez terminada la migración)
– Documentador de geles → equipo que permite visualizar las bandas de
ácidos nucleicos en el gel tras la electroforesis.
■ Transiluminador → consiste en una fuente de luz UV (λ ≈ 245 – 365
mm) situada por debajo de una superficie transparente que soporta el
gel. La luz UV actúa sobre el agente intercalante, el cual emite
fluorescencia (rojo-anaranjada en el caso del bromuro de etidio) y
permite visualizar las bandas correspondientes a las moléculas de
ácidos nucleicos.

■ Cámara fotográfica → constituye el sistema de captación de imágenes

del gel del sistema electroforético. Se integra en la zona superior a la
cámara oscura y es controlada por un software.
EQUIPAMIENTO EN LAB. BIOLOGÍA MOLECULAR
■ Equipamiento genérico:
■ Cabina de bioseguridad → constituye el principal equipo de contención
físico del laboratorio, actuando como barrera 1ª ante el paso
de aerosoles a la atmósfera de trabajo.
– Deben utilizarse siempre que se desarrollen procedimientos
con riesgo de producir aerosoles peligrosos (centrifugación,
agitación, apertura de envases cuya presión interior difiera
de la exterior, etc.)
– Están diseñadas para proteger al usuario de riesgos
asociados al manejo de material infeccioso y otros
materiales biológicos nocivos (se excluyen productos
radiactivos, tóxicos y corrosivos).
EQUIPAMIENTO EN LAB. BIOLOGÍA MOLECULAR
■ Equipamiento genérico:
■ Cabina de bioseguridad → Distinguimos tres clases:
- Cabinas de Seguridad Biológica Clase I
CRITERIO DE SELECCIÓN DE Destinadas al manejo de agentes biológicos que entrañen
UNA CABINA DE SEGURIDAD
BIOLÓGICA
riesgo leve o moderado. No garantiza protección de la muestra
ni a la exposición por contacto de productos peligrosos.
A la hora de elegir una cabina de
seguridad biológica es preciso tener en - Cabinas de Seguridad Biológica Clase II
cuenta tres cuestiones esenciales: Destinadas al manejo de agentes biológicos que entrañen
• Grupo de riesgo al que pertenece el riesgo leve o moderado, garantizando protección del operario,
material manipulado.
de la muestra y del medioambiente.
• Riesgo de generación de aerosoles al - Cabinas de Seguridad Biológica Clase III
manipular el material.
Destinadas al manejo de agentes biológicos de los grupos de
• Grado de protección que se pretende riesgo 3 y 4. Son herméticas, separando completamente al
obtener frente al ambiente.
operario de los procedimientos llevados a cabo.
EQUIPAMIENTO EN LAB. BIOLOGÍA MOLECULAR
■ Equipamiento genérico:
■ Sistema de purificación del agua → el laboratorio de Biología Molecular requiere
un suministro estable de agua purificada tipo II y agua ultrapura tipo I.
- Agua purificada tipo II
- Preparación de soluciones
tampón, medios de cultivo, etc.
- Limpieza autoclave, material.
- Agua ultrapura tipo I
- PCR, HPLC, secuenciación, etc
EQUIPAMIENTO EN LAB. BIOLOGÍA MOLECULAR
■ Equipamiento genérico:
■ Espectrofotómetro → instrumento usado en física óptica para medir, en función de la
λ, la relación (y también la cuantificación de sustancias y microorganismos) entre
valores de una misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones.
■ Microscopio de luz transmitida y fluorescencia → imprescindible para la
interpretación de resultados tras realizar técnicas de hibridación in situ fluorescente.
■ Autoclave → imprescindible si se trabaja con microorganismo o muestras biológicas
de cualquier tipo.
■ Incubador de CO2 y humedad controlada (cultivos celulares) o estufa (bacterias).
■ Baño termostático, termobloque y placa calefactora → equipamientos básicos para
llevar a cabo incubaciones, digestiones, tratamientos enzimáticos y
desnaturalizaciones del ADN (tª entre 95 y 100 ºC).
EQUIPAMIENTO EN LAB. BIOLOGÍA MOLECULAR
■ Equipamiento genérico:
■ Centrífuga y microcentrífuga → con rotores capaces de centrifugar muestras en
tubos de 50 ml a Eppendorf de 0.2 ml.
■ Neveras y congeladores → fundamentales para conservar reactivos (≈ -20 ºC) y
muestras (tanto de ARN como de ADN a largo plazo, ≈ -80 ºC).
■ Otros equipamientos → abarca equipos básicos de cualquier laboratorio, tales como:
1) balanza de precisión; 2) agitadores magnéticos; 3) vórtex; 4) pHmetro, etc.
ESTRUCTURA DEL LAB. BIOLOGÍA MOLECULAR
La estructura de un laboratorio de Biología Molecular está condicionada por la
técnica de PCR → 4 fases = 4 zonas mínimas
■ Sala de preparación de reactivos → debe disponer de una cabina de bioseguridad, y
es deseable una ligera presión positiva en la zona para evitar la entrada de agentes
contaminantes.
■ Sala de preparación de muestras y extracción de ADN → debe disponer de una
cabina de bioseguridad y de un espectrofotómetro. Es deseable una ligera presión
negativa en la zona para evitar la salida de material contaminante.
■ Sala de PCR → dispondrá de los termocicladores necesarios y mantendrá un espacio
para trabajar con las moléculas de ADN en la preparación de la mezcla de reacción.
■ Sala de post-PCR → aquí se localizarán los equipos de electroforesis y de
documentación de geles. También debería poseer una ligera presión negativa. A
menudo, se complementa con una sala oscura para la visualización de los geles con el
microscopio de fluorescencia.
CONDICIONES DE TRABAJO EN UN LAB. BIOLOGÍA M.
■ Flujo de trabajo →marca el sentido único de los procesos en el circuito de trabajo.
Pre-PCR → PCR → post-PCR
(siempre unidireccional: áreas limpias → áreas sucias)

Contaminación de las muestras

■ Contaminación de las muestras → entendiendo contaminación como “la introducción accidental
de material exógeno que altera su pureza”.
■ Contaminación cruzada: puede ocurrir debido a:
■ Material no amplificado del medioambiente o de microorganismos ambientales.
■ Contaminantes procedentes del propio personal técnico (desescamación de la
piel, pelo, etc.)
■ Contaminantes de la superficie de trabajo.
■ Contaminación por productos amplificados: generados mediante PCR en el propio
laboratorio (carryover).
■ Contaminación de los reactivos comerciales y material fungible: la esterilización no es
sinónimo de ausencia de ADN, ARN e inactivación de enzimas (ARNasas, nucleasas, etc).
CONDICIONES DE TRABAJO EN UN LAB. BIOLOGÍA M.
Normas para la manipulación de materiales y reactivos
■ Técnica aséptica→ conjunto de actividades encaminadas a prevenir la
contaminación por microorganismos, ácidos nucleicos y enzimas nucleasas.
Técnica aséptica
Laboratorio Biología Molecular

Descontaminación de Prevención de contaminación Prevención de

Lavado de manos EPI superficies cruzada ambiental carryover

Cabinas de
bioseguridad
Guantes
Métodos físicos Métodos químicos
Batas Puntas de pipeta

Mascarillas Luz UV Hipoclorito

Flujo unidireccional
Reactivos comerciales
USO EFICIENTE DE LOS RECURSOS EN UN LAB. BIOLOGÍA M.

Para una gestión eficiente de los recursos disponibles deben contemplarse como
mínimo los siguientes puntos:
■ Equipamiento e infraestructuras → plan de mantenimiento y de revisiones
técnicas periódicas.
■ Reactivos → registros de trazabilidad.
■ Recursos humanos → plan de formación inicial y continuada en materia
técnica, seguridad y gestión de los residuos.
■ Técnicas → todos los procedimientos deben estandarizarse mediante PNT.
Asimismo, se requiere una comunicación fluida con el/los solicitante/s para
evitar duplicidad de pruebas y solicitudes inadecuadas.
■ Gestión medioambiental → código de buenas practicas medioambientales.
 EL LABORATORIO DE CITOGENÉTICA Y
CULTIVOS CELULARES
■ Laboratorio de cultivos celulares: tienen como objetivo el crecimiento y propagación de
células eucariotas de organismos pluricelulares en medios de cultivo artificiales en condiciones
controladas.
■ Laboratorio de citogenética: tiene como objetivo el estudio de los cromosomas de especies
eucariotas. Podría considerarse una especialización del laboratorio genérico de cultivos
celulares con dos áreas diferenciadas:
■ Un área de cultivo celular enfocada a la obtención de células en mitosis.
■ Un área de genética enfocada al estudio de los cromosomas metafásicos.

Problemas de contaminación en ambos laboratorios

La contaminación de los cultivos eucariotas por cualquier microorganismo (bacterias, hongos,
virus) supone la muerte del mismo, debido a la velocidad superior de multiplicación y crecimiento
de estos últimos.
EQUIPAMIENTO EN LABORATORIOS DE CITOGENÉTICA
■ Equipamiento específico para cultivos celulares:
■ Cabina de flujo laminar → en su interior se realizarán todos los procedimientos
relacionados con el cultivo celular. Las más adecuadas son las cabinas de bioseguridad
tipo II.

■ Incubador de CO2 → proporciona las condiciones ambientales óptimas para el

crecimiento de las células en los medios de cultivo.
– Tipo especial → Incubador roller
■ Microscopio invertido → el tamaño de los frascos de cultivo
imposibilita la observación directa de
las colonias en un microscopio óptico
convencional.
■ Equipo de criogenia → permite la
la conservación a largo de plazo de
muestras de células y líneas celulares.
EQUIPAMIENTO EN LABORATORIOS DE CITOGENÉTICA
■ Equipamiento específico para citogenética:
■ Equipo de análisis de imagen → permite documentar y analizar células en metafase,
a fin de obtener el cariotipo. Consta de los siguientes elementos:
■ Microscopio óptico convencional.
■ Cámara digital.
■ Software específico → análisis de las metafases cromosoma a cromosoma y
emparejamiento para obtener el cariotipo.

■ Microscopio óptico convencional → para recuentos celulares, estudios de morfología

y viabilidad celular.
■ Microscopio de fluorescencia → para
visualización de las preparaciones de hibridación
con marcadores fluorescentes.
EQUIPAMIENTO EN LABORATORIOS DE CITOGENÉTICA
■ Equipamiento común a ambos laboratorios:
■ Equipo de esterilización →
■ Autoclave.
■ Sistema de filtración → filtros de poros de 0.22 μm para esterilizar soluciones.

■ Sistema de purificación de agua → el agua utilizada para la preparación de cultivos y

reactivos debe ser ultrapura, estéril y libre de patógenos.

■ Neveras y congeladores →
fundamentales para la
conservación de reactivos
(≈ -20 ºC) y muestras a largo
plazo, ≈ -80 ºC).
■ Otros equipamientos
ESTRUCTURA DEL LABORATORIO DE CITOGENÉTICA
El laboratorio de Citogenética debe dividirse como mínimo en 3 salas:

■ Sala de cultivos → en ella se van a realizar todos los procedimientos directamente

relacionados con el cultivo celular. Es recomendable la existencia de cierta presión
positiva para impedir la entrada de contaminantes. Contendrá los siguientes equipos:
– Cabinas de flujo laminar.
– Incubadores.
– Microscopio invertido.

■ Sala de laboratorio convencional → en ella se van a realizar extensiones, tinciones,

cariotipos, citogenética molecular, etc. En caso de tener microscopio de fluorescencia,
la sala oscura se ubicará aquí. Contendrá el resto del equipamiento, salvo los equipos
de criogenia.

■ Sala de frío → contendrá el equipo de criogenia y el resto de congeladores. Debe estar

separada de la sala de cultivos debido a las turbulencias creadas por los equipos.
CONDICIONES DE TRABAJO: TÉCNICA ASÉPTICA
■ Máxima → realizar todas las operaciones con una estricta técnica aséptica.
■ Algunas normas relevantes en el protocolo de trabajo son:
■ Lavarse frecuentemente las manos.
■ Usar guantes y batas “desechables” estériles.
■ Mantener cerrados los accesos a cada sala.
■ Uso exclusivo de materiales y reactivos estériles.
■ No deben introducirse mecheros en las cabinas de flujo dado que alteran las corrientes de aire filtrado y
generan turbulencias.
■ Dentro de la cabina solo debe estar el material que vaya a utilizarse.
■ El material estéril solo debe sacarse al momento de ser usado.
■ El material de vidrio reutilizable debe colocarse en un recipiente con hipoclorito al 10% hasta finalizar la
sesión de trabajo. Posteriormente, se procederá a su esterilización.
■ El material fungible utilizado deberá depositarse en los contenedores adecuados para ser retirados una vez
concluya la sesión de trabajo.
■ Restringir el acceso a la sala de cultivos de toda persona ajena a los procedimientos.
■ Las cabinas de flujo laminar deben limpiarse con etanol al 70% o desinfectante apropiado al finalizar la
sesión de trabajo. Si poseen lámpara germicida, deberá conectarse 30’ después de la limpieza.
■ Realizar un mantenimiento programado de las cabinas de flujo laminar (mínimo: anual), con comprobación
del filtro HEPA.
■ Una vez concluida la sesión de trabajo, limpiar las superficies con etanol al 70% o desinfectante apropiado.