UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS INFORME DE

Facultad de Ciencias básicas e ingenierías LABORATORIO

Departamento de Biología y Química BIOQUÍMICA

PRÁCTICA #2 AMINOÁCIDOS: CURVAS DE TITULACIÓN Y

SEPARACIÓN POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
Miguel Ángel Rivera Neira - Ingeniería ambiental -Grupo 1

Valentina Wilches Ávila - Ingeniería ambiental - Grupo 1

Yudy Alejandra Solano López - Ingeniería ambiental - Grupo 1

Docente: Lissette Johana Hernández Arrieta

Facultad de Ciencias Básicas e Ingenierías.

Programa

Resumen

En el presente informe se tiene como objetivo Comprobar el carácter anfotérico de los aminoácidos y determinar
mediante curvas de titulación, hallar el punto isoeléctrico de los aminoácidos y separar e identificar una mezcla de
aminoácidos por cromatografía en capa fina. Donde se hará uso de reactivos y algunos equipos para el montaje,
dentro de los procedimientos está la separación por cromatografía, separación de cromatografía de aminoácidos,
titulación de un aminoácido, tabulación de datos experimentales y sus respectivas gráficas posteriormente se
aplicará el cálculo del factor de retención.

Palabras clave: Aminoácidos, Curva de titulación, isoeléctrico, cromatografía.

1. Introducción

Como su nombre lo implica, los aminoácidos son
moléculas orgánicas que contienen un grupo amino
(NH2) en uno de los extremos de la molécula y un
grupo ácido carboxílico (COOH) en el otro
extremo. Los aminoácidos son las unidades que
forman a las proteínas, sin embargo tanto estos
como sus derivados participan en funciones
celulares tan diversas como la transmisión nerviosa
y la biosíntesis de porfirinas, purinas, pirimidinas y
urea. Los polímeros cortos de aminoácidos
(péptidos) tienen funciones importantes en el
sistema neuroendocrino como hormonas, factores
que liberan hormonas, neuromoduladores y
neurotransmisores. La estructura general que
representa a todos los aminoácidos se puede
representar de la siguiente manera:
 Aminoácidos: Curvas de titulación y separación por cromatografía en capa
fina

Objetivos.
convecci
ón
forzada
● Comprobar el carácter anfotérico de los Pera de Succión Soluciones de
aminoácidos y determinar mediante Aminoácidos en agua
curvas de titulación,los valores de pK de 2%
los grupos ionizables
Bureta graduada Mezcla de Solventes:n-
● Hallar el punto isoeléctrico de los
de 25mL butanil,á cido acético y
aminoácidos. agua
● Separar e identificar una mezcla de
aminoácidos por cromatografía en capa Pinza Para Bureta Reactivo de
ninhidrina:disolver
fina.
0.2 g en 100 mL de
acetona
1. Materiales y reactivos Soporte Universal

Durante la práctica de laboratorio se utilizaron los Agitador

siguientes materiales, equipos y reactivos: Magnético

Frasco de lavado
Tabla 01. Equipos, materiales y reactivos utilizados.
Probeta graduada
de 25mL
Equipos Materiales Reactivos Cámara
Cromatográfica
Plancha Vasos de HCl0,2N (valorado)
de precipitados de Placas
agitación 100mL (2) Cromatografía
Vaso de Soluciones De Capilares
Potenció precipitado de Aminoácidos en agua
metro 250mL 01M

Horno de Pipeta graduada Sílica gel-60

la de 25mL
 2. Marco teórico
Estructura de los aminoácidos
Los 20 aminoácidos estándar que forman las
proteínas son L-aminoácido (de acuerdo a su
estereoquímica, por convención, el grupo amino se
encuentra representado a la izquierda de ahí la letra
L) y la ɑ aminoácidos donde su estructura común
está caracterizada por la presencia de un grupo
amino, un grupo carboxilo y un hidrógeno unidos
sobre el mismo átomo de carbono, llamado carbono
ɑ. A su vez, los 20 aminoácidos se diferencian por
la naturaleza del cuarto constituyente, llamado en
general grupo R (Fig. 1), las propiedades de cada
aminoácido dependerán de la naturaleza química de
cada grupo R (Aguilera, 2017).
Figura 1. Estructura general de los aminoácidos
Puesto que los aminoácidos poseen un grupo amino
y uno carboxilo (pueden comportarse como una
base o como un ácido), deben reaccionar con ácidos
y bases. Dichos compuestos se conocen como
sustancias anfotéricas.En soluciones de pH neutro
los aminoácidos existen como zwitteriones (iones
doblemente cargados) en los que el grupo carboxilo
está disociado y el grupo amino protonado. El
zwitterion pueden actuar como ácido (donador de
protones):
O como una base (aceptor de protones):
Los aminoácidos tienen curvas de titulación
características, a partir de las cuales se pueden
obtener los valores de pK de cada uno de los grupos
ionizables. El comportamiento anfótero de cada uno
de los aminoácidos y sus valores de punto
isoeléctrico son una consecuencia de su estructura
particular, ya que los grupos ionizables de la cadena
lateral R también contribuyen a la carga. Eso se
reflejaría en la curva de titulación (Aguilera, 2017).
Separación por cromatografía en capa fina
La cromatografía es una de las técnicas más útiles
para la separación de compuestos que presentan
propiedades químicas estrechamente relacionadas.
La separación se lleva a cabo por la diferencia en la
interacción entre los componentes de una mezcla y
dos fases inmiscibles: la fase estacionaria y la fase
móvil.
La fase estacionaria es un medio poroso, como la
sílica gel o alúmina, a través de la cual la mezcla
migra bajo la influencia del movimiento de un
disolvente (fase móvil) (Aguilera, 2017).
La cromatografía en capa fina (o thinlay
chromatography – TLC) es una técnica utilizada
para separar e identificar compuestos de interés en
una mezcla. En esta técnica se utiliza una placa
recubierta de una capa fina de sílica adherida a una
lámina de vidrio o aluminio, la sílica actúa como
 Aminoácidos: Curvas de titulación y separación por cromatografía en capa
fina
fase estacionaria y una mezcla de solventes fase
móvil (Fig 2).
Figura 2. Ejemplo general de un corrida cromatográfica
Para realizar una corrida cromatográfica utilizando
una técnica primero se debe sembrar la muestra a
analizar en una línea de base. Luego, la placa es
puesta en una cámara cromatográfica y el solvente
empezará a ascender por capilaridad. La cámara
debe estar cerrada para que esté saturada con el
solvente. A medida que el solvente avanza de la
mezcla se separa en sus componentes, avanzado con
mayor grado aquel componente de la mezcla que
presente menor interacción con la fase estacionaria.
Un criterio utilizado para comparar los
componentes desconocidos de una mezcla y
patrones conocidos es el factor de retención (Rf), el
cual es una relación aritmética entre la distancia que
recorrió uno de los componentes de la mezcla y la
distancia que avanzó la fase móvil (Aguilera, 2017).
Separación cromatografía de aminoácidos
La interacción de los aminoácidos con la fase
estacionaria, como la sílica, varía en función del
grupo –R. Por ejemplo, un aminoácido que
interactúe fuertemente con la sílica, luego de
efectuar la corrida cromatográfica, recorrerá una
pequeña distancia con respecto al punto de siembra
de la muestra, mientras que el presente menos
interacción se moverá más. A su vez mediante el
uso de patrones es posible identificar los
componentes de una mezcla. Puesto que los
aminoácidos son compuestos no coloreados, la
ninhidrina es empleada para detectarlos (Aguilera,
2017).
3. Sección experimental
5.1.1 Aspectos generales a considerar
En esta práctica se realizó la práctica la titulación de
dos aminoácidos, para ello se compararo un
aminoácido neutro con uno ácido o vaso. Para
obtener la curva completa de valoración fue
necesario utilizar un ácido titulante (HCl 0.2 M) y
una base (NaOH 0.2 M). A partir de la curva de
titulación se determinaron los valores pK de cada
uno de los grupos ionizables, así como las zonas
tampón, punto isoeléctrico y la posible importancia
fisiológica de estos equilibrios.
Teniendo en cuenta que los pK de los grupos
funcionales de los aminoácidos se encuentran
localizados en distintos rangos de pH, fue necesario
realizar una titulación que abarque prácticamente
todo el rango pH (ácido y básico) para cada
aminoácido. Así, se empleó una solución de HCl
0.2 M para los grupos ɑ- carboxilo, y una solución
de NaOH 0.2 M para los grupos ɑ- amino. Bajo este
esquema, se realizaron dos valoraciones por cada
solución de aminoácido, una con ácido y otra con
base.
Otra posibilidad fue ajustar el pH de solución inicial
a valores muy ácidos o muy básicos, y titulando con
un solo agente; el problema de esta segunda
aproximación radicó en la dilución de la muestra
tras sucesivas adiciones de ácido o base fuerte.
Dado lo anterior en esta práctica se realizó la
primera opción.
5.1.2 Protocolo de trabajo
1. Se calibró el potenciómetro según las
instrucciones del equipo.
2. En un vaso de precipitados de 100 mL se colocó
50 mL de la solución del aminoácido (0,1 M) y se
inició la agitación, se observó el pH inicial y se
registró.
3. Usando una bureta se agregó HCl 0,2 M,
adicionando cada vez 1 mL y determinando el pH
después de cada adicción. Se continuó agregando
ácido hasta pH 1,5 aproximadamente. Registrando
los valores de pH y de ácido adicionados (mL).
4. Lavando el electrodo con agua destilada y se
tituló de la misma manera otros 50 mL de la
solución del mismo aminoácido donde se agregó
esta vez hidróxido de sodio 0,2 M, hasta pH 12,5.
Tabulación de los datos experimentales. En una
tabla se registró los siguientes datos: volumen de
ácido o base adicionado y el pH medido después de
cada adición.
Representaciones gráficas. En una gráfica, se
incluye el V ácido/base adicionado vs. pH para cada
valoración realizada. En el eje de abscisas se
representa la cantidad de agente titulado añadido y
en el eje de ordenadas, el pH obtenido. Luego de
realizada cada curva de cada titulación para el
mismo aminoácido se entregó una única curva de
titulación para cada aminoácido.
5.2. Separación cromatografía de aminoácidos
5.2.1 Preparación de la cromatografía
1. Se adiciona la mezcla de solventes en una cámara
para cromatografía y cerrándola (se adiciono un
volumen suficiente para que la altura del líquido
fuera alrededor de 0,5 cm).
2. La cámara estuvo sin perturbaciones por
aproximadamente 20 min, esto permite saturar la
atmósfera dentro de la cámara con el solvente.
3. Se tomó la placa (siempre teniendo cuidado de
no tocar la sílica, sujetando la placa por los lados).
CON UN LÁPIZ se trazó cuidadosamente una línea
recta a través de lo ancho de la placa
aproximadamente 1,5 cm del borde inferior. Esta
línea se denominó línea de base.
4. Usando capilares diferentes para cada muestra de
aminoácidos, se colocó diminutas gotas (siembra)
sobre la línea base, para ello se tocó suave y
perpendicularmente la placa con la punta del
capilar.
5. Permitiendo secar la siembra.
6. Sembrando el segundo aminoácido sobre la línea
de la base de la placa, donde se procuró dejar por lo
menos un espacio aproximado de 1,0 cm entre
muestra y muestra y alrededor de no menos de 0,5
cm antes de los bordes de la placa.
7. Repitiendo los anteriores pasos para la siembra
del aminoácido desconocido.
8. Se escribió una marca en la placa que permitió
identificar el orden de siembra y se registró dicho
orden
directamente en el cuaderno.
9. Las muestras a sembrar fueron:
a. Un aminoácido polar.
b. Un aminoácido con polaridad intermedia.
c. Un aminoácido apolar.
d. Una mezcla de aminoácidos desconocida.
5.2.2. Desarrollo de la cromatografía
1. Se pone la placa en la cámara e inclínandola
contra la pared interna del frasco
2. Cerrando la cámara. No se perturbó el sistema
mientras ascendía el solvente.
3. Se retiró la placa observando que el líquido
estaba cerca del borde superior (alrededor de 1 cm
del final de la placa).
4. Se marcó rápidamente con un lápiz la línea final
que alcanzó el líquido después del ascenso.
5. Se dejó de secar la placa a temperatura ambiente.
6. Atomizando la placa con la solución de
ninhidrina.
7. Se calento la placa en el horno a 105°C por 5
min (la ninhidrina reacciono con los aminoácidos
sembrados volviéndolos como manchas de color
purpura).
Figura 3. (Montaje experimental).
 Aminoácidos: Curvas de titulación y separación por cromatografía en capa
fina

4. Resultados y análisis
19 1,99
En la práctica de laboratorio se obtuvieron los 20 1,95
siguientes resultados:
21 1,88
● Titulación de la Leucina
22 1,84
El ph de la leucina antes de aplicar el HCl es de 8,4.
23 1,78

24 1,73
Tabla 02. Titulación de la Leucina en HCl 25 1,69

26 1,64
Volumen del HCl pH
27 1,60
1 7,8
28 1,56
2 3,96
29 1,53
3 3,47
29,5 1,5
4 3,26

5 3,08

6 2,94

7 2,83

8 2,74

9 2,65

10 2,56

11 2,49

12 2,42

13 2,35
Gráfica 1. Relación entre el volumen añadido de
14 2,29
HCl y el pH obtenido para la Leucina.
15 2,23
En la Tabla 02, se puede observar el
16 2,17 comportamiento de la Leucina al agregar HCl, en
un primer momento tenemos que el Ph del
17 2,1 aminoácido pasa de estar de 8,4 a 7,8 con solo un
mL, después de este momento se observa que los
18 2,05
siguientes mL del ácido adicionado mo muestra una
variación muy significativa, lo que indica que el aa
Leucina se comporta como una disolución
 amortiguadora resistiendo a la adicion de acidos y
bases como se muestra en la Tabla 02 y 03. 22 10,81

Tabla 03. Titulación de la Leucina en NaOH 23 10,97

24 11,17
Volumen pH
del 25 11,39
NaOH
26 11,63
1 8,68
27 11,84
2 8,90 28 11,98
3 9,06 29 12,08
4 9,18 30 12,17
5 9,29
31 12,24
6 9,39 32 12,30
7 9,49 33 12,35
8 9,59 34 12,39
9 9,66 35 12,42
10 9,73 36 12,45
11 9,82 37 12,5
12 9,90

13 9,97

14 10,05

15 10,12

16 10,20

17 10,28

18 10,36

19 10,46

20 10,56

21 10,67 Gráfica 2. Relación entre el volumen añadido de

NaOH y el pH obtenido para la Leucina.
 Aminoácidos: Curvas de titulación y separación por cromatografía en capa
fina

Placa #1

Metionina

Rf= 2,35,5=0.4
Figura 4. Esquema de las formas ionizables de la
Leucina.

Alanina
Por teoría sabemos que la Leucina tiene un pK1=
2,36 y un pK2= 9,60 . Teniendo estos valores Rf = 2,2
5,5
=0.4
podemos determinar el valor del punto Isoeléctrico,
el cual se obtiene reemplazando en la ecuación 1

𝑝𝐾1 + 𝑝𝐾2
PI = (1) Placa #2
2
2,36 + 9,60 Muestra problema
PI=
2 Rf= 1,65=0.32
PI= 5,98

● Separación cromatografía de Prolina

aminoácidos
Rf= 1,35=0.26

Cuestionario

1. ¿Cuál es la utilidad del punto isoeléctrico

en la separación de aminoácidos?

Todas las macromoléculas de la naturaleza

adquieren una carga cuando se dispersan en agua.
Una característica de las proteínas y otros
biopolímeros es que la carga total que adquieren
dependen del pH del medio (Miguel, 2011).

Así, todas las proteínas tienen una carga neta

dependiendo del pH del medio en el que se
encuentren y de los aminoácidos que la componen,
así como de las cargas de cualquier ligando que se
encuentre unido a la proteína de forma covalente (
irreversible).
Debido a la descomposición en aminoácidos de la
proteína, los radicales libres pueden existir en tres
formas dependiendo del pH del medio: catiónicos,
neutros y aniónicos (Miguel, 2011).
Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si
se encuentra en un medio lo suficientemente ácido
debido a que los grupos COOH de los aminoácidos
aspártico y glutámico estarían en su forma neutra
pero los grupos amino de Arginina y lisina estarian
protonados (-NH3+) (Miguel, 2011).
● La cromatografía es una herramienta que
requiere cuidado pero es de vital importancia
para poder llevar a cabo la identificación de
aminoácidos.
● El punto isoeléctrico de la metionina y la
alanina son iguales, mientras que la prolina
marca una diferencia importante.
● Se comprueba el carácter anfotérico de los
aminoácidos, exponiendo que estos tienen la
capacidad de reaccionar como un ácido o como
una base dependiendo de las situaciones o
sustancias que se pongan bajo estudio.

De igual forma si la proteína se encuentra en un 8. Referencias.

medio con un pH muy alto estaría cargada
negativamente ya que en este caso los grupos
carboxilo estarian desprotonados (COO-) y los Aguilera, D. (2017). AMINOÁCIDOS: CURVAS
grupos amino estarían en su forma neutra (NH2).
DE TITULACIÓN Y SEPARACIÓN POR
De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un
pH característico al cual su carga es cero. A este pH CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.
se le denomina punto isoeléctrico (pI).
Miguel, V. (2011, November 11). Clase3 tema
En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el
equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que 2 2011-v_miguel. Slideshare. Retrieved
la proteína presenta su máxima posibilidad para ser
precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su November 16, 2022, from
agregación (Miguel, 2011).
https://es.slideshare.net/vcmiguel/clase3-tema
Si suponemos una proteína formada únicamente por
aminoácidos sin grupos laterales ionizables la carga 2-2011vmiguel
neta de la proteína dependeria exclusivamente de la
protonación/ desprotonación de los grupos amino y
carboxilo terminal. En la realidad las proteínas están
formadas por multitud de aminoácidos unidos
mediante enlaces peptídicos y la carga va a
depender de los grupos ionizables que poseen los
aminoácidos que la componen y del pH del medio
(Miguel, 2011).

6 Conclusiones

● En la muestra en la sílica gel se logra observar

la separar e identificar los aminoácidos
presentes, esto se ve en la cromatografía.
 Aminoácidos: Curvas de titulación y separación por cromatografía en capa
fina

9 Anexos

Anexo 1. Titulación de la leucina

Anexo 2. Desarrollo de la cartografía