Laboratorios de Biología

Molecular y Citogenética
Biología Molecular y Citogenética.
Tema 1
Bioquímica

• El estudio de la composición química de los seres vivos, especialmente las

proteínas, carbohidratos, lípidos y ácidos nucleicos, entre otras pequeñas
moléculas presentes en las células y las reacciones químicas que sufren estos
compuestos (metabolismo) que les permiten obtener energía (catabolismo) y
generar biomoléculas propias (anabolismo).
• Proteómica y biología molecular (ácidos nucleicos)
Proteínas y Ac. Nucleicos
Citogenética

• El campo de la genética que comprende el estudio de la estructura, función y

comportamiento de los cromosomas en metafase.
Unidad genética

• Tanto los laboratorios destinados a los

estudios de citogenética cómo a los
destinados a la biología molecular se
engloban en las unidades genéticas de las
instituciones.
• Ambas disciplinas son necesarias para la
realización de estudios genéticos.
• Laboratorios distintos pero sincronizados.
Laboratorio de biología molecular

• Equipamiento especifico
– El termociclador.
– El equipo de electroforesis.
– El documentador de geles.
– Material para la extracción de ácidos nucleicos.
– Secuenciadores
• https://www.youtube.com/watch?v=rO4fR08HtWs&ab_channel=JorgeFNavarr
ete
Laboratorio de biología molecular

• El termociclador: Es el aparato en el que se lleva a cabo

la PCR.
– El bloque incubador. Es la pieza capaz de mantener, en
todo su volumen, las diferentes temperaturas durante los
tiempos que se programan para cada fase y en cada uno
de los ciclos de PCR.
– La tapa del bloque incubador. Es una tapa termostatizada
entre 102-105 ºC que evita que el agua de la mezcla de
reacción PCR se evapore por efecto de las altas
temperaturas.
• Un tipo especial de termociclador es el termociclador a
tiempo real. Este modelo, además incorpora un sistema
de laser y detección de fluorescencia. Esta tecnología
permite detectar la síntesis durante la amplificación en
tiempo real.
 Laboratorio de biología molecular

• El equipo de electroforesis.
– En este proceso separamos las moléculas
de ácidos nucleicos, en una matriz de gel
de poliacrilamida o de agarosa, sirve para
analizar los productos de una PCR o
purificar buscando fragmentos concretos
de ADN.
– Para ello aplicamos un campo eléctrico en
una disolución tampón (pH 7,5-7,8), en la
que se sumerge la matriz donde las
muestras de ácidos nucleicos migran con
mayor o menor velocidad en función de la
cantidad de carga, su tamaño y su
conformación tridimensional.
– Para poder visualizar los ácidos nucleicos
en el gel se utiliza un agente fluorescente
como el bromuro de etidio.
Laboratorio de biología molecular

• El documentador de geles.
– Un transiluminador: Es una fuente de luz ultravioleta.
Cuando la luz UV se ilumina y pasa a través del gel, el
bromuro de etidio emite fluorescencia, viendo unas
bandas, estas corresponden a las moléculas de ácidos
nucleicos.
– Una cámara fotográfica y PC: Para ver el gel se usa
una cámara oscura preparada para trabajar con luz
UV y controlada por un software específico.
Laboratorio de biología molecular

• Material para la extracción de ácidos nucleicos.

– Kits comerciales específicos.cada uno con sus extracciones
Laboratorio de biología molecular

• Secuenciadores ADN
Laboratorio de biología molecular

• Equipamiento genérico
– Neveras y congeladores de –20 ºc • La cabina de bioseguridad
y –80 ºc • El espectrofotómetro
– Centrífuga y microcentrífuga • Incubador o estufa
– Autoclave
• Baño termostático y termobloque
– Sistema de purificación de agua
• La placa calefactora
– Microscopio de fluorescencia
Laboratorio de biología molecular

• Estructura: depende de las necesidades de la técnica PCR

• Se divide en salas o zonas:
– Preparación de reactivos: Esta sala debe tener una presión positiva, para evitar la entrada
de cualquier contaminante y disponer de una cabina de bioseguridad.
– Extracción y purificación de ADN de una muestra biológica: ligera presión negativa, para
evitar que pueda escaparse material contaminante. Debe contar con una cabina de
bioseguridad y un espectrofotómetro.
– Reacción de amplificación propiamente dicha: Ligera presión negativa. Termocicladores,
necesarios para llevar a cabo la PCR.
– Análisis de los productos: Ligera presión negativa. Están los equipos de electroforesis y de
documentación de geles.
 Zona Zona
“sucia” “limpia”
Equipamiento de laboratorio: actividad

Equipo Tipo (Especifico/genérico) Función Lugar (preparación,

extracción, PCR, análisis,
todas)
Pipetas Genérico Extracción y deposición Todas
de líquidos
Condiciones de trabajo y seguridad

• Normas y restricciones de buenas

prácticas genéricas, como la prohibición
de comer, beber, fumar, maquillarse, etc.
• Normas para la manipulación de
materiales y reactivos en condiciones de
esterilidad para evitar la contaminación.
 Condiciones de trabajo y seguridad

• Contaminación de muestras
– Introducción accidental en la muestra de
material exógeno.
– Los dos tipos de contaminantes más
peligrosos son:
• a) Los ácidos nucleicos extraños a la muestra.
• b) Las enzimas no deseadas que degradan
ácidos nucleicos (nucleasas).
 Condiciones de trabajo y seguridad

• Las fuentes de contaminación :

– A) Contaminación cruzada por:
• Material del medio ambiente o microorganismos
ambientales.
• Contaminantes procedentes del personal técnico de
laboratorio.
• Contaminantes de las superficies de trabajo.
– B) Carryover: contaminación por productos amplificados
mediante PCR en el propio laboratorio.
– C) Contaminación de los reactivos y del material fungible.
Condiciones de trabajo y seguridad

• Normas para la manipulación de reactivos y materiales.

• Cuando se identifica una fuente de contaminación, hay que prevenirlas y
anularlas.
– La contaminación de las nucleasas se puede evitar utilizando materiales
certificados como libres de nucleasas.
– La contaminación de los reactivos por ADN no se puede controlar, por lo que es
necesario realizar controles negativos en las técnicas.
• Aunque la condición de trabajo más importante para prevenir la
contaminación es el uso de buenos hábitos de trabajo en condiciones de
asepsia.
Condiciones de trabajo y seguridad

• Técnica aséptica
– a) Lavado de manos
– b) Uso de equipos de protección individual (EPI): los básicos
son guantes sin talco y batas.
– c) Descontaminación de superficies
– d) Prevención de contaminación ambiental: obligatorio el
uso de cabinas de bioseguridad de clase II, y puntas de
micropipeta especiales.
• Puntas de desplazamiento positivo:
• Puntas con filtro:
– e) Prevención de carryover: La norma principal para evitar el
carryover es no pasar nunca muestras desde las áreas de
PCR o post-PCR a las zonas de preparación de muestras y
purificación de ácidos nucleicos (pre-PCR).
Uso eficiente de recursos

• Certificado por el cumplimiento de la norma de calidad ISO vigente.

• Equipamiento e infraestructuras. Se debe realizar revisiones periódicas,
incluyendo la limpieza y calibraciones de los equipos.
• Gestión medioambiental: reducir el consumo de energía y materiales ya
sean reciclables o no.
• Recursos humanos. Se debe diseñar un plan formativo continuado.
• Reactivos. Controlar la trazabilidad de los reactivos, registros de entrada,
control de lotes, caducidades y un almacenamiento correcto.
• Técnicas. Todas las técnicas deben estar estandarizadas.
Laboratorio de Citogenética

• Es una ampliación especializada del laboratorio de cultivos celulares con:

– A) un área de cultivo celular enfocada a la obtención de células en mitosis.
– B) un área de genética enfocada al estudio de los cromosomas metafásicos.
– https://wordwall.net/es/resource/30912452/3er-corte-biologia-celular-y-molecular
– https://mobbyt.com/videojuego/educativo/?Id=286307
Ciclo celular: división celular
 Laboratorio de Citogenética

• Cabina de flujo laminar.

– Garantiza un ambiente de trabajo estéril y libre de
contaminación mediante un flujo de aire continuo y
el uso de filtros HEPA (<0,2 µm)
– Partes:
• Panel y rejilla frontal
• Sistema mecánico de flujo de aire
• Filtro HEPA de gran superficie
• Segundo filtro HEPA
Laboratorio de Citogenética

• Incubador de CO2: proporciona las

condiciones optimas para el
crecimiento celular (eucariotas)
– Control de temperatura
– Circuito de recirculación del aire
– Control de CO2
– Control de humedad
• Incubador roller
Laboratorio de Citogenética

• Microscopio invertido:
Microsocpio con la luz encima
de la pletina y el revolver
debajo para poder observar
los frascos de cultivo.
– Sistema de contraste de fases
para poder ver las células en
crecimiento.
Laboratorio de Citogenética

• Equipo de criogenia:
Conservación de muestras y
de líneas celulares
– Tanque o depósito de nitrógeno
líquido
– Imprescindible en los
laboratorios de cultivos celulares
pero optativo en los de
citogenética.
Laboratorio de Citogenética

• Un equipo de análisis de
imagen: documentar y
analizar metafases y
cariotipos
– Microscopio óptico
– Cámara digital
– Software especifico
• Imprescindible en
citogenética
Laboratorio de Citogenética

• Un microscopio óptico y de
fluorescencia: Recuentos celulares,
estudios de viabilidad, etc
– Debería ser distinto del microscopio de
análisis de imagen
Laboratorio de Citogenética

• Equipamiento común.
– Un sistema de filtración con filtros de 0,22 μm para esterilizar soluciones.
– Autoclave: equipo de esterilización para todo el material y los reactivos que
estén en contacto con los cultivos.
– Nevera y congeladores de –20ºc y –80ºc.
– Un sistema de purificación de agua
– Centrífugas, placa calefactora, Ph metro, balanza, agitador magnético,
pipeteador, etc.
Estructura del laboratorio

• Sala de laboratorio convencional: sala "sucia", con el equipamiento, excepto el

equipo de criogenia, en esta sala se van a realizar todas las técnicas que no
están relacionados con el cultivo celular, esta área puede tener una zona oscura
para el microscopio de fluorescencia
• Sala de cultivos: sala "limpia", en la que se van a realizar todas las técnicas
relacionadas con el cultivo celular, lo ideal es que tenga un sistema de aire
filtrado y una ligera presión positiva, aquí se disponen las cabinas de flujo
laminar, los incubadores y el microscopio invertido.
• Sala de frío: Con los congeladores y el equipo de criogenia, debe estar
separada de la sala de cultivos.
Trabajo en el laboratorio
• Técnica aséptica:
– 1.Lavado frecuente de manos.
– 2. Uso de guantes y batas desechables
estériles.
– 3. La puerta de la sala siempre debe estar
cerrada.
– 4. Uso exclusivo de material y reactivos
estériles.
– 5. No introducir mecheros bunsen en las
cabinas, generan turbulencias que alteran el
flujo laminar.
– 6. Colocar en el interior de la cabina solo el
material que se vaya a utilizar en la sesión de
trabajo.
– 7. No sacar el material estéril de su embalaje
hasta su uso.
• 8. El material usado reutilizable de vidrio se introduce
en un recipiente con hipoclorito al 10% hasta finalizar
la sesión de trabajo.
• 9. El material fungible utilizado se deposita en
contenedores adecuados.
• 10. Nunca se deben recibir visitas en esta sala.
• 11. Limpieza de las cabinas de flujo laminar y de
superficies de trabajo con etanol al 70% al finalizar
cada sesión de trabajo.
• 12. En las cabinas dotadas de lámpara UV, esta se
conecta tras la limpieza un máximo de 30 minutos.
• 13. Realizar un mantenimiento programado de las
cabinas (mínimo anual) que incluya comprobación del
filtro HEPA.
Seguridad en los laboratorios

• La seguridad en los laboratorios de

citogenética, biología molecular y
cultivos celulares hace referencia a la
prevención de la exposición del
personal a agentes nocivos, así como
a impedir la liberación de estos al
medioambiente
• Tipos:
– Riesgo biológico
– Riesgo químico
– Gestión de residuos
Seguridad en los laboratorios

• Equipamiento de seguridad
– Instalaciones de emergencia bien
señalizadas.
– EPIs
– Instalaciones de almacenamiento
correctas
– Contenedores específicos de residuos
– Kits de recogida de derrames químicos y
citotóxicos
– Manual de seguridad (evaluación de
riesgos, normas especificas y de
emergencia)
– Plan de gestión de residuos
Riesgo biológico

• Cualquier muestra biológica

debe considerarse como
potencialmente peligrosa.
• Clasificación (RD 178/2004):
– Tipo I: Riesgo nulo o
insignificante.
– Tipo II: Riesgo bajo.
– Tipo III: Riesgo moderado.
– Tipo IV: Riesgo alto.
Clasificación general
• https://youtu.be/ife4c-5qwwe
• https://youtu.be/3ivqz9ggak4
• https://youtu.be/mex_u52qcme
• https://youtu.be/xnnohymkuae
Riesgo químico

• RD 363/1995: Etiquetado, envasado

y clasificación de sustancias químicas
peligrosas
– 15 tipos de sustancias químicas
peligrosas
• Prevenir la exposición pro contacto,
inhalación o ingestión
• Almacenar correctamente
• Gestionar residuos peligrosos
• https://youtu.be/9nCSoa9qAwM
• Ficha de datos de seguridad: la debe
traer cada producto
Riesgo químico

• Inflamables: alcoholes (etanol,

isopropanol, metanol, etc)
• Tóxicos y muy tóxicos : Acrilamida,
azida sódica, bromuro de etidio, DAB
(diaminobencidina), etc
• Carcinógenos: Acrilamida, DAB,
formaldehido, etc
• Mútagenos: acrilamida, bromuro de
etidio, etc
• Teratógenos y/o perjudiciales para
la fertilidad: Acrilamida, formamida,
tetrametil urea
Gestión de residuos

• Plan de gestión de residuos tóxico y peligrosos: medidas de recogida, clasificación y

almacenamiento temporal.
• Residuos biosanitarios especiales: material funjible en contacto con productos biológicos,
restos de cultivos celulares y grandes cantidades de líquidos biológicos.
• Residuos químicos: envases, productos caducados o innecesarios y material contaminado.
• Residuos citotóxicos: productos carcinógenos, múgatenos y teratógenos y material
contaminado.
• Residuos radiactivos.
Gestión de residuos

• Contenedores:
• Homologados, etiquetados y diferenciados por colores, cierre hermético y no
sobrepasar 2/3 de capacidad
Gestión de residuos
• Derrames!!!
– Restringir el acceso al laboratorio
– Uso de EPIs especiales
– Neutralizar: si se puede.
– Absorber: serrín, carbón activo, absorbente/neutralizantes
comerciales…
– Eliminar: recoger y depositar en el contenedor.
• El polvo se recoge directamente con cuidado.
• Los productos volátiles tóxicos deben eliminarse
rápidamente o utilizar una cabina de aspiración de gases.
• Cuidado con productos volátiles e inflamables!!
Gestión de residuos: ejercicio
• ¿A qué categoría pertenece? ¿A que contenedor va?
– Geles de poliacrilamida
– Envase de dATP marcado con 32P
– Hoja de bisturí utilizada para trocear un tejido
– Placas de cultivo con crecimiento bacteriano
– Geles de agarosa con bromuro de etidio
– Envase vacío de hidróxido sódico
– Frasco con cultivo celular contaminado por bacterias
– Filtro de carbón activo de cabina de extracción de gases
– Envase con restos de bromuro de etidio caducado
– Cubreobjetos de cristal usados en recuento de células
– Filtro de nitrocelulosa de un Southern blot
– Envase vació de tetrametil-urea
– Envase de carbón activado utilizado para absorber un derrame
químico